Name: a fluorescence-based lymphocyte assay suitable for high-throughput screening of small molecules
Uploaded: 2017-03-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules at JoVE.com

Bu çalışma Université de Montréal tarafından sağlanan Merck Frosst Start-up fonları tarafından desteklenmiştir. Biz onların tartışma, yorum ve yorumlarından İmmünoloji ve Kanser Araştırma Enstitüsü Yüksek verim platformundan Dr Jean Duchaine ve Dominic Salois teşekkür etmek istiyorum. Moutih Rafei bir Fonds de la Recherche en Santé du Québec Genç 1 Ödülü sahibidir.

Tüm hayvan protokolleri Université de Montréal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı. Fareler Hayati işaretler, servikal dislokasyon gözlenene kadar, CO 2 aşamalı inhalasyonu ile ötenazi yapıldı. Prosedür hayvanlar insani bir şekilde ötenazi ve Hayvan Bakımı Kanada Konseyi önerileri doğrultusunda emin olmak için bir sertifikalı kişi tarafından yürütülmüştür. Splenocyte Orta ve Akış sitometri Buffer 1. Hazırlık <ol><li> % 70 etanol-temizleni...

<ol>
	<li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).</li><li>Macarron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research.">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).</li><li>Lokey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+chemical+genetics:+progress+and+obstacles+on+the+path+to+a+new+pharmacopoeia.">Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia.</a> Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).</li><li>Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomics-driven+drug+discovery:+addressing+high+attrition+rates.">Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates.</a> Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).</li><li>Pruss, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+screening+strategies+for+neurodegenerative+diseases:+a+pathway+to+discover+novel+drug+candidates+and+potential+disease+targets+or+mechanisms.">Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).</li><li>St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+chemical+genetics+in+yeast+for+discovery+of+chemical+probes+targeting+metabolism.">Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism.</a> Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).</li><li>Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+impact+of+technology+investment+on+lead+discovery+at+Bristol-Myers+Squibb.">Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb.</a> Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Walters, W. P., Namchuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+screens:+how+to+make+your+hits+a+hit.">Designing screens: how to make your hits a hit.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).</li><li>Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+screens+as+a+renewed+approach+for+drug+discovery.">Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery.</a> Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).</li><li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis.">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).</li><li>Moran, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+signal+strength+in+Treg+and+iNKT+cell+development+demonstrated+by+a+novel+fluorescent+reporter+mouse.">T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse.</a> J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).</li><li>Kovacic, N., M&#252;thing, J., Marusic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Glycosphingolipid+Expression+in+Mouse+Lymphoid+Tissues.">Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues.</a> J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+estimation+of+DNA+and+RNA+content+in+intact+cells+stained+with+hoechst+33342+and+pyronin+Y.">Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y.</a> Cytometry. 2, 143-150 (1981).</li><li>Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening:+seeing+is+believing.">High content screening: seeing is believing.</a> Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).</li><li>An, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+assays.">Fluorescence-based assays.</a> Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).</li><li>Kishimoto, H., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+TCR+ligation+without+costimulation+causes+rapid+onset+of+Fas-dependent+apoptosis+of+naive+murine+CD4++T+cells.">Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells.</a> J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).</li><li>Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+mediates+the+homeostasis+of+naive+and+memory+CD8+T+cells+in+vivo.">Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo.</a> Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).</li><li>Jiang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+IL-7,+a+key+lymphotrophin.">Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).</li><li>Koenen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutually+exclusive+regulation+of+T+cell+survival+by+IL-7R+and+antigen+receptor-induced+signals.">Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals.</a> Nat Commun. 4, 1735 (2013).</li><li>Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+4+(IL-4)+or+IL-7+prevents+the+death+of+resting+T+cells:+stat6+is+probably+not+required+for+the+effect+of+IL-4.">Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4.</a> J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).</li><li>Hawkins, C. J., Vaux, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+Bcl-2+family+of+apoptosis+regulatory+proteins+in+the+immune+system.">The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system.</a> Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).</li><li>Sumantran, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+chemosensitivity+assays:+an+overview.">Cellular chemosensitivity assays: an overview.</a> Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).</li><li>Huh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+system+for+screening+hair+growth-promoting+agents.">A cell-based system for screening hair growth-promoting agents.</a> Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).</li><li>Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+signal+transduction:+opening+the+black+box.">TCR signal transduction: opening the black box.</a> J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).</li><li>Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+prevents+cell+death+during+primary+T+cell+activation.">CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation.</a> J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).</li><li>Michels, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+selection+of+small+molecules+to+alter+allele-specific+MHC+class+II+antigen+presentation.">Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation.</a> J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).</li></ol>

