Name: a fluorescence-based lymphocyte assay suitable for high-throughput screening of small molecules
Uploaded: 2017-03-10T14:00:00
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Diese Arbeit wurde von der Merck Frosst Startkapital zur Verfügung gestellt von der Université de Montréal unterstützt. Wir möchten Drs Jean Duchaine und Dominic Salois aus der Hochdurchsatzplattform am Institut für Forschung in der Immunologie und Krebs für ihre Diskussion, Kommentare und Feedbacks zu danken. Moutih Rafei hält einen Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior 1 Auszeichnung.

Alle Tier Protokolle wurden von der Animal Care Committee der Université de Montréal genehmigt. Die Mäuse wurden durch allmähliche Einatmen von CO 2 , bis keine Vital eingeschläfert wurden durch Genickbruch folgte beobachtet. Das Verfahren wurde von einem zertifizierten Person durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Tiere auf humane Weise eingeschläfert wurden und entsprechend den Empfehlungen des Canadian Council on Animal Care. 1. Herstellung von Splenozyten-Medium und D...

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Mehrere Ausleseverfahren wurden für die Entwicklung von empfindlichen und zuverlässigen HTS-Assays genutzt werden. Dazu gehören kolorimetrischen, lumineszente oder Fluoreszenzmethoden. Obwohl farbmetrischen Methoden einfach einzurichten sind, benötigen sie mehrere Zugaben von Chemikalien, die getestet stören oder unterbrechen können wobei die Zellen. 23 Darüber hinaus sind sie erlauben keine dynamische Bewertung einer biologischen Reaktion , wie die pharmakologische Wirkung zu einem bestim...

