Name: a fluorescence-based lymphocyte assay suitable for high-throughput screening of small molecules
Uploaded: 2017-03-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules at JoVE.com

Эта работа была поддержана Merck Frosst Start-Up средства, предоставленные Университета Монреаля. Мы хотели бы поблагодарить Докторов Жан Дюшен и Доминик Salois с высокой пропускной способностью платформы в Институте исследований в области иммунологии и рака для их обсуждения, комментарии и отзывы. Moutih Рафеи держит Fonds де-ла-Recherche ан Sante Квебека Младший 1 премии.

Все протоколы животных были одобрены Animal Care комитета Монреальского университета путем. Мыши были подвергнуты эвтаназии путем постепенного ингаляции СО 2 , пока не жизненно важных признаков не наблюдалось с последующим смещением шейных позвонков. Процедура была выполнена сертиф...

<ol>
	<li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).</li><li>Macarron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research.">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).</li><li>Lokey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+chemical+genetics:+progress+and+obstacles+on+the+path+to+a+new+pharmacopoeia.">Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia.</a> Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).</li><li>Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomics-driven+drug+discovery:+addressing+high+attrition+rates.">Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates.</a> Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).</li><li>Pruss, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+screening+strategies+for+neurodegenerative+diseases:+a+pathway+to+discover+novel+drug+candidates+and+potential+disease+targets+or+mechanisms.">Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).</li><li>St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+chemical+genetics+in+yeast+for+discovery+of+chemical+probes+targeting+metabolism.">Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism.</a> Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).</li><li>Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+impact+of+technology+investment+on+lead+discovery+at+Bristol-Myers+Squibb.">Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb.</a> Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Walters, W. P., Namchuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+screens:+how+to+make+your+hits+a+hit.">Designing screens: how to make your hits a hit.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).</li><li>Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+screens+as+a+renewed+approach+for+drug+discovery.">Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery.</a> Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).</li><li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis.">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).</li><li>Moran, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+signal+strength+in+Treg+and+iNKT+cell+development+demonstrated+by+a+novel+fluorescent+reporter+mouse.">T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse.</a> J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).</li><li>Kovacic, N., M&#252;thing, J., Marusic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Glycosphingolipid+Expression+in+Mouse+Lymphoid+Tissues.">Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues.</a> J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+estimation+of+DNA+and+RNA+content+in+intact+cells+stained+with+hoechst+33342+and+pyronin+Y.">Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y.</a> Cytometry. 2, 143-150 (1981).</li><li>Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening:+seeing+is+believing.">High content screening: seeing is believing.</a> Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).</li><li>An, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+assays.">Fluorescence-based assays.</a> Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).</li><li>Kishimoto, H., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+TCR+ligation+without+costimulation+causes+rapid+onset+of+Fas-dependent+apoptosis+of+naive+murine+CD4++T+cells.">Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells.</a> J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).</li><li>Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+mediates+the+homeostasis+of+naive+and+memory+CD8+T+cells+in+vivo.">Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo.</a> Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).</li><li>Jiang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+IL-7,+a+key+lymphotrophin.">Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).</li><li>Koenen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutually+exclusive+regulation+of+T+cell+survival+by+IL-7R+and+antigen+receptor-induced+signals.">Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals.</a> Nat Commun. 4, 1735 (2013).</li><li>Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+4+(IL-4)+or+IL-7+prevents+the+death+of+resting+T+cells:+stat6+is+probably+not+required+for+the+effect+of+IL-4.">Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4.</a> J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).</li><li>Hawkins, C. J., Vaux, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+Bcl-2+family+of+apoptosis+regulatory+proteins+in+the+immune+system.">The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system.</a> Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).</li><li>Sumantran, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+chemosensitivity+assays:+an+overview.">Cellular chemosensitivity assays: an overview.</a> Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).</li><li>Huh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+system+for+screening+hair+growth-promoting+agents.">A cell-based system for screening hair growth-promoting agents.</a> Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).</li><li>Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+signal+transduction:+opening+the+black+box.">TCR signal transduction: opening the black box.</a> J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).</li><li>Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+prevents+cell+death+during+primary+T+cell+activation.">CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation.</a> J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).</li><li>Michels, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+selection+of+small+molecules+to+alter+allele-specific+MHC+class+II+antigen+presentation.">Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation.</a> J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).</li></ol>

Существует несколько способов чтения из эксплуатировались для развития чувствительных и надежных HTS анализов. К ним относятся колориметрический, люминесцентный или флуоресцентные методы. Хотя колориметрические методы просты в настройке, они требуют несколько добавок химических вещ...