Çeşitli okuma-out yöntemleri hassas ve güvenilir HTS testlerin geliştirilmesi için istismar edilmiştir. Bu kolorimetrik, Işıklı veya floresan yöntemleri içerir. Kolorimetrik yöntemler kurulumu kolay olmakla birlikte, bu müdahale ya da hücre, test edilen bölebilir kimyasal birden eklenen gerektirir. Farmakolojik etkisi, belirli bir uç değerlendirilir olarak 23 ek olarak, biyolojik bir yanıt dinamik değerlendirilmesine imkan yoktur. otomatik HTS kullanılırsa Ayrıca, bu yönte...

Yüksek verimli tarama (HTS) yaygın yeni tedavi moleküllerin tanımlanması için ya da yeni tıbbi endikasyonlarda FDA onaylı ilaçların yeniden konumlandırılması için kabul edilen kanıtlanmış bir stratejidir. 1. Şu ana kadar elde edilen HTS başarısı, daha önce keşfedilen ilaçların bolluk ile ölçülebilir. Örneğin, bir tirosin kinaz inhibitörü, Lapatinib, göğüs kanseri, sitagliptin tedavisinde kullanılan; dipeptidil peptidaz-4 (DPP-4) inhibitörü, bir anti-hiperglisemik ilaç olarak kullanılır ve kronik miyeloid lösemi tedavisi için, oral Bcr-Abl tirozin kinaz önleyici dasatinib başlangıçta tarafından keşfedilen onaylanmış ilaçlar uzun bir liste birkaç örneği temsil eder HTS. İlaç endüstrisinin verimliliği son zamanlarda yeni kimyasal yapılar keşfi eksikliğinden muzdarip olmasına rağmen 2, başarılı ilaç keşfi olasılığı klinik öncesi Candida sayısında bir artış ile geliştirilebilirdüzenleyici biyolojik / biyokimyasal özelliklerini gösteren tes. Buna göre, fenotipik tarama için uyarlanmış yeni HTS tahlillerin gelişimi yeni ilaç hit keşfi için önemli farmakolojik araçlar sağlamak için potansiyel sunabilir. 3, 4, 5, 6 Ayrıca, HTS şimdi nedeniyle özel tasarlanmış esnek robot tesisler, roman okuma-out teknolojileri ve kapsamlı minyatür dahil son yıllarda önemli teknolojik dönüşümlere daha hızlı bir tempoda yapılabilir. Fenotipik tarama (aka ileri farmakoloji) kullanımında artan ilgi katkıda faktörler arasında 2, 7 fonksiyonel etkileri ziyade moleküler hedeflerin (hedef tabanlı tarama / biyokimyasal reaksiyonların) ile ilgili basitleştirilmiş indirgemeci varsayımlara odaklanarak daha muhtemel olduğunu algı sho için<html> w klinik etkinliği. Böylece, fenotipik tarama yeni potansiyel tedavi bileşikler ve şu anda tedavi edilemeyen hastalıkların moleküler yollar ortaya çıkarmak için umut vaat ediyor. 2 Düzgün bir şekilde, belirli bir moleküler hedef ya da hücre fonksiyonu için inhibitörler ya da aktivatörler belirlemek için, son derece hassas ve güvenilir bir analiz niyetli lan ve yanlış pozitif arasında ayrım yapmak için gereklidir. Peki, iyi bir tahlil yapar? Belirli bir testin önce kalite (Z faktörü yansıtıldığı) sinyal-gürültü oranı ile değerlendirilmelidir. 8 İkinci olarak, hedeflenen etki veya ekranın hedefi açıkça belirlenmelidir. spesifik ligand-reseptör değerlendirmek için tasarlanmış bir tahlil karşı Örneğin, fonksiyonel hücre bazlı yaklaşımlar reseptör taranması için önemli avantajlar sunabilir. Bunun nedeni ikinci yaklaşım agonist ve antagonist ligandlar ayırt edemez olmasıdır.P = &quot;xref&quot; tersine&gt; 9, hücre bazlı bir yaklaşım, reseptör fonksiyonu, biyolojik bir fenotip ile değerlendirilebilir daha etkili olması muhtemeldir (çoğalması, hücre döngüsünün durması, apoptoz ve / veya farklılaşma). Bununla birlikte, belli bir hücre içi hedef ihlal olarak biyokimyasal denemelerde, fenotipik testlere göre önemli avantajlar sağlayabilir belirtmek gerekir. Daha sonra eylem ilaç moleküler mekanizmasına ilişkin soruşturmalar basitleştirilmesi sırasında bir iyi optimize biyokimyasal tahlil genellikle fenotipik tarama daha az veri dağılım olacaktır. Bununla birlikte, hedef bazlı veya biyokimyasal deneylerin büyük dezavantajı, bir biyolojik sistem (orijinal biyokimyasal deneyde incelenmiştir özgüllük kaybı) test edildiğinde, spesifik olmayan hedeflerini etkileyen yanlış pozitif isabet oranı çoğaltabilen şanstır. 10 negatif ve pozitif isabet arasında köklü bir kesme noktası yanlış pozitiflerin sayısını en aza rağmen benn primer tarama gibi sağlam hücreler, tüm doku veya bütün hayvan gibi yerli hücresel ortamı taklit bir fizyolojik ilgili sisteminin kullanılması tahlil tasarımı sarkacın çekirdek kalır. Bu nedenle, fenotipik tarama bileşiğin etkinliğinin ya da etki mekanizmasına önceden bilgi sahibi olmadan tanımlanmış ilaç hedefleri ile hastalıklar için arzu / biyolojik fenotipik etkileri ile baş keşif sağlar. 11 ticari olarak satılan fare modeli ve kimyasal bileşiklerin bir kümelenmiş alt ailesi: Burada çalışma iki önemli bileşenleri dayalı optimize edilmiş ve tekrarlanabilir fenotipik tarama geliştirme ve test ilgilidir. Hayvan modeli ile ilgili olarak, deney yeşil flüoresan protein (GFP) sentezleme th tarafından tahrik edilen, bir fare suşu (Nur77 GFP) bir kaset içeren bir bakteriyel suni kromozom barındıran türetilen lenfositlerin kullanımına dayanıre Nur77 promoteri. 12, bu uyarım damgasını Nur77 T-hücre reseptörü (TCR) veya B-hücresi reseptörü (BCR) uyarımını takiben up-regüle hemen erken gen olduğu gerçeğine dayanmaktadır. Tarama yöntemi kendisi de 12, bir yaklaşım büyük kimyasal kütüphane (&gt; 10 5 bileşikler) değerlendirmek için gerekli olan zamanı en aza indirirken, önemsiz analoglarının tarama kaçınarak yardım etmek için kullanıldı. Bunu yapmak için, bir sanal eleme araçlarını kullanarak ilaç kimyacılar tarafından seçilmiş kimyasal bir bileşik veritabanı referans olarak bilinen aktif tohum yapıları kullanan topolojik içindeki bileşiklerin belirlenmesi için kullanılabilir edildi. Bu yaklaşım bize 136.000 üzerinde kimyasal varlıkların genel bir kütüphane temsil 4.398 bileşiklerin taranması için izin verdi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="725">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:211px;">Nur77GFP mice</td>