Hochdurchsatz-Screening (HTS) ist eine bewährte Strategie weithin für die Identifizierung neuer therapeutischer Moleküle oder für die Neupositionierung von FDA-zugelassenen Medikamente in neuen medizinischen Indikationen angenommen. 1 Bisher kann die erzielte HTS Erfolg durch die Fülle der bisher entdeckten Drogen gemessen werden. Zum Beispiel verwendet der Tyrosinkinaseinhibitor lapatinib für die Behandlung von Brustkrebs, sitagliptin; ein Dipeptidyl-Peptidase-4 (DPP-4) Inhibitors als antihyperglykämischen Medikament, und die orale Bcr-Abl-Tyrosinkinase-Inhibitor dasatinib für die Behandlung von chronischer myeloischer Leukämie stellen einige Beispiele für eine lange Liste von zugelassenen Medikamente ursprünglich entdeckt, verwendet durch HTS. 2 Obwohl die Produktivität der pharmazeutischen Industrie in letzter Zeit von einem Mangel in der Entdeckung neuer chemischer Einheiten erlitten hat, kann die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Wirkstoffforschung durch eine Erhöhung der Anzahl der vorklinischen Candida verbessert werdentes Anzeige modulierende biologische / biochemische Eigenschaften. Dementsprechend könnte die Entwicklung von neuen HTS-Assays zur phänotypischen Screening angepasst bieten das Potential wichtige pharmakologische Werkzeuge zur Entdeckung neuer Medikamente Treffern zu liefern. 3, 4, 5, 6 Darüber hinaus HTS kann nun in einem schnelleren Tempo durchgeführt werden aufgrund erheblichen technologischen Veränderungen in den letzten Jahren mit speziell entwickelten flexiblen Roboterinstallationen, neue Auslesetechnologien und umfassende Miniaturisierung. 2, 7 Unter den Faktoren , die zu dem wachsenden Interesse an der Verwendung von phänotypischen Screening (auch bekannt als Vorwärts-Pharmakologie) ist die Wahrnehmung beitragen , dass eher als vereinfachend reduktionistischen Annahmen über funktionale Effekte konzentriert in Bezug auf molekulare Targets (Zielbasierte Screening / biochemische Reaktionen) wahrscheinlicher ist , zu sho<html> w klinische Wirksamkeit. Somit hält phänotypischen Screening versprechen neue potentiell therapeutischen Verbindungen und molekularen Mechanismen von derzeit unheilbar Krankheiten aufzudecken. 2 Um richtig Inhibitoren oder Aktivatoren für eine gegebene molekulare Ziel oder die Zellfunktion zu identifizieren, ein hoch empfindlicher und zuverlässiger Assay erforderlich ist, um zwischen bona fide - Hits und Fehlalarme zu unterscheiden. Also, was macht einen guten Test? Die Qualität eines gegebenen Assay müssen zunächst durch das Signal-zu-Rausch-Verhältnis beurteilt werden (durch einen Z-Faktor reflektiert). 8 Zweitens ist die gezielte Wirkung oder das Ziel des Bildschirms sollte eindeutig festgelegt. Zum Beispiel, funktionale zellbasierte Ansätze können erhebliche Vorteile für die Rezeptor-Screening bieten als die Bindung an einen Assay spezifisch zu beurteilen Ligand-Rezeptor entworfen gegenüber. Der Grund dafür ist, dass der letztgenannte Ansatz nicht zwischen Agonisten- und Antagonisten-Liganden unterscheiden.ss = &quot;xref&quot;&gt; 9 Im Gegensatz dazu ist eine zellbasierte Ansatz ist wahrscheinlich (, Zellzyklusarrest, Apoptose und / oder Differenzierung Proliferation) zu sein , kann effektiver als Rezeptor - Funktion direkt in einem biologischen Phänotyp beurteilt werden. Es muss jedoch beachtet werden, daß biochemische Assays wesentliche Vorteile gegenüber phänotypischen Assays stellen können, da sie auf einem spezifischen intrazellulären Ziel verletzen. Eine gut optimierte biochemische Assays haben in der Regel weniger Datenstreuung als eine phänotypische Screening während danach Untersuchungen zum Drogen molekularen Wirkmechanismus der im Zusammenhang zu vereinfachen. Jedoch ist der Hauptnachteil der zielbasierten oder biochemischen Assays die Wahrscheinlichkeit, die Rate falsch positiver Treffer Amplifizieren die unspezifischen Targets beeinflussen können, wenn sie in einem biologischen System (Verlust der Spezifität ursprünglich untersucht in der biochemischen Assay) getestet. 10 Obwohl ein gut etabliertes Grenzpunkt zwischen negativen und positiven Treffer können die Anzahl der Fehlalarme zu minimieren in die primäre Screening, die Verwendung eines physiologisch relevanten System die nativen zellulären Umgebung wie intakte Zellen, Gewebe oder ganzen ganze Tier nachahmt bleibt der Kern des Assaydesigns Pendels. Daher ermöglicht phänotypischen Screening Leitstruktursuche mit wünschenswerten biologischen / phänotypischen Wirkungen für Krankheiten, bei denen keine Angriffspunkte für Medikamente ohne vorherige Kenntnis der Verbindung der Aktivität oder Wirkungsweise aufweist. 11 Die hierin Studie bezieht sich auf die Entwicklung und Erprobung eines optimierten und reproduzierbaren Screening phänotypische basiert auf zwei wichtigen Komponenten: eine handelsübliche Maus-Modell und einem gruppierten Unterfamilie von chemischen Verbindungen. In Bezug auf das Tiermodell beruht der Test auf der Verwendung von Lymphozyten aus einer Maus - Stamm abgeleitet (Nur77 GFP) ein bakterielles künstliches Chromosom beherbergt eine Kassette enthält , in dem die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) von th angetrieben wirde Nur77-Promotor. 12 Das Kennzeichen dieser Stimulation basiert auf der Tatsache , dass Nur77 ein immediate early Gens hochreguliert folgenden T-Zell - Rezeptor (TCR) oder B-Zell - Rezeptor (BCR) Stimulation. 12 Wie für das Screening - Verfahren selbst wurde ein Ansatz verwendet , um das Screening von trivialen Analoga zu helfen , zu vermeiden , während die Zeit eine große chemische Bibliothek zu beurteilen , zu minimieren benötigt (&gt; 10 5 Verbindungen). Dazu wählte eine Datenbank von chemischen Verbindungen, die durch medizinischen Chemikern virtuelles Screening-Tools wurde ausgebeutet zu identifizieren topologisch ähnliche Verbindungen bekannten aktiven Samenstrukturen als Referenzen. Dieser Ansatz erlaubt uns 4398 Verbindungen Einheiten vertreten, eine Gesamt Bibliothek von über 136.000 chemischen Bildschirm.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="725">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:211px;">Nur77GFP mice</td>
			<td style="width:157px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:135px;">Mouse strain No. 016617</td>
			<td style="width:224px;">An in house colony was established at our animal facility&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">96 wells-U culture plates, sterile</td>
			<td style="width:157px;">VWR International</td>
			<td style="width:135px;">10062-902</td>
			<td style="width:224px;">T-cell activation using the magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:211px;">70&#181;m cell strainer, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:135px;">352350</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:211px;">5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:135px;">352058</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:211px;">50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile</td>
			<td style="width:157px;">VWR International</td>
			<td style="width:135px;">89039-656&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:211px;">10 ml syringe without needle, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:135px;">305482</td>
			<td style="width:224px;">To mash the spleen</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">T-25 culture flask</td>
			<td style="width:157px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">690 175</td>
			<td style="width:224px;">To incudabte B cells during activation</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:211px;">5 ml cell culture dish, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">627 160</td>
			<td style="width:224px;">To mash the spleen</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">450-200-EL&#160;&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:211px;">RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">350-002-CL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:211px;">MEM non-essential amino acids</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">321-010-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">HEPES free acid 1 M</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">330-050-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Sodium pyruvate solution (100mM)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">600-110-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:211px;">Fetal Bovine Serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">080-910&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:224px;">Component of flow-cytometry buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">2-Mercaptoethanol (55mM)</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">21985-023</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:211px;">T- Cells isolation kit</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">19851</td>
			<td style="width:224px;">To isolate T cells</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:211px;">B- Cells isolation kit</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">19854</td>
			<td style="width:224px;">To isolate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">11452D</td>
			<td style="width:224px;">To activate T cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Cell isolation magnet</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">18000</td>
			<td style="width:224px;">To isolate T cells and remove the magnetic beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L)</td>
			<td style="width:157px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">115-006-068</td>
			<td style="width:224px;">To stimulate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Recombinant Murine IL-7</td>
			<td style="width:157px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">217-17&#160;</td>
			<td style="width:224px;">To support T-cell survival during activation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Recombinant CD40L</td>
			<td style="width:157px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">8230-CL/CF</td>
			<td style="width:224px;">To stimulate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Anti-mouse CD3 antibody</td>
			<td style="width:157px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">561799</td>
			<td style="width:224px;">To stain T cells for flow-cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Anti-mouse CD19 antibody</td>
			<td style="width:157px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">553786</td>
			<td style="width:224px;">To stain B cells for flow-cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:211px;">Biomed FXp</td>
			<td style="width:157px;">PerkinElmer Inc.</td>
			<td style="width:135px;">A31842</td>
			<td style="width:224px;">To re-suspend cells after 24 hours incubation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Opera Phenix High Content Screening System</td>
			<td style="width:157px;">PerkinElmer Inc.</td>
			<td style="width:135px;">HH14000000</td>
			<td style="width:224px;">To analyze GFP/Hoechst signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based lymphocyte assay suitable for high-throughput screening of small molecules