Высокая пропускная способность скрининга (HTS) является проверенным стратегия широко применяется для идентификации новых терапевтических молекул или репозиционирования FDA утвержденных препаратов в новых медицинских показаний. 1 До сих пор достигнутый успех HTS может быть измерена множеством ранее обнаруженных наркотиков. Например, ингибитор тирозинкиназы лапатиниба, используемый для лечения рака молочной железы, ситаглиптином; дипептидилпептидазы-4 (ДПП-4) ингибитор используют в качестве анти-гипергликемии препарата, и пероральный BCR-ABL ингибитор тирозинкиназы дазатиниб используется для лечения хронического миелолейкоза представляют несколько примеров из длинного перечня утвержденных препаратов, первоначально обнаруженных HTS. 2 Хотя производительность фармацевтической промышленности в последнее время страдает от недостатка в открытии новых химических объектов, вероятность успешного открытия новых лекарств может быть повышена за счет увеличения числа доклинических кандидаTES отображающие модуляторные биологические / биохимические свойства. Соответственно, разработка новых HTS анализов, адаптированных для фенотипического скрининга могли бы предложить потенциал, чтобы обеспечить важные фармакологические средства для открытия новых хитов наркотиков. 3, 4, 5, 6 Кроме того, HTS теперь могут быть выполнены в более быстром темпе из - за значительных технологических преобразований в последние годы в том числе специально разработанных гибких роботизированных установок, новых технологий Считывание и обширной миниатюризации. 2, 7 Среди факторов , способствующих растущий интерес к использованию фенотипического скрининга (он же вперед ФАРМАКОЛОГИЯ) является восприятие , что акцент на функциональных эффектов , а не упрощенными редукционистских предположений относительно молекулярных мишеней (целевых на основе скрининга / биохимических реакций), скорее всего , шо<html> ш клиническая эффективность. Таким образом, фенотипический скрининг держит обещание раскрыть новые потенциально терапевтических соединений и молекулярных механизмов в настоящее время неизлечимых заболеваний. 2 Для правильной идентификации ингибиторов или активаторов для данной молекулярной мишени или клеточной функции, высокочувствительным и надежным анализ необходим для того , чтобы различать добросовестных хитов FIDE и ложных срабатываний. Итак, что делает хороший анализ? Качество данного анализа должны быть сначала судить по соотношению сигнал-шум (отраженный через Z фактор). 8 Во- вторых, целенаправленный эффект или цель экрана должны быть четко определены. Например, функциональные клеточные подходы могут предложить значительные преимущества для скрининга рецепторов, в отличие от анализа, специально предназначенные для оценки связывания лиганд-рецептор. Причина этого заключается в том, что последний подход не может дифференцировать между агонистов и антагонистов лигандов.сс = &quot;Xref&quot;&gt; 9 В отличие от этого , подход на основе клеток, вероятно, будет более эффективным , как функция рецептора может быть непосредственно оценена в биологическом фенотипу (пролиферации, клеточного цикла, апоптоза, и / или дифференцировки). Тем не менее, следует отметить, что биохимические анализы могут обеспечить значительные преимущества по сравнению с фенотипическими анализами, поскольку они нарушают на специфические внутриклеточные мишени. Хорошо оптимизированная биохимический анализ, как правило, имеют меньший разброс данных, чем фенотипического скрининга при одновременном упрощении после исследований, связанных с наркотиками молекулярного механизма действия. Тем не менее, основным недостатком целевых показателей на основе или биохимических анализов является возможность усиливать уровень ложных положительных хитов, которые могут повлиять на неспецифические цели при испытании в биологической системе (потеря специфичности, первоначально изученной в биохимическом анализе). 10 Несмотря на то, хорошо налаженные точка отсечки между отрицательными и положительными хитов можно свести к минимуму число ложных срабатываний яп первичного скрининга, использование физиологически соответствующей системы, имитирующей нативную клеточную среду, таких как интактные клетки, цельной ткани или целого животного остается основой дизайна анализа маятника. Поэтому фенотипический скрининг позволяет открытие свинца с желаемыми биологическими / фенотипических эффектов для заболеваний без каких-либо идентифицированных мишеней для лекарственных средств без предварительного знания о деятельности соединения или способа действия. 11 Исследование здесь, относится к разработке и тестированию оптимизированной и воспроизводимым скрининга фенотипической на основе двух важных компонентов: коммерчески доступной модели мыши и кластерном подсемейство химических соединений. Что касается животной модели, анализ основан на использовании лимфоцитов , полученных из штамма мыши (Nur77 GFP) укрывает бактериальную искусственную хромосому , содержащую кассету , в которой экспрессия зеленого флуоресцентного белка (GFP) приводится в движение гое Nur77 промотор. 12 Отличительной чертой данной стимуляции основана на том факте , что Nur77 является непосредственным раннего гена повышающей регуляции следующие Т-клеточного рецептора (TCR) или рецептора В-клеток (BCR) стимуляции. 12 Что касается самого метода скрининга, подход был использован , чтобы помочь избежать скрининга тривиальных аналогов при одновременной минимизации времени , необходимого для оценки большой химической библиотеки (&gt; 10 5 соединений). Для этого, база данных химических соединений, выбранных лекарственных химиками с использованием виртуальных инструментов скрининга была использована для выявления топологически подобных соединений, используя известные активные семенные структуры как ссылки. Такой подход позволил нам экран 4398 соединений, представляющих общую библиотеку из более чем 136000 химических объектов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="725">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:211px;">Nur77GFP mice</td>
			<td style="width:157px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:135px;">Mouse strain No. 016617</td>
			<td style="width:224px;">An in house colony was established at our animal facility&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">96 wells-U culture plates, sterile</td>
			<td style="width:157px;">VWR International</td>
			<td style="width:135px;">10062-902</td>
			<td style="width:224px;">T-cell activation using the magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:211px;">70&#181;m cell strainer, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:135px;">352350</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:211px;">5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:135px;">352058</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:211px;">50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile</td>
			<td style="width:157px;">VWR International</td>
			<td style="width:135px;">89039-656&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:211px;">10 ml syringe without needle, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:135px;">305482</td>
			<td style="width:224px;">To mash the spleen</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">T-25 culture flask</td>
			<td style="width:157px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">690 175</td>
			<td style="width:224px;">To incudabte B cells during activation</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:211px;">5 ml cell culture dish, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">627 160</td>
			<td style="width:224px;">To mash the spleen</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">450-200-EL&#160;&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:211px;">RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">350-002-CL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:211px;">MEM non-essential amino acids</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">321-010-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">HEPES free acid 1 M</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">330-050-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Sodium pyruvate solution (100mM)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">600-110-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:211px;">Fetal Bovine Serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">080-910&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:224px;">Component of flow-cytometry buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">2-Mercaptoethanol (55mM)</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">21985-023</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:211px;">T- Cells isolation kit</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">19851</td>
			<td style="width:224px;">To isolate T cells</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:211px;">B- Cells isolation kit</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">19854</td>
			<td style="width:224px;">To isolate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">11452D</td>
			<td style="width:224px;">To activate T cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Cell isolation magnet</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">18000</td>
			<td style="width:224px;">To isolate T cells and remove the magnetic beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L)</td>
			<td style="width:157px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">115-006-068</td>
			<td style="width:224px;">To stimulate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Recombinant Murine IL-7</td>
			<td style="width:157px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">217-17&#160;</td>
			<td style="width:224px;">To support T-cell survival during activation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Recombinant CD40L</td>
			<td style="width:157px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">8230-CL/CF</td>
			<td style="width:224px;">To stimulate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Anti-mouse CD3 antibody</td>
			<td style="width:157px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">561799</td>
			<td style="width:224px;">To stain T cells for flow-cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Anti-mouse CD19 antibody</td>
			<td style="width:157px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">553786</td>
			<td style="width:224px;">To stain B cells for flow-cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:211px;">Biomed FXp</td>
			<td style="width:157px;">PerkinElmer Inc.</td>
			<td style="width:135px;">A31842</td>
			<td style="width:224px;">To re-suspend cells after 24 hours incubation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Opera Phenix High Content Screening System</td>
			<td style="width:157px;">PerkinElmer Inc.</td>
			<td style="width:135px;">HH14000000</td>
			<td style="width:224px;">To analyze GFP/Hoechst signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based lymphocyte assay suitable for high-throughput screening of small molecules