			<td style="width:157px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:135px;">Mouse strain No. 016617</td>
			<td style="width:224px;">An in house colony was established at our animal facility&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">96 wells-U culture plates, sterile</td>
			<td style="width:157px;">VWR International</td>
			<td style="width:135px;">10062-902</td>
			<td style="width:224px;">T-cell activation using the magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:211px;">70&#181;m cell strainer, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:135px;">352350</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:211px;">5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:135px;">352058</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:211px;">50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile</td>
			<td style="width:157px;">VWR International</td>
			<td style="width:135px;">89039-656&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Generation of splenocytes cell suspension</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:211px;">10 ml syringe without needle, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:135px;">305482</td>
			<td style="width:224px;">To mash the spleen</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">T-25 culture flask</td>
			<td style="width:157px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">690 175</td>
			<td style="width:224px;">To incudabte B cells during activation</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:211px;">5 ml cell culture dish, sterile</td>
			<td style="width:157px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">627 160</td>
			<td style="width:224px;">To mash the spleen</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">450-200-EL&#160;&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:211px;">RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">350-002-CL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:211px;">MEM non-essential amino acids</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">321-010-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">HEPES free acid 1 M</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">330-050-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Sodium pyruvate solution (100mM)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">600-110-EL&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:211px;">Fetal Bovine Serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">080-910&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:157px;">WISENT Inc.</td>
			<td style="width:135px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:224px;">Component of flow-cytometry buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">2-Mercaptoethanol (55mM)</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">21985-023</td>
			<td style="width:224px;">Component of the splenocyte media</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:211px;">T- Cells isolation kit</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">19851</td>
			<td style="width:224px;">To isolate T cells</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:211px;">B- Cells isolation kit</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">19854</td>
			<td style="width:224px;">To isolate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">11452D</td>
			<td style="width:224px;">To activate T cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Cell isolation magnet</td>
			<td style="width:157px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">18000</td>
			<td style="width:224px;">To isolate T cells and remove the magnetic beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L)</td>
			<td style="width:157px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">115-006-068</td>
			<td style="width:224px;">To stimulate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Recombinant Murine IL-7</td>
			<td style="width:157px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">217-17&#160;</td>
			<td style="width:224px;">To support T-cell survival during activation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Recombinant CD40L</td>
			<td style="width:157px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">8230-CL/CF</td>
			<td style="width:224px;">To stimulate B cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Anti-mouse CD3 antibody</td>
			<td style="width:157px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">561799</td>
			<td style="width:224px;">To stain T cells for flow-cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Anti-mouse CD19 antibody</td>
			<td style="width:157px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:135px;">553786</td>
			<td style="width:224px;">To stain B cells for flow-cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:211px;">Biomed FXp</td>
			<td style="width:157px;">PerkinElmer Inc.</td>
			<td style="width:135px;">A31842</td>
			<td style="width:224px;">To re-suspend cells after 24 hours incubation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Opera Phenix High Content Screening System</td>
			<td style="width:157px;">PerkinElmer Inc.</td>
			<td style="width:135px;">HH14000000</td>
			<td style="width:224px;">To analyze GFP/Hoechst signal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based lymphocyte assay suitable for high-throughput screening of small molecules