High-Throughput-Screening (HTS) ist derzeit die Hauptstütze für die Identifizierung chemischer Einheiten fähig biochemischer Reaktionen oder zellulärer Prozesse zu modulieren. Mit der Weiterentwicklung der Biotechnologien und der hohen translationale Potenzial von kleinen Molekülen, eine Reihe von innovativen Ansätzen in der Wirkstoffforschung entwickelt haben, die den wieder auflebenden Interesse an der Verwendung von HTS erklärt. Die Onkologie Bereich ist derzeit der aktivste Forschungsgebiet für Wirkstoff-Screening, ohne großen Durchbruch für die Identifizierung neuer immunmodulatorischer Verbindungen Targeting Transplantation Komplikationen im Zusammenhang mit oder Autoimmunerkrankungen gemacht. Hier stellen wir ein neues in vitro murine fluoreszenzbasierten Lymphozyten - Assay zur Identifizierung neuer immunmodulatorischen Verbindungen leicht angepasst. Dieser Assay verwendet T- oder B-Zellen von einer transgenen Maus abgeleitet ist, in dem der Promotor Nur77 GFP-Expression auf T- oder B-Zellen-Rezeptor-Stimulation steuert. Da die GFP Intensität spiegelt dieAktivierung / transkriptionale Aktivität der Zielzelle, unser Test definiert einen neuen Werkzeug, um die Wirkung der gegebenen Verbindung (en) auf die zelluläre / biologische Reaktionen zu untersuchen. Verwendung von 4.398 Verbindungen in Abwesenheit eines &quot;Zielhypothese&quot; wurde zum Beispiel ein primäres Screening durchgeführt, die auf die Identifizierung von 160 potentiellen Treffer anzeigt immunmodulatorischen Aktivitäten führte. Somit ist die Verwendung dieses Assays für die Wirkstoffforschung Programme Erforschung großer chemischer Bibliotheken vor geeignet , um in vitro / in - vivo - Validierungsstudien fördern.

Entwurf des HTS-Assay Zwei wichtige Faktoren wurden berücksichtigt, wenn die hierin Fluoreszenztest zu entwerfen. Zuerst mussten wir einen physiologischen Zustand zu replizieren , in der T- oder B - Zell - Aktivierung eine Krankheit (zB graft-versus-host disease) darstellen würde. Zweitens sollte die Beurteilung der zellulären Aktivierung durchgeführt werden, um eine empfindliche und quantitative Methode. Die Fluores...

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A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Wir präsentieren in der aktuellen Studie eine neuartige fluoreszenzbasierten Assays von einer transgenen Maus abgeleiteten Lymphozyten. Dieser Assay ist für Hochdurchsatz-Screening (HTS) von kleinen Molekülen dotiert mit einer Kapazität von entweder Hemmung oder Förderung der Lymphozytenaktivierung geeignet.

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, Invasion und Replikation in Makrophagen

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in<em&gt; Brucella</em&gt; Die Infektion von HeLa-Zellen

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

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Zellfreie biochemische fluorometrisch enzymatische Assays für Hochdurchsatz-Messung der Lipidperoxidation in High-Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

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