Name: a fluorescence-based lymphocyte assay suitable for high-throughput screening of small molecules
Uploaded: 2017-03-10T14:00:00
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이 작품은 몬트리올 대학교에서 제공하는 머크 Frosst 시동 기금에 의해 지원되었다. 우리는 그들의 토론, 의견과 피드백을위한 면역학 및 암 연구를위한 연구소의 높은 처리량 플랫폼에서 박사 진 Duchaine와 도미닉 Salois에게 감사의 말씀을 전합니다. Moutih Rafei는 퐁 드 라 공들인 엉 상테 뒤 퀘벡 주니어 1 상을 보유하고있다.

모든 동물 프로토콜은 몬트리올 대학교의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다. 마우스가 더 활력 징후는 자궁 경부 전위 다음에하지 관찰 될 때까지 CO 2의 점진적 흡입에 의해 안락사시켰다. 절차는 동물이 인도적인 방법으로 안락사와 동물 관리에 캐나다위원회의 권고에 따라되었는지 확인하기 위해 인증 된 사람에 의해 수행되었다. 비장 매체와 흐름 - 세포 계측법...

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여러 판독 방법은 민감하고 안정적인 HTS 분석의 개발에 이용되고있다. 이러한 색채, 발광 또는 형광 방법을 포함한다. 비색 방법은 설정이 간단하지만, 그들은 방해하거나 세포가 테스트되고 중단시킬 수있는 화학 물질의 다수의 추가가 필요합니다. 약리 효과는 특정 포인트에서 평가 된 바와 같이 (23) 또한, 이들은 생물학적 반응의 동적 평가를 허용하지 않는다. 자동화 된 HTS ?...

