Name: local field fluorescence microscopy: imaging cellular signals in intact hearts
Uploaded: 2017-03-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts at JoVE.com

نشكر الدكتور أليسيا Mattiazzi لمناقشة الحرجة من العمل المقدم. وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة (R01 HL-084487) إلى الرابطة.

وقد وافق هذا البروتوكول وعن التعامل مع الفئران عن طريق لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام جامعة كاليفورنيا ميرسيد (رقم 2008-201). وأجريت التجارب مع الببغاوات في عام 1999 وفقا لسياسات عامة للاستخدام الحيواني التي وضعتها اللجنة العلمية للمعهد الفنزويلي للبحوث العلمية (أ?...

<ol>
	<li>Fabiato, A., Fabiato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractions+induced+by+a+calcium-triggered+release+of+calcium+from+the+sarcoplasmic+reticulum+of+single+skinned+cardiac+cells.">Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells.</a> J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).</li><li>Mitra, R., Morad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+uniform+enzymatic+method+for+dissociation+of+myocytes+from+hearts+and+stomachs+of+vertebrates.">A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates.</a> Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).</li><li>Escobar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+of+intracellular+Ca2++transients+in+beating+rat+hearts.">Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).</li><li>Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+Heart+Loose+Patch+Photolysis+Reveals+Ionic+Current+Kinetics+During+Ventricular+Action+Potentials.">Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials.</a> Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).</li><li>Mitra, R., Morad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+uniform+enzymatic+method+for+dissociation+of+myocytes+from+hearts+and+stomachs+of+vertebrates.">A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates.</a> Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).</li><li>Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channel+currents+during+spontaneous+action+potentials+in+embryonic+chick+heart+cells.+The+action+potential+patch+clamp.">Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp.</a> Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).</li><li>Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profile+of+L-type+Ca(2+)+current+and+Na(+)/Ca(2+)+exchange+current+during+cardiac+action+potential+in+ventricular+myocytes.">Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes.</a> Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).</li><li>Apkon, M., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+two+distinct+depolarization-activated+K++currents+in+isolated+adult+rat+ventricular+myocytes.">Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes.</a> J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).</li><li>Valverde, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Ca2++depletion+of+the+sarcoplasmic+reticulum+at+the+onset+of+reperfusion.">Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion.</a> Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).</li><li>Valverde, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholamban+phosphorylation+sites+enhance+the+recovery+of+intracellular+Ca2++after+perfusion+arrest+in+isolated,+perfused+mouse+heart.">Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart.</a> Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).</li><li>Escobar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+in+the+regulation+of+ventricular+Ca(2+)+signaling+in+intact+mouse+heart.">Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).</li><li>Mej&#237;a-Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+local-field+fluorescence+microscopy:+a+new+approach+for+measuring+cellular+signals+in+the+beating+heart.">Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart.</a> Pfl&#252;gers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).</li><li>Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++release+underlies+the+development+of+phase+2+in+mouse+ventricular+action+potentials.">Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).</li><li>Kornyeyev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calsequestrin+2+deletion+shortens+the+refractoriness+of+Ca2++release+and+reduces+rate-dependent+Ca2+-alternans+in+intact+mouse+hearts.">Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).</li><li>Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++Sparks+and+Ca2++waves+are+the+subcellular+events+underlying+Ca2++overload+during+ischemia+and+reperfusion+in+perfused+intact+hearts.">Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts.</a> J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).</li><li>Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+Ca(2+)+content+regulates+intracellular+Ca(2+)+release+in+subepicardial+myocytes+of+intact+beating+mouse+hearts:+effect+of+exogenous+buffers.">Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).</li><li>Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+differences+between+guinea+pig+atrial+endocardium+and+epicardium:+evidence+for+a+role+of+Ito.">Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito.</a> Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).</li><li>Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+bases+for+electrophysiological+distinctions+among+epicardial,+midmyocardial,+and+endocardial+myocytes+from+the+free+wall+of+the+canine+left+ventricle.">Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle.</a> Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).</li><li>Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+outward+current+prominent+in+canine+ventricular+epicardium+but+not+endocardium.">Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium.</a> Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).</li><li>Lukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+of+Myocardial+Cells+in+the+Epicardial,+Midmyocardial,+and+Endocardial+Layers+of+the+Ventricle.">Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle.</a> J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).</li><li>Antzelevitch, C., Fish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+heterogeneity+within+the+ventricular+wall.">Electrical heterogeneity within the ventricular wall.</a> Basic Res Cardiol. 96 (6), 517-527 (2001).</li><li>Gomez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+electrical+heterogeneity+by+compensated+hypertrophy+in+rat+left+ventricle.">Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle.</a> Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).</li><li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+in+optical+imaging:+looking+inside+the+heart.">Innovation in optical imaging: looking inside the heart.</a> Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).</li><li>Boukens, B. J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+optocardiography.">A century of optocardiography.</a> IEEE Rev Biomed Eng. 7, 115-125 (2014).</li><li>Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+membrane+potential+and+epicardial+deformation+in+beating+hearts.">Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts.</a> Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).</li></ol>

