Name: a fluorescence-based lymphocyte assay suitable for high-throughput screening of small molecules
Uploaded: 2017-03-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Merck Frosst Oppstart midler fra Université de Montréal. Vi ønsker å takke dr Jean Duchaine og Dominic Salois fra High-throughput plattform ved Institutt for forskning innen immunologi og kreft for deres diskusjon, kommentarer og tilbakemeldinger. Moutih Rafei har en Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior en Award.

Alle dyr protokoller ble godkjent av Animal Care komité Université de Montréal. Musene ble avlivet ved gradvis innånding av CO 2 til ingen vitale ble observert fulgt ved halshugging. Prosedyren ble utført av en sertifisert person for å sikre at dyr ble avlivet på en human måte og i henhold til anbefalingene fra den kanadiske Council on Animal Care. 1. Utarbeidelse av splenocytt Medium og Flow-cytometri Buffer <ol><li> Utfør alle trinnene under en 70% etanol-renset biolo...

<ol>
	<li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).</li><li>Macarron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research.">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).</li><li>Lokey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+chemical+genetics:+progress+and+obstacles+on+the+path+to+a+new+pharmacopoeia.">Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia.</a> Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).</li><li>Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomics-driven+drug+discovery:+addressing+high+attrition+rates.">Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates.</a> Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).</li><li>Pruss, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+screening+strategies+for+neurodegenerative+diseases:+a+pathway+to+discover+novel+drug+candidates+and+potential+disease+targets+or+mechanisms.">Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).</li><li>St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+chemical+genetics+in+yeast+for+discovery+of+chemical+probes+targeting+metabolism.">Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism.</a> Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).</li><li>Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+impact+of+technology+investment+on+lead+discovery+at+Bristol-Myers+Squibb.">Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb.</a> Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Walters, W. P., Namchuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+screens:+how+to+make+your+hits+a+hit.">Designing screens: how to make your hits a hit.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).</li><li>Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+screens+as+a+renewed+approach+for+drug+discovery.">Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery.</a> Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).</li><li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis.">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).</li><li>Moran, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+signal+strength+in+Treg+and+iNKT+cell+development+demonstrated+by+a+novel+fluorescent+reporter+mouse.">T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse.</a> J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).</li><li>Kovacic, N., M&#252;thing, J., Marusic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Glycosphingolipid+Expression+in+Mouse+Lymphoid+Tissues.">Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues.</a> J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+estimation+of+DNA+and+RNA+content+in+intact+cells+stained+with+hoechst+33342+and+pyronin+Y.">Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y.</a> Cytometry. 2, 143-150 (1981).</li><li>Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening:+seeing+is+believing.">High content screening: seeing is believing.</a> Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).</li><li>An, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+assays.">Fluorescence-based assays.</a> Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).</li><li>Kishimoto, H., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+TCR+ligation+without+costimulation+causes+rapid+onset+of+Fas-dependent+apoptosis+of+naive+murine+CD4++T+cells.">Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells.</a> J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).</li><li>Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+mediates+the+homeostasis+of+naive+and+memory+CD8+T+cells+in+vivo.">Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo.</a> Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).</li><li>Jiang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+IL-7,+a+key+lymphotrophin.">Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).</li><li>Koenen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutually+exclusive+regulation+of+T+cell+survival+by+IL-7R+and+antigen+receptor-induced+signals.">Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals.</a> Nat Commun. 4, 1735 (2013).</li><li>Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+4+(IL-4)+or+IL-7+prevents+the+death+of+resting+T+cells:+stat6+is+probably+not+required+for+the+effect+of+IL-4.">Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4.</a> J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).</li><li>Hawkins, C. J., Vaux, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+Bcl-2+family+of+apoptosis+regulatory+proteins+in+the+immune+system.">The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system.</a> Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).</li><li>Sumantran, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+chemosensitivity+assays:+an+overview.">Cellular chemosensitivity assays: an overview.</a> Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).</li><li>Huh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+system+for+screening+hair+growth-promoting+agents.">A cell-based system for screening hair growth-promoting agents.</a> Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).</li><li>Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+signal+transduction:+opening+the+black+box.">TCR signal transduction: opening the black box.</a> J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).</li><li>Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+prevents+cell+death+during+primary+T+cell+activation.">CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation.</a> J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).</li><li>Michels, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+selection+of+small+molecules+to+alter+allele-specific+MHC+class+II+antigen+presentation.">Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation.</a> J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).</li></ol>

Flere avlesningsmetoder er blitt utnyttet for utvikling av følsomme og pålitelige HTS-analyser. Disse inkluderer kolo, selvlysende eller fluorescerende metoder. Selv om kolorimetriske metoder er enkle å sette opp, krever de flere tilsetninger av kjemikalier, som kan påvirke eller forstyrre cellene som blir testet. 23 I tillegg har de ikke tillater dynamisk evaluering av en biologisk respons som den farmakologiske virkning vurderes ved et bestemt endepunkt. Videre kan denne fremgangsmåten kre...

