Name: local field fluorescence microscopy: imaging cellular signals in intact hearts
Uploaded: 2017-03-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts at JoVE.com

אנו מודים לד&quot;ר אלישיה Mattiazzi לדיון ביקורתי של העבודה הציגה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מ- NIH (R01 HL-084,487) כדי ALE.

פרוטוקול זה וכל הטיפול בעכברים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי UC מרסד ועדת שימוש (מס &#39;2008-201). ניסויים עם תוכים נערכו בשנת 1999 בהתאם למדיניות כללית לשימוש בעלי חיים שהוקם על ידי הוועדה המדעית של מכון ונצואלה למחקר מדעי (Ivic). 1. L...

<ol>
	<li>Fabiato, A., Fabiato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractions+induced+by+a+calcium-triggered+release+of+calcium+from+the+sarcoplasmic+reticulum+of+single+skinned+cardiac+cells.">Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells.</a> J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).</li><li>Mitra, R., Morad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+uniform+enzymatic+method+for+dissociation+of+myocytes+from+hearts+and+stomachs+of+vertebrates.">A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates.</a> Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).</li><li>Escobar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+of+intracellular+Ca2++transients+in+beating+rat+hearts.">Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).</li><li>Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+Heart+Loose+Patch+Photolysis+Reveals+Ionic+Current+Kinetics+During+Ventricular+Action+Potentials.">Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials.</a> Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).</li><li>Mitra, R., Morad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+uniform+enzymatic+method+for+dissociation+of+myocytes+from+hearts+and+stomachs+of+vertebrates.">A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates.</a> Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).</li><li>Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channel+currents+during+spontaneous+action+potentials+in+embryonic+chick+heart+cells.+The+action+potential+patch+clamp.">Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp.</a> Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).</li><li>Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profile+of+L-type+Ca(2+)+current+and+Na(+)/Ca(2+)+exchange+current+during+cardiac+action+potential+in+ventricular+myocytes.">Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes.</a> Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).</li><li>Apkon, M., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+two+distinct+depolarization-activated+K++currents+in+isolated+adult+rat+ventricular+myocytes.">Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes.</a> J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).</li><li>Valverde, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Ca2++depletion+of+the+sarcoplasmic+reticulum+at+the+onset+of+reperfusion.">Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion.</a> Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).</li><li>Valverde, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholamban+phosphorylation+sites+enhance+the+recovery+of+intracellular+Ca2++after+perfusion+arrest+in+isolated,+perfused+mouse+heart.">Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart.</a> Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).</li><li>Escobar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+in+the+regulation+of+ventricular+Ca(2+)+signaling+in+intact+mouse+heart.">Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).</li><li>Mej&#237;a-Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+local-field+fluorescence+microscopy:+a+new+approach+for+measuring+cellular+signals+in+the+beating+heart.">Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart.</a> Pfl&#252;gers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).</li><li>Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++release+underlies+the+development+of+phase+2+in+mouse+ventricular+action+potentials.">Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).</li><li>Kornyeyev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calsequestrin+2+deletion+shortens+the+refractoriness+of+Ca2++release+and+reduces+rate-dependent+Ca2+-alternans+in+intact+mouse+hearts.">Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).</li><li>Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++Sparks+and+Ca2++waves+are+the+subcellular+events+underlying+Ca2++overload+during+ischemia+and+reperfusion+in+perfused+intact+hearts.">Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts.</a> J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).</li><li>Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+Ca(2+)+content+regulates+intracellular+Ca(2+)+release+in+subepicardial+myocytes+of+intact+beating+mouse+hearts:+effect+of+exogenous+buffers.">Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).</li><li>Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+differences+between+guinea+pig+atrial+endocardium+and+epicardium:+evidence+for+a+role+of+Ito.">Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito.</a> Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).</li><li>Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+bases+for+electrophysiological+distinctions+among+epicardial,+midmyocardial,+and+endocardial+myocytes+from+the+free+wall+of+the+canine+left+ventricle.">Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle.</a> Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).</li><li>Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+outward+current+prominent+in+canine+ventricular+epicardium+but+not+endocardium.">Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium.</a> Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).</li><li>Lukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+of+Myocardial+Cells+in+the+Epicardial,+Midmyocardial,+and+Endocardial+Layers+of+the+Ventricle.">Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle.</a> J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).</li><li>Antzelevitch, C., Fish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+heterogeneity+within+the+ventricular+wall.">Electrical heterogeneity within the ventricular wall.</a> Basic Res Cardiol. 96 (6), 517-527 (2001).</li><li>Gomez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+electrical+heterogeneity+by+compensated+hypertrophy+in+rat+left+ventricle.">Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle.</a> Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).</li><li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+in+optical+imaging:+looking+inside+the+heart.">Innovation in optical imaging: looking inside the heart.</a> Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).</li><li>Boukens, B. J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+optocardiography.">A century of optocardiography.</a> IEEE Rev Biomed Eng. 7, 115-125 (2014).</li><li>Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+membrane+potential+and+epicardial+deformation+in+beating+hearts.">Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts.</a> Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).</li></ol>

מאמר זה הוא מרוכז בתיאור טכניקות קרינה בשדה מקומית יש להעריך את הפונקציה של myocytes לב vivo לשעבר. המחקר של תאים אלה בסביבת מצמידים הוא לא רק יותר פיסיולוגי, אך הוא גם מאוד מתאים לבחון פתולוגיות איבר-רמה. האירועים הסלולר הבסיסיים צימוד עירור-התכווצות (ECC) ניתן להעריך ב?...