وتتركز هذه الورقة في وصف تقنيات مضان ميدانية محلية لتقييم وظيفة myocytes القلب خارج الحي. دراسة هذه الخلايا في بيئة بالإضافة ليست فقط أكثر الفسيولوجية، ولكن هو أيضا مناسبة للغاية لتقييم الحالات المرضية على مستوى الجهاز. الأحداث الخلوية الكامنة وراء اقتران الإثارة?...

والقلب هو الجهاز المركزي للنظام القلب والأوعية الدموية. يبدأ تقلص القلب بزيادة في داخل الخلايا [كا 2+]. العلاقة بين استثارة الكهربائية والتغيرات في الخلايا إطلاق الكالسيوم 2+ تمت دراسته تاريخيا في الخلايا نأت إنزيمي 1 و 2. ومع ذلك، وخلايا القلب هي كهربائيا، عملية الأيض وميكانيكيا مقترنة 3 و 4. عندما معزولة، وmyocytes ليست فقط جسديا وفكت، ولكنها مختلطة myocytes من طبقات مختلفة خلال التفكك 5. وعلاوة على ذلك، على الرغم من المزايا الهائلة التي ظهرت من دراسة الخلايا المعزولة في ظل الظروف المشبك الجهد، 6، 7، 8 الطبيعة الجوهرية للقلب باعتبارها علوة مخلى الكهربائيةيس يطرح السؤال عن كيفية مختلفة وظيفيا وفصل الخلايا من تلك الموجودة في الأنسجة 3. في هذا المخطوط، وصفنا التقدم التي تم الحصول عليها في علم وظائف الأعضاء القلب عن طريق استخدام المحلي مضان الحقل المجهري تقنيات (LFFM) في قلب سليمة. يستخدم LFFM مؤشرات لقياس الفلورسنت متعددة المتغيرات الفسيولوجية مثل عصاري خلوي كا 2+، داخل شبكية الهيولى العضلية (SR) كا 2+ وغشاء المحتملة. هذه القياسات يمكن الحصول في وقت واحد وبالتزامن مع الضغط البطيني 9، 10، كهربية 9، إمكانات العمل الكهربائية (الجزائرية) والتسجيلات الحالية الأيونية والتحلل الضوئي فلاش من المركبات في قفص 4 و 11. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه القياسات يمكن الحصول على سرعة القلب سليما على ترددات أعلى قريبr لمعدلات الفسيولوجية. على الرغم من أن العديد من المواد 9، 11، 12، 13، 14 وقد نشرت من قبل مجموعتنا باستخدام تقنيات LFFM، وافتراض التعقيدات التقنية المرتبطة مع هذه التقنية قد تحول دون استخدام هذه ضخم في دراسة الظواهر الفسيولوجية خارج الجسم الحي في القلب وغيرها من الأجهزة. وتستند هذه التقنية LFFM (الشكل 1) على قياسات epifluorescence الحصول عليها باستخدام الألياف الضوئية المتعدد في اتصال مع الأنسجة. مثل أي تقنية التصوير اتصال مضان، يعتمد قرار بصري على قطر والفتحة العددية (NA) من الألياف. وهناك قطر أعلى NA وأصغر من الألياف تزيد من دقة مكانية القياسات. ناس وأقطار الألياف يمكن أن تتراوح 0،22-0،66 ومن 50 ميكرومتر إلى 1 ملم، على التوالي. فيوالتجعيد لNA تحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء (S / N) بقبول الفوتونات قادمة من زاوية الصلبة أكبر. من أجل أن تكون بمثابة جهاز epifluorescence، وتركز شعاع الضوء في الألياف البصرية مع عدسة شبه كروي أو هدف epifluorescence حيث NA العدسة والمباراة الألياف. هذا مطابقة يعظم نقل الطاقة لإثارة ولجمع الظهر الفوتونات المنبعثة من fluorophore. من أجل إثارة المؤشرات الفلورسنت الخارجية التي تم تحميلها في الأنسجة، ومصادر الضوء المختلفة وطرق الإضاءة يمكن استخدامها. لدينا دراسات رائدة باستخدام نابض المجال المحلي مضان المجهر 3، 12 (PLFFM) المستخدمة في بيكو ثانية ليزر منخفضة التكلفة (الشكل 1A، PLFFM). هذا النوع من مصدر الضوء لديه ميزة كبيرة من المثير جزء كبير من جزيئات fluorophore تحت منطقة الإضاءة دون تبيض كبير الصبغة المناسبلنبض قصيرة المدد 12. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام نبضات فائقة القصر سمح لتقييم مدى الحياة مضان من صبغ 12. عمر مضان هو الخاصية التي يمكن استخدامها لتحديد جزء من جزيئات الصبغة بد أن الكالسيوم 2+. للأسف، والنرفزة الزمنية للالبقول والاختلافات في السعة من نبض لنبض تحد من تطبيق هذه الاستراتيجية التجريبية إلى الحالات التي يكون فيها التغيير في مضان التي تنتجها يجند ملزم لصبغ كبير. عادة ما تستخدم موجة مستمرة (CW) ليزر كمصدر للإضاءة الرئيسية في LFFM (الشكل 1B، CLFFM). شعاع الليزر يمكن أن تضيء باستمرار الأنسجة أو يمكن أن يكون منظم ferroelectrically. التشكيل متعلق بالعازل الكهربائي الشفاف من الحزم يسمح توليد نبضات ميكروثانية الضوء. يمكن التحكم هذا التشكيل من قبل الأجهزة الخارجية. هذا