높은 처리량 스크리닝 (HTS)을 널리 새로운 치료 분자의 식별을 위해 또는 새로운 의료 적응증에 FDA 승인 약물의 재배치 채택 입증 된 전략이다. 하나는 지금까지 달성 HTS 성공은 이전에 발견 된 약물의 과다에 의해 측정 될 수있다. 예를 들어, 티로신 키나제 억제제 라파티닙 유방암, 시타 글 립틴의 치료에 사용; 디펩 티딜 펩 티다 제 -4 (DPP-4) 억제제 항 혈당 약물로 사용하고, 만성 골수성 백혈병의 치료에 사용되는 경구 체 Bcr-Abl의 티로신 키나제 억제제 프라이 셀은 원래 발견 승인 된 약물의 긴리스트의 몇 가지 예를 나타내는 HTS. 제약 업계의 생산성 최근 새로운 화학 실체의 발견의 부족으로 고생하고 있지만 2 성공적인 약물 발견 가능성은 전임상 칸디다 수의 증가를 통해 향상시킬 수있다조절 성 생물 / 생화학 적 특성을 표시 TES. 따라서, 표현형 선별하도록 새로운 HTS 분석법의 개발은 신약 히트 발견 중요한 약리학 적 도구를 제공 할 수있는 가능성을 제공 할 수있다. 3, 4, 5, 6 더욱이, HTS 해주기 때문에 주문 설계된가요 로봇 설비, 신규 한 판독 기술 광범위한 소형화 포함한 최근의 상당한 기술적 변형으로 빠른 속도로 수행 될 수있다. 표현형 검사 (일명 앞으로 약리학)의 사용에 대한 관심이 증가에 기여하는 요인 중 2, 7은 기능적인 효과보다는 분자 표적 (목표 기반 검사 / 생화학 반응)에 대해 과도하게 단순화 환원 가정에 집중하는 것이 더 가능성이 있다는 인식이다 SHO하기<html> w 임상 효능. 따라서, 표현형 검사는 새로운 잠재적 치료 화합물 및 현재 치료가 질병의 분자 경로를 발견 할 수있는 약속을 보유하고있다. 이 제대로 주어진 분자 대상 또는 세포 기능에 대한 억제제 또는 활성제를 확인하려면, 매우 민감하고 신뢰할 수있는 분석은 선의의 히트와 오탐 (false positive)을 구별하기 위해 필요합니다. 그럼, 좋은 분석한다? 주어진 분석의 질은 제 (a 인자 Z를 통해 반사 된) 신호 대 잡음비에 의해 판단되어야한다. 여덟 번째로, 타겟 효과 나 화면의 목적은 명확 확립되어야한다. 특이 적으로 결합하는 리간드 - 수용체를 평가하도록 설계된 분석 반대로 예를 들면, 기능성 세포 기반 접근법 수용체 스크리닝 상당한 이점을 제공 할 수있다. 그 이유는 후자의 방법은 작용제 및 길항제 리간드를 구별 할 수 없다는 것이다.SS = &quot;외부 참조&quot;대조적&gt; 9 세포 - 기반 접근법은 수용체 기능 직접 생물학적 표현형에서 평가 될 수있는 더욱 효과적인 것으로 보인다 (증식, 세포주기 억류, 아폽토시스 및 / 또는 분화). 그러나, 그들 특정 대상 세포 침해 생화학 분석법 표현형 분석에 비해 상당한 이점을 제공 할 수 있음에 유의해야한다. 이후 행동의 약물 분자 메커니즘에 관한 조사를 단순화 잘 최적화 된 생화학 적 분석은 일반적으로 표현형 검사보다 적은 데이터 분산을해야합니다. 그러나, 타겟 기반 또는 생화학 적 분석의 주요 단점은 생물학적 시스템 (원래 생화학 적 분석에서 연구 된 특이성을 손실)에서 시험 할 때 비특이적 목표에 영향을 미칠 수있는 거짓 양성 히트의 속도를 증폭의 가능성이다. (10) 음성 및 양성 사이에 히트 노포 컷오프 포인트 위양성의 수를 최소화 할 수 있지만 난N 차 스크리닝은 이러한 손상 세포, 조직 전체의 전부 또는 동물로 네이티브 셀룰러 환경을 흉내 낸 생리 관련 시스템의 사용은 분석의 디자인 진자의 코어 남아있다. 따라서, 표현형 검사는 화합물의 활동이나 행동의 모드에 대한 사전 지식없이 어떤 확인 된 약물 표적과 질병에 대한 바람직한 / 생물학적 표현형 효과를 리드 발견 할 수 있습니다. (11) 시판되는 마우스 모델, 화학적 화합물의 클러스터 서브 가족 : 본원의 연구는 두 가지 중요한 구성 요소를 기반으로 최적의 재현성 표현형 선별 개발 및 테스트에 관한 것이다. 동물 모델에 대하여, 상기 분석은 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현 번째로 구동되는 마우스 스트레인 (Nur77 GFP) 카세트를 함유하는 세균 인공 염색체를 보유하는 유래의 림프구의 사용에 의존전자 Nur77 프로모터. (12)이 자극의 특징은 Nur77는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 B 세포 수용체 (BCR) 자극 다음 상향 조절 즉각적인 초기 유전자라는 사실에 기초한다. 스크리닝 방법 자체로서 12 접근법은 큰 화학 라이브러리 (&gt; 105 화합물)를 평가하는 데 필요한 시간을 최소화하면서 사소한 동족체의 선별을 방지하는 데 도움이되었다. 이를 위해 가상 스크리닝 도구를 사용하여 의약 화학자에 의해 선택된 화학적 화합물의 데이터베이스를 참조로 알려진 활성 종 구조를 사용하여 토폴로지와 유사한 화합물을 식별하는 데 이용 하였다. 이러한 접근 방식은 우리가 136,000 이상의 화학 실체의 전체 라이브러리를 나타내는 4398 화합물을 스크리닝 할 수있었습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="725">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:211px;">Nur77GFP mice</td>
			<td style="width:157px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:135px;">Mouse strain No. 016617</td>
			<td style="width:224px;">An in house colony was established at our animal facility&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">96 wells-U culture plates, sterile</td>
			<td style="width:157px;">VWR International</td>
			<td style="width:135px;">10062-902</td>
			<td style="width:224px;">T-cell activation using the magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:211px;">70&#181;m cell strainer, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:135px;">352350</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:211px;">5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:135px;">352058</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:211px;">50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile</td>
			<td style="width:157px;">VWR International</td>
			<td style="width:135px;">89039-656&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:211px;">10 ml syringe without needle, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:135px;">305482</td>
			<td style="width:224px;">To mash the spleen</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">T-25 culture flask</td>
			<td style="width:157px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">690 175</td>
			<td style="width:224px;">To incudabte B cells during activation</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:211px;">5 ml cell culture dish, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">627 160</td>
			<td style="width:224px;">To mash the spleen</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">450-200-EL&#160;&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:211px;">RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">350-002-CL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:211px;">MEM non-essential amino acids</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">321-010-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">HEPES free acid 1 M</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">330-050-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Sodium pyruvate solution (100mM)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">600-110-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:211px;">Fetal Bovine Serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">080-910&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:224px;">Component of flow-cytometry buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">2-Mercaptoethanol (55mM)</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">21985-023</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:211px;">T- Cells isolation kit</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">19851</td>
			<td style="width:224px;">To isolate T cells</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:211px;">B- Cells isolation kit</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">19854</td>
			<td style="width:224px;">To isolate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">11452D</td>
			<td style="width:224px;">To activate T cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Cell isolation magnet</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">18000</td>
			<td style="width:224px;">To isolate T cells and remove the magnetic beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L)</td>
			<td style="width:157px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">115-006-068</td>
			<td style="width:224px;">To stimulate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Recombinant Murine IL-7</td>
			<td style="width:157px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">217-17&#160;</td>
			<td style="width:224px;">To support T-cell survival during activation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Recombinant CD40L</td>
			<td style="width:157px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">8230-CL/CF</td>
			<td style="width:224px;">To stimulate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Anti-mouse CD3 antibody</td>
			<td style="width:157px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">561799</td>
			<td style="width:224px;">To stain T cells for flow-cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Anti-mouse CD19 antibody</td>
			<td style="width:157px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">553786</td>
			<td style="width:224px;">To stain B cells for flow-cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:211px;">Biomed FXp</td>
			<td style="width:157px;">PerkinElmer Inc.</td>
			<td style="width:135px;">A31842</td>
			<td style="width:224px;">To re-suspend cells after 24 hours incubation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Opera Phenix High Content Screening System</td>
			<td style="width:157px;">PerkinElmer Inc.</td>
			<td style="width:135px;">HH14000000</td>
			<td style="width:224px;">To analyze GFP/Hoechst signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based lymphocyte assay suitable for high-throughput screening of small molecules