Høy throughput screening (HTS) er en bevist strategi allment vedtatt for identifisering av nye terapeutiske molekyler eller for reposisjonering av FDA-godkjente legemidler i nye medisinske indikasjoner. 1. Så langt, kan det oppnås HTS suksess måles ved den mengde av tidligere oppdaget legemidler. For eksempel, tyrosinkinaseinhibitoren lapatinib brukes til behandling av brystkreft, sitagliptin; en dipeptidylpeptidase-4 (DPP-4) inhibitor brukt som et anti-hyperglykemisk legemiddel, og den orale Bcr-Abl tyrosin kinase inhibitor dasatinib anvendes for behandling av kronisk myelogen leukemi representere noen eksempler på en lang liste over godkjente medikamenter som opprinnelig oppdaget av HTS. 2 Selv om produktiviteten i den farmasøytiske industrien har i det siste hatt en mangel i oppdagelsen av nye kjemiske enheter, kan sannsynligheten for vellykket drug discovery forbedres gjennom en økning i antall preklinisk candidates viser modulatory biologiske / biokjemiske egenskaper. Følgelig kan utviklingen av nye HTS-analyser som er tilpasset for fenotypisk screening har potensial til å gi viktige farmakologiske verktøy for oppdagelsen av nye legemiddel treff. 3, 4, 5, 6 Videre kan HTS nå utføres i et raskere tempo på grunn av betydelige teknologiske forandringer de siste årene, inkludert spesialdesignede fleksible robotinstallasjoner, nye avlesningsteknologi og omfattende miniatyrisering. 2, 7 Blant de faktorer som bidrar til den økende interesse for bruk av fenotypisk screening (aka frem farmakologi) er oppfatningen at fokus på funksjonelle effekter fremfor forenklede reduksjonistisk forutsetninger om molekylære mål (mål-basert screening / biokjemiske reaksjoner) er mer sannsynlig å sho<html> w klinisk effekt. Dermed holder fenotypisk screening løfte om å avdekke nye potensielt terapeutiske forbindelser og molekylære stier av tiden botemiddel sykdommer. 2 Slik skal identifisere hemmere eller aktivatorer for en gitt molekylære mål eller cellular funksjon, er en svært følsom og pålitelig analyse er nødvendig for å kunne skille mellom bona fide treff og falske positiver. Så, hva gjør en god analyse? Kvaliteten på en gitt analyse, må først bedømt av signal-til-støy-forhold (reflektert gjennom en Z-faktor). 8 andre bør målrettet effekt eller målet på skjermen bli klarlagt. For eksempel kan funksjonelle cellebaserte tilnærminger gi betydelige fordeler for reseptoren screening i motsetning til en assay er spesielt utformet for å vurdere ligand-reseptor-binding. Grunnen til dette er at den sistnevnte metode ikke kan skille mellom agonist og antagonist-ligander.ss = &quot;xref&quot;&gt; 9 I motsetning til dette, er en cellebasert tilnærming sannsynligvis være mer effektive som reseptor-funksjon kan være direkte vurdert i en biologisk fenotype (proliferasjon, cellesyklus-stans, apoptose og / eller differensiering). Det må imidlertid bemerkes at biokjemiske analyser kan gi betydelige fordeler i forhold til fenotypiske assays som de krenker en spesifikk intracellulær mål. Et godt optimalisert biokjemiske analysen vil generelt ha mindre data scatter enn en fenotypisk screening samtidig forenkle etterpå etterforskning knyttet til stoffet molekylære virkningsmekanismen. Imidlertid er den største ulempen av target-baserte eller biokjemiske analyser mulighet til å forsterke graden av falske positive treff som kan påvirke ikke-spesifikke mål når de testes i et biologisk system (tap av spesifisiteten opprinnelig ble studert i biokjemisk analyse). 10 Selv om en veletablert cut-off punkt mellom negative og positive treff kan redusere antall falske positiver in den primære screening, anvendelse av et fysiologisk relevant system etterligne det naturlige cellulære miljø som intakte celler, vev eller hele helhet dyr forblir i kjernen av analysen utforming pendel. Derfor gjør fenotypiske screening bly funn med ønskelige biologiske / fenotypiske effekter for sykdommer uten identifiserte narkotika mål uten å ha forkunnskaper om forbindelsens aktivitet eller virkningsmekanisme. 11 Den her undersøkelsen gjelder utvikling og testing av en optimalisert og reproduserbar fenotypiske screening basert på to viktige komponenter: en kommersielt tilgjengelig mus modell og en gruppert sub-familie av kjemiske forbindelser. Med hensyn til dyremodell, avhengig av analysen på anvendelsen av lymfocytter som stammer fra et musestamme (Nur77 GFP) huse et bakterielt kunstig kromosom inneholdende en kassett i hvilken ekspresjonen av grønt fluorescerende protein (GFP) drives av the Nur77 promoter. 12 Kjennetegn på denne stimuleringen er basert på det faktum at Nur77 er en umiddelbar tidlig gen oppregulert etter T-celle-reseptor (TCR) eller B-celle-reseptoren (BCR) stimulering. 12 Som for screening metoden selv, ble en tilnærming brukes til å unngå screening av trivielle analoger mens den tiden som trengs for å vurdere en stor kjemisk bibliotek (&gt; 10 5 forbindelser) minimeres. For å gjøre dette, ble en database over kjemiske forbindelser som er valgt av medisinske kjemikere bruker virtuelle screening verktøy utnyttes for å identifisere topologisk lignende forbindelser ved hjelp av kjente aktive frø strukturer som referanser. Denne tilnærmingen tillot oss å screene 4,398 forbindelser som representerer en samlet bibliotek med over 136 000 kjemiske enheter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="725">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:211px;">Nur77GFP mice</td>
			<td style="width:157px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:135px;">Mouse strain No. 016617</td>
			<td style="width:224px;">An in house colony was established at our animal facility&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">96 wells-U culture plates, sterile</td>
			<td style="width:157px;">VWR International</td>
			<td style="width:135px;">10062-902</td>
			<td style="width:224px;">T-cell activation using the magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:211px;">70&#181;m cell strainer, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:135px;">352350</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:211px;">5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:135px;">352058</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:211px;">50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile</td>
			<td style="width:157px;">VWR International</td>
			<td style="width:135px;">89039-656&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:211px;">10 ml syringe without needle, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:135px;">305482</td>
			<td style="width:224px;">To mash the spleen</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">T-25 culture flask</td>
			<td style="width:157px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">690 175</td>
			<td style="width:224px;">To incudabte B cells during activation</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:211px;">5 ml cell culture dish, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">627 160</td>
			<td style="width:224px;">To mash the spleen</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">450-200-EL&#160;&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:211px;">RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">350-002-CL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:211px;">MEM non-essential amino acids</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">321-010-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">HEPES free acid 1 M</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">330-050-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Sodium pyruvate solution (100mM)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">600-110-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:211px;">Fetal Bovine Serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">080-910&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:224px;">Component of flow-cytometry buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">2-Mercaptoethanol (55mM)</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">21985-023</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:211px;">T- Cells isolation kit</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">19851</td>
			<td style="width:224px;">To isolate T cells</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:211px;">B- Cells isolation kit</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">19854</td>
			<td style="width:224px;">To isolate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">11452D</td>
			<td style="width:224px;">To activate T cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Cell isolation magnet</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">18000</td>
			<td style="width:224px;">To isolate T cells and remove the magnetic beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L)</td>
			<td style="width:157px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">115-006-068</td>
			<td style="width:224px;">To stimulate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Recombinant Murine IL-7</td>
			<td style="width:157px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">217-17&#160;</td>
			<td style="width:224px;">To support T-cell survival during activation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Recombinant CD40L</td>
			<td style="width:157px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">8230-CL/CF</td>
			<td style="width:224px;">To stimulate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Anti-mouse CD3 antibody</td>
			<td style="width:157px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">561799</td>
			<td style="width:224px;">To stain T cells for flow-cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Anti-mouse CD19 antibody</td>
			<td style="width:157px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">553786</td>
			<td style="width:224px;">To stain B cells for flow-cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:211px;">Biomed FXp</td>
			<td style="width:157px;">PerkinElmer Inc.</td>
			<td style="width:135px;">A31842</td>
			<td style="width:224px;">To re-suspend cells after 24 hours incubation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Opera Phenix High Content Screening System</td>
			<td style="width:157px;">PerkinElmer Inc.</td>
			<td style="width:135px;">HH14000000</td>
			<td style="width:224px;">To analyze GFP/Hoechst signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based lymphocyte assay suitable for high-throughput screening of small molecules