Yüksek verimli tarama (HTS) halen biyokimyasal reaksiyonları veya hücresel süreçleri modüle edebilen bileşiklerin kimyasal tanımlanması için dayanak noktası. biyoteknolojiler ilerlemesi ve küçük moleküllerin yüksek öteleme potansiyeli ile ilaç keşfi yenilikçi yaklaşımların bir dizi HTS kullanımında dirilen ilgi açıklıyor, gelişmiştir. onkoloji alan şu anda transplantasyon ilişkili komplikasyonlar ya da otoimmün hastalıkları hedefleyen yeni immünmodülatör bileşikler belirlenmesi için yapılan hiçbir büyük bir atılım ile ilaç taraması için en aktif araştırma alanıdır. Burada, nitro sıçangil floresans esasına dayalı bir lemfosit deneyinde yeni kolayca yeni bağışıklık bileşimlerin belirlenmesi için uyarlanmış sunuyoruz. Bu deney, Nur77 promotör T veya B-hücresi reseptör uyarılması üzerine GFP ekspresyonu sağlayan transgenik bir fare, elde edilen T veya B hücreleri kullanır. GFP yoğunluğu yansıtırhedef hücre aktivasyonu / transkripsiyon aktivitesi, bizim deney hücre / biyolojik yanıt verilen bileşik (ler) etkilerini incelemek için yeni bir araç tanımlar. Örneğin, bir birincil tarama bağışıklık aktivitelerini gösteren 160 potansiyel hit tanımlanmasına yol açan bir &quot;hedef hipotezi&quot; yokluğunda 4.398 bileşikler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu durumda, bu deneyde kullanılması, in vitro / in vivo doğrulama çalışmaları daha da önce geniş kimyasal kütüphanelerin keşfetmek ilaç keşfi programları için de uygundur.

HTS analizi tasarımı Burada floresan tahlil tasarlarken iki önemli faktör dikkate alınmıştır. İlk olarak, T veya B hücre aktivasyonu bir hastalık (örneğin graft-versus-host hastalığı) temsil eder fizyolojik bir durumun çoğaltmak için gereken. İkinci olarak, hücre aktivasyonunun değerlendirilmesi duyarlı ve nicel bir yöntem kullanılarak yapılmalıdır. bu ihtiyaçlara karşılık olarak floresan ...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules at JoVE.com

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Biz bu çalışmada bir transgenik fareden türetilen lenfositlerin kullanılarak yeni floresans bazlı analiz sunuyoruz. Bu deney, inhibe veya lenfosit aktivasyonunu teşvik ya kapasitesine sahip küçük moleküller, yüksek verimli tarama (HTS) için uygundur.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Fenotipinin yüksek verim Deneyi<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler<em&gt; Brucella</em&gt; Hela Hücrelerinin Enfeksiyon

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Boş hücre biyokimyasal Fluorometrik enzimatik tahlil yüksek yoğunluklu Lipoprotein Lipid peroksidasyon yüksek üretilen iş ölçümü için

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...