الإجراء لا يقلل فقط بشكل كبير رانه النرفزة الزمنية للنبضات الضوء ولكنه يسمح أيضا خلط أشعة موجات مختلفة. يتم خلط الحزم من مضاعفة أشعة من الليزر المختلفة. ونتيجة لذلك، يمكن أن الأصباغ متعددة ذات الخواص الطيفية المختلفة يكون متحمس لإجراء قياسات لمجموعة من المتغيرات الفسيولوجية، على سبيل المثال، Rhod-2 للعصاري خلوي كا 2+، MagFluo4 للداخل ريال كا 2+ ودي-8-ANEPPS ل غشاء المحتملة. على الرغم من أن أشعة الليزر الحالية المزايا المختلفة كمصدر للضوء في LFFM، وأنواع أخرى من مصادر الضوء يمكن أن تستخدم بما في ذلك الثنائيات الباعثة للضوء (المصابيح). في هذه الحالة، تكون مصدر ضوء الإثارة لLED InGaN (الشكل 1C، PLEDFM). في المصابيح، وتنبعث الفوتونات بشكل عفوي عندما الإلكترونات من نطاق التوصيل تمتزج مع الثقوب في عصابة التكافؤ. الفرق مع ليزر الحالة الصلبة هو أن الانبعاثات لا يحفزه الفوتونات الأخرى. وهذا يؤدي إلى شعاع غير متماسك وانبعاث الطيف الأوسع للنظام بيانات تطبيق القانون. أنواع مختلفة من المصابيح عالية الطاقة يمكن استخدامها. للحصول على تسجيلات AP باستخدام دي-8-ANEPPS ول Ca 2+ تسجيل العابرين باستخدام فلوو-4 أو ماج-فلوو-4، استخدمنا LED التي لديها ذروة الانبعاثات نموذجي في 485 نانومتر (الأزرق) ونصف عرض 20 نانومتر (1D الشكل). ل Ca 2+ العابرين سجلت مع Rhod-2، وكان LED ذروة الانبعاثات نموذجي في 540 نانومتر (الأخضر) ونصف بعرض 35 نانومتر (1D الشكل). المصابيح تنبعث في طول موجة الفرقة، وبالتالي تتطلب المرشحات لتضييق الانبعاثات الطيفية. وبالإضافة إلى ذلك، وعلى ضوء نابض يمكن أن تتولد بمعدل 1.6 كيلو هرتز مع مدة 20 ميكرو ثانية. ونابض المصابيح مع سريع MOSFET السلطة تأثير الحقل الترانزستور. التسجيلات في وقت واحد مع مؤشرات مختلفة يمكن أن يقوم بها الوقت مضاعفة المصابيح. للأسف، الضوء المنبعث من المصابيح هو أكثر صعوبة في التركيز على الألياف البصرية مقارنة مع شعاع الليزر. وهكذا، فإن العيب الرئيسي مناجي المصابيح هو أن ملامح الانبعاثات لديها التشريد الزاوي (± 15 درجة) من المحور الرئيسي، ويجب استخدام والبصرية المساعدة لتصحيح ذلك. في كل من التكوينات البصرية التي سبق وصفها، وينعكس ضوء الإثارة بمساعدة مرآة مزدوج اللون. وتركز شعاع في وقت لاحق من قبل عدسة شبه كروي والهدف المجهر على الألياف البصرية المتعدد الذي يتوضع على الأنسجة. كما هو الحال في أي ترتيب epifluorescence، ومرآة مزدوج اللون يخدم أيضا للفصل بين الإثارة من الضوء المنبعث. طيف الضوء المنبعث يسافر الى الوراء من خلال مرشح حاجز لإزالة أي الإثارة ينعكس. وأخيرا، يركز الضوء المنبعث مع هدف الصعود إلى مكشاف ضوئي (الشكل 1). يتم تنفيذ تنبيغ من الضوء إلى تيار كهربائي من خلال ثنائيات ضوئية السيليكون الانهيار. هذه الثنائيات لديها استجابة سريعة وحساسية عالية تسمح منخفض كشف الضوء. الphotocurrent التي تنتجها فوتوديوديس سيل يمكن تضخيمه بطريقتين: مكبر للصوت transimpedance وجود مقاوم عنصر ردود الفعل (الشكل 1E) أو عن طريق تكامل لتحويل التيار إلى الجهد (الشكل 1F). باستخدام النهج الأول، والجهد الناتج يتناسب مع photocurrent والمقاوم ردود الفعل. ويرد مثال نموذجي للكشف مقاوم من نبضات الليزر بيكو ثانية في أرقام 2A، 2B و2C. يوضح 2A الفريق خرج مكبر للصوت transimpedance ويظهر لوحة 2B توسع الوقت الفاصل الزمني المشار إليها بعلامة النجمة (*). تم تنفيذ خوارزمية ذروة تتبع للكشف عن الذروة (أحمر) وقاعدة (الأخضر) للردود الفلورسنت 12. قياس مضان قاعدة يوفر المعلومات من كلا التيار المظلم من الثنائي الضوئي الانهيار والتدخلات التي أدخلها دوري الدرجة المحيطةحزب التحرير واقتران الكهرومغناطيسي. ويرد تمثيل قمم وقواعد في الشكل 2C. يوضح هذا الرقم مضان المنبعثة من الصبغة (Rhod-2) منضمة إلى الكالسيوم 2+ خلال دورة القلب من قلب ينبض ببغاء. في الطريقة الثانية، والجهد الناتج من تكامل هو وظيفة من ردود الفعل الحالية وبالسعة (أرقام 2D، 2E، و2F). ويبين الشكل 2F دورتين متتاليتين التكامل: الأول مع عدم وجود إضاءة في الهواء الطلق، والثاني مع نبضات الضوء التطبيقية من الصمام نابض. ويرد وصف مفصل في أرقام 2G و 2H. هذا النهج، على الرغم من أن أكثر شاقة، ويوفر أكبر S / N نظرا لعدم وجود