Высокопроизводительный скрининг (HTS) в настоящее время является основой для идентификации химических соединений, способных модулировать биохимические реакции или клеточные процессы. С развитием биотехнологий и высокой поступательной потенциала малых молекул, ряд инновационных подходов в разработке лекарств развились, что объясняет возрождающийся интерес к использованию HTS. Поле онкология в настоящее время наиболее активные исследования области для скрининга лекарственных средств, без большой прорыв сделал для выявления новых иммуномодулирующих соединений, ориентированных на трансплантацию осложнений, связанных или аутоиммунных заболеваний. Здесь мы представляем роман в пробирке мышиного флуоресцентного на основе анализа лимфоцитов легко адаптирован для идентификации новых иммуномодулирующих соединений. В этом анализе используют Т- или В клетки, полученные из трансгенной мыши, в которой промотор Nur77 управляет экспрессией GFP при t- или стимуляции рецептора В-клеток. Как отражает интенсивность GFPактивация / транскрипционной активности клетки-мишени, наш анализ определяет новый инструмент для изучения влияния данного соединения (ов) на клеточных / биологических реакций. Например, первичный скрининг проводили с использованием 4,398 соединений в отсутствие &quot;целевой гипотезы&quot;, что привело к идентификации 160 потенциальных хитов, отображающих иммуномодулирующей активностью. Таким образом, использование данного анализа является подходящим для программ поиска новых лекарственных препаратов, исследующих больших химических библиотек до дальнейших исследований в пробирке / в естественных условиях проверки.