높은 처리량 스크리닝 (HTS)는 현재 생화학 반응 또는 세포 과정을 조절할 수있는 화학 엔티티의 식별을위한 대들보이다. 바이오 기술의 진보 및 작은 분자의 병진 높은 전위, 신약 혁신적인 접근 방법은 HTS의 사용에 관심을 부활 설명하는 진화 해왔다. 종양학 필드는 현재 이식 관련 합병증 또는자가 면역 질환을 대상으로 새로운 면역 조절 화합물의 식별을 위해 만든 더 큰 혁신과 약물 검사에 대한 가장 활발한 연구 분야이다. 여기서는 관내 뮤린 형광 계 분석에서 림프구 신규 쉽게 새로운 면역 조절 화합물을 동정하도록 제안한다. 상기 분석은 Nur77 프로모터 T- 또는 B 세포 수용체 자극에 GFP 발현을 구동하는 트랜스 제닉 마우스로부터 유도 된 T 세포 또는 B를 사용한다. GFP의 강도가 반영하는 바와 같이,표적 세포의 활성화 / 전사 활성은, 우리의 분석은 셀룰러 / 생물학적 반응에 대한 특정 화합물 (들)의 효과를 연구하기위한 신규 도구를 정의한다. 예를 들어, 차 스크리닝은 면역 활동 전위를 디스플레이 (160)의 히트 식별되었다 「타겟 가설 &quot;의 부재 하에서 4,398 화합물을 사용하여 수행 하였다. 따라서, 이러한 분석의 사용은 시험 관내 / 생체 내 유효성 연구를 촉진하기 전에 큰 화학 라이브러리를 탐색 신약 프로그램에 적합하다.

고온 초전도 분석의 디자인 본원 형광 분석법을 설계 할 때 중요한 두 가지 요인을 고려 하였다. 먼저, T- 또는 B 세포 활성화는 질병 (예를 들어, 이식편 대 숙주 병)을 나타내는 것이되는 생리 학적 상태를 재현 할 필요가 있었다. 둘째, 세포 활성에 대한 평가가 민감하고 정량적 인 방법을 이용하여 수행되어야한다. 그것?...

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A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

우리는 현재의 연구에서 형질 전환 마우스에서 파생 된 림프구를 사용하여 새로운 형광 기반의 분석을 제시한다. 이 분석은 억제 또는 림프구의 활성을 촉진하거나 용량을 부여 소분자의 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 적합하다.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

연구

면역학 및 감염병학

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

표현형 높은 처리량 분석<em&gt; 살모넬라 엔테</em&gt; 티피 뮤 리움 협회, 침략, 그리고 대 식세포에서의 복제

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축<em&gt; 녹농균</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험<em&gt; 브루셀라</em&gt; HeLa 세포의 감염

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

고밀도 지단백에 지질 과산화의 높은 처리량 측정을 위한 생 화 확 적인 세포-무료 Fluorometric 효소 분석 결과

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

높은 처리량 Shigella-특정 살 균 시험

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...