الضوضاء الحرارية في مكثف ردود الفعل. ويتضمن الصك مرحلة التوقيت الذي يولد كل السيطرة والمتنوعة من ضوء الإثارة والأوامر والتكامل headstage والدقةفترات آخرون. عادة ما يتم إجراء هذا مع دائرة معالجة الإشارات الرقمية التي تنفذ أيضا تمايز الرقمي للإشارة خرج متكاملة من خلال حساب والانحدار على الانترنت من بيانات. في حالة استخدام ردود الفعل مقاوم، أي لوحة اقتناء / D يمكن استخدامها. وأخيرا، تقنية LFFM لدينا تنوعا للغاية ويمكن تكييفها لتسجيل من أكثر من منطقة. إضافة الخائن شعاع في مسار الضوء يسمح لنا لتقسيم الضوء إلى اثنين من الألياف البصرية. كل الألياف الضوئية ومن ثم يمكن وضعها على مناطق مختلفة من الأنسجة ل، بشكل مستقل، والإثارة وانبعاث سجل من تحقيقات الفلورسنت الخارجية. يسمح هذا التعديل لنا لتقييم مدى الاختلافات الإقليمية تشريحية التأثير على المتغيرات الفسيولوجية. ويبين الشكل 3 الخائن شعاع التي يجري استخدامها لتقسيم ضوء الإثارة CW تستخدم مثل أن اثنين من الألياف الضوئية لقياس بطريق داخل الخلايا الكهربائية أو [كا 2+] مستويات الذكاءح قاصر-الغازية. إشارات بطريق يمكن تسجيلها عن طريق وضع الألياف واحد على البطانة والآخر على طبقة النخاب الجدار البطيني. ولذلك، فإن تقنية LFFM لديه القدرة على قياس مدار الساعة من الإشارات الخلوية في مناطق مختلفة، ويمكن استخدامها لاختبار إذا تحدث التغييرات الإقليمية في إطار الحالات المرضية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hyrdoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2um nylon membrane filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7402-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold MPP</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0216&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G1.5 Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)</td>
			<td>AllMech Tech</td>
			<td>LOOK-SP105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection 1000USP/mL</td>
			<td>AllMech Tech</td>
			<td>NDC63323-540-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO D8779</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>856925-71-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 20% solution</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>59004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materflex C/L peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>77122-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isostim stimulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>A320RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform generator</td>
			<td>Teledyne Lecroy</td>
			<td>WaveStation 2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1533530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing ID:1/32&#34; OD:3/32&#34; Wall 1/32&#34;</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing ID:3/32&#34; OD:5/32&#34; Wall 1/32&#34;</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>TET-094A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter luer lock to 3-way valve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-31200-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tee adapters and plastic fittings</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic clamp</td>
			<td>WaterZoo</td>
			<td>2465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TE-127-2.0-2.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Fluo-4AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M14206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acupunture needles</td>
			<td>LHASA</td>
			<td>TC1.20x13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mL BD syringe with luer-lok</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed vacuum Eppendorf Vagufuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-748-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital signal processing circuit DSP TMS 320</td>