Дизайн анализа HTS Два важных фактора были приняты во внимание при разработке флуоресцентного анализа в настоящем документе. Во- первых, нам нужно повторить физиологического состояния , в котором активация клеток Т- или В будет представл...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules at JoVE.com

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Мы представляем в настоящем исследовании нового флуоресцентного анализа на основе с использованием лимфоцитов, полученных из трансгенной мыши. Этот тест предназначен для высокопроизводительного скрининга (HTS) малых молекул, обладающих мощностью либо ингибирования или содействия активации лимфоцитов.

Флуоресцентным на основе анализа Лимфоцит Подходит для высокопроизводительного скрининга малых молекул

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Микроскопический фенотипический анализ для количественной оценки внутриклеточных микобактерий, адаптированных для скрининга с высокой пропускной способностью/высоким содержанием

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Высокопроизводительный скрининг для широкого спектра химических ингибиторов РНК-содержащих вирусов

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Высокая пропускная Анализ фенотипу<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Ассоциация, Нашествие, и репликации в макрофагах

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Высокая пропускная способность Количественный реальном времени RT-PCR анализа для определения профилей экспрессии типов I и III интерферона подтипов

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Создание установки с высокой пропускной способностью для скрининга малых молекул, которые модулируют с-ди-GMP Передача сигналов в<em&gt; Синегнойной</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Микроскопия основе Анализы для высокопроизводительного скрининга на хост факторов, участвующих в<em&gt; Brucella</em&gt; Инфицирование клеток HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Ячейки бесплатно биохимических флуориметрический ферментативные Assay высок объём измерения перекисного окисления липидов в липопротеинов высокой плотности

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Высок объём шигеллезом-конкретные бактерицидной Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...