הלב הוא האיבר המרכזי של מערכת הלב וכלי הדם. ההתכווצות של הלב היא שיזמה גידול תאי [Ca 2 +]. הקשר בין רגישויות חשמל שינויים במהדורה תאית Ca 2 + נחקרת הסטורית בתאים ניתקים enzymatically 1, 2. עם זאת, תאי לב הם חשמליים, מבחינת מטבולית מכאנית מצמידים 3, 4. כאשר מבודד, myocytes הם לא רק פיזי זוגיים, אבל מיוציטים משכבות שונות מעורבבים במהלך דיסוציאציה 5. יתר על כן, למרות היתרונות העצומים שהתפתחו מהמחקר של תאים מבודדים בתנאים מהדקים מתח, 6, 7, 8 ערך מהותו של הלב בתור alwa syncytium חשמלys מציב את השאלה: כיצד מבחינה תפקודית שונים תאים ניתקו מן הנוכחים בתוך הרקמה 3. בכתב היד הזה, אנו מתארים את ההתקדמות שהושגה ידיעת הפיסיולוגיה של לב על ידי השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה המקומי (LFFM) טכניקות בלב השלם. LFFM משתמשת אינדיקטורים ניאון כדי למדוד משתנים פיזיולוגיים רבים כגון Ca cytosolic 2+, הרטיקולום sarcoplasmic התוך (SR) Ca 2 + פוטנציאל הממברנה. מדידות אלו ניתן לקבל בו זמנית בשיתוף עם חדרית לחץ 9, 10, אק&quot;ג 9, פוטנציאל פעולת חשמל (APS), קלטות זרם יוניות ו photolysis פלאש של תרכובות בכלוב 4, 11. בנוסף, מדידות אלה ניתן להשיג על ידי צעדה בלב שלם בתדרים גבוהים יותר קרובr ל פיזיולוגיים. למרות כמה מאמרים 9, 11, 12, 13, 14 פורסמו על ידי הקבוצה שלנו באמצעות טכניקות LFFM, חזק מורכבות טכנית הקשורים הטכניקה הזו מנעה השימוש המסיבי שלה לחקר תופעות פיסיולוגיות vivo לשעבר בלב ובאיברים אחרים. טכניקת LFFM (איור 1) מבוססת על מדידות epifluorescence שהושגו באמצעות סיב אופטי multimode במגע עם הרקמות. כמו כל טכניקת דימות פלואורסצנטי קשר, ברזולוציה האופטית תלויה בקוטר ואת הצמצם המספרי (NA) של הסיבים. &#39;גבוה NA וקטנה בקוטר של הסיבים יגדיל את הרזולוציה המרחבית של המדידות. NAS ובקטרי סיבים יכולים לנוע בין 0.22 ל 0.66 מ 50 מיקרומטר 1 מ&quot;מ, בהתאמה. במקמט את NA ישפר את יחס האות לרעש (S / N) על ידי קבלת פוטונים המגיעים מזווית מוצקה גדולה. כדי לפעול כהתקן epifluorescence, קרן האור ממוקדת לתוך הסיב האופטי עם עדשה אספריים או אובייקטיבי epifluorescence שבו NA של העדשה ואת משחק הסיבים. התאמה זה ממקסם את העברת האנרגיה עבור עירור לאיסוף חזרה הפוטונים הנפלטים על ידי fluorophore. כדי להלהיב את האינדיקטורים פלורסנט אקסוגניים טעונים בתוך הרקמה, מקורות אור שונים מצבי תאורה יכולים להיות מנוצלים. המחקרים החלוציים שלנו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה המקומי פעם 3, 12 (PLFFM) העסיקו ליזר picosecond בעלות נמוכה (איור 1 א, PLFFM). סוג זה של מקור אור יש יתרון ענק של מרגש חלק גדול של מולקולות fluorophore מתחת לאזור תאורה ללא משמעותית הלבנת לצבוע בשללדופק קצר משכי 12. בנוסף, השימוש של פולסים אולטרה אפשר ההערכה של חי הקרינה של הצבע 12. אורך חיי הקרינה הוא נכס שיכול לשמש כדי לכמת את החלק היחסי של מולקולות צבע חייבות Ca 2 +. למרבה הצער, jittering הזמני של פולסים ווריאציות משרעת מן הדופק אל הדופק להגביל את היישום של האסטרטגיה ניסיוני זה אך ורק למקרים בהם שינוי הקרינה המיוצר על ידי ליגנד מחייב לצבוע גדול. לייזרי גל מתמשכים (CW) משמשים בדרך כלל כמקור התאורה העיקרי LFFM (1b, CLFFM). קרן הלייזר יכול להאיר את רקמת ברציפות או יכול להיות מווסתת ferroelectrically. אפנון ferroelectric של הקרנות מאפשר הדור של פולסים המיקרו של אור. ניתן לשלוט אפנון זה על ידי חומרה חיצונית. נוהל זה לא רק מפחיתה באופן דרמטי tהוא jittering הזמני של להבזקי האור אלא גם מאפשר ערבוב קורות באורכי גל שונים. הערבוב של קורות נעשה על ידי ריבוב קרני לייזרים שונים. כתוצאה מכך, צבעים מרובים בעלי תכונות ספקטרליות שונות יכול להיות נרגש לבצע מדידות של מגוון משתנים פיזיולוגיים, למשל, רוד-2 עבור cytosolic