			<td>Texas Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass Dichroic mirror 567nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>DMLP567L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>Stock# 33-437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>Stock# 33-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass colored glass filter 590 nm&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>FGL590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator for laser</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MX130R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode fiber optic 200&#181;m NA 0.39</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>FT200UMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEDs blue</td>
			<td>Lumileds</td>
			<td colspan="2">L135-B475003500000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEDs green</td>
			<td>Lumileds</td>
			<td colspan="2">L135-G525003500000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cube beam splitter, non-polarizing</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BS007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36&#34; Length, Dovetail Optical Rail</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>54-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5&#34; Width, Dovetail Carrier</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>54-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75&#34; Travel, micrometer stage</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>37-983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail optical rail 3&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RLA075/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail rail carrier 1&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode Helix 902</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>HELIX-902-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective holder XY Translator&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>ST1XY-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum breadboard 6&#34;x6&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MB6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexus otpical table 4&#39;x6&#39;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>T46HK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel cap screws</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>HW-KIT5/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic&#160; sheet</td>
			<td>Home Depot/Lowes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy gel&#160;</td>
			<td>Walmart/Home Depot</td>
			<td>2-part 5 min clr 1oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G1.5 Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base, 25mmx75mmx10mm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BA1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire shelve posts 36&#34;</td>
			<td>Alera</td>
			<td>AALESW59PO36SR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire shelves</td>
			<td>Alera</td>
			<td>ALESW582424SR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post and angle clamp</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC/M-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe for dye chamber</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W851020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper</td>
			<td>Home Science Tools</td>
			<td>CE-STOP01C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