Høy throughput screening (HTS) er i dag den mest for identifisering av kjemiske enheter som er i stand til å modulere biokjemiske reaksjoner eller cellulære prosesser. Med fremme av bioteknologi og den høye translasjonell potensialet av små molekyler, har en rekke innovative tilnærminger i medisiner utviklet seg, noe som forklarer den gjenoppblomstrende interesse for bruk av HTS. Den onkologi feltet er for tiden den mest aktive forskningsområde for narkotika screening, med ingen store gjennombrudd gjort for identifisering av nye immunmodulerende forbindelser rettet mot transplantasjonsrelaterte komplikasjoner eller autoimmune sykdommer. Her presenterer vi en ny in vitro murin fluorescerende basert lymfocytt analyse lett tilpasses for identifisering av nye immunmodulerende forbindelser. Denne analysen anvender T- eller B-celler avledet fra en transgen mus, i hvilken det Nur77 promoteren driver GFP uttrykk på T- eller B-celle-reseptor-stimulering. Som GFP intensitet reflektereraktivering / transkripsjonen aktivitet av målcellen, definerer vår analyse et nytt verktøy for å studere effekten av gitt forbindelse (r) på cellulære / biologiske responser. For eksempel ble en primær screening utført ved å bruke 4,398 forbindelser i fravær av en &quot;target hypotesen&quot;, noe som førte til identifisering av 160 mulige treff som viser immunmodulerende aktiviteter. Således er bruken av denne analyse er egnet for drug discovery programmer som utforsker store kjemiske biblioteker før videre in vitro / in vivo valideringsstudier.

Design av HTS analysen To viktige faktorer er tatt i betraktning ved utformingen av dokumentet fluorescerende analysen. Først, trengte å gjenskape en fysiologisk tilstand der T- eller B-celleaktivering vil representere en sykdom (f.eks graft-versus-host disease). For det andre bør vurderingen av cellulær aktivering utføres ved å bruke en følsom og kvantitativ metode. Fluorescens er i dag en av de primære valg for...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules at JoVE.com

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Vi presenterer i denne studien en ny fluorescens-baserte analysen ved hjelp av lymfocytter avledet fra en transgen mus. Denne analysen er egnet for high-throughput screening (HTS) av små molekyler utrustet med evnen til enten å inhibere eller fremme lymfocyttaktivering.

En fluorescens-basert lymfocyttkontroll analyse Egnet for høy gjennomstrømming screening av små molekyler

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Høy gjennomstrømming encellede Cytotoksisitet analysen for T celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

En mikroskopisk fenotypisk analyse for kvantifisering av intracellulær mykobakterier tilpasset høygjennomstrømning / screening av høyt innhold

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Høy gjennomstrømming Screening for Bredspektret Chemical hemmere av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Høy gjennomstrømming analysen til sin fenotype<em&gt; Salmonella ente</em&gt; Typhimurium Association, Invasion, og Replication i makrofager

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Høy gjennomstrømming Kvantitativ Real-time RT-PCR-analyse for fastsetting Expression Profiler av type I og III Interferon Subtyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Etablering av en High-throughput Oppsett for screening små molekyler som modulerer c-di-GMP signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Mikroskopi-baserte analyser for High-throughput screening av Host faktorer involvert i<em&gt; Brucella</em&gt; Infeksjon av HeLa-celler

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Cell-free biokjemiske Fluorometric enzymatisk analysen for høy gjennomstrømming-måling av Lipid Peroxidation in høy tetthet Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høy gjennomstrømming plattform for Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En høy gjennomstrømming Shigella-spesifikke bakteriedrepende analysen

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...