local field fluorescence microscopy: imaging cellular signals in intact hearts

في القلب، وعادة ما تكون أداء دراسات الإشارات الجزيئية في myocytes معزولة. ومع ذلك، فإن العديد من الحالات المرضية مثل نقص التروية وعدم انتظام ضربات القلب لا يمكن إلا أن يكون مفهوما بشكل كامل على مستوى الجهاز كله. هنا، نقدم هذه التقنية باستخدام التحليل الطيفي للالمحلي مضان الحقل المجهري (LFFM) التي تسمح للقياس الإشارات الخلوية في قلب سليمة. وتستند هذه التقنية على مزيج من القلب perfused Langendorff والألياف البصرية لتسجيل إشارات الفلورسنت. LFFM لها تطبيقات مختلفة في مجال علم وظائف الأعضاء القلب والأوعية الدموية لدراسة القلب في الظروف العادية والمرضية. يمكن رصد المتغيرات القلب متعددة باستخدام المؤشرات الفلورسنت مختلفة. وتشمل هذه عصاري خلوي [كا 2+]، داخل الهيولى العضلية شبكية [كا 2+] وإمكانات الغشاء. تحقيقات الفلورسنت الخارجية متحمسون ومضان المنبعثة الكشف مع ثلاثة ترتيبات مختلفة من تقنية LFFM epifluorescenceق الواردة في هذه الورقة. الخلافات المركزية بين هذه التقنيات هي نوع من مصدر الضوء المستخدمة في الإثارة وعلى طريقة التضمين ضوء الإثارة. وLFFM نابض (PLFFM) يستخدم نبضات ضوء الليزر بينما موجة مستمرة LFFM (CLFFM) يستخدم ضوء الليزر المستمر للإثارة. وأخيرا، تم استخدام الضوء الثنائيات (المصابيح) كمصدر الضوء الثالث. ويسمى هذا الترتيب غير متماسك نابض المجهر مضان LED (PLEDFM).

ا ف ب والكالسيوم 2+ العابرين في البطانة والنخاب من أجل مقارنة الإشارات عبر جدار البطين، يتم وضع الألياف البصرية واحد في البطانة والآخر في النخاب. مقارنة مورفولو?...

Watch this Scientific Journal Video about Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts at JoVE.com

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

في القلب، والأحداث الجزيئية تنسيق وظيفة الكهربائية ومقلص من الجهاز. وهناك مجموعة من تقنيات المجهر مضان ميدانية محلية المعروضة هنا يمكن تسجيل المتغيرات الخلوية في قلوب سليمة. تحديد آليات تحديد وظيفة القلب أمر بالغ الأهمية في فهم الكيفية التي يعمل بها القلب في حالات المرضية.

محلي الميدان مضان المجهر: التصوير الإشارات الخلوية في قلوب سليمة

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

التصوير خلايا الثدييات على المدى الطويل باستخدام الميكروسكوب واسعة الميدانية

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

إيماس التصوير في خلايا الشبكية مع القطبين الميكروسكوب TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

في التصوير من يرقات ذبابة الفاكهة فيفو سليمة الفرعية الخلوية في القرار

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

التحليل السريع واستكشاف الإسفار الميكروسكوب الصور

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

جنبا إلى جنب تجميد الضغط العالي والسريع تجميد استبدال الأنسجة النباتية للنقل المجهر الإلكتروني

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

التصوير المحلية الكالسيوم<sup&gt; 2+</sup&gt; الإشارات في خلايا الثدييات مثقف

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

الخلوية الأكسدة التنميط باستخدام عالية المحتوى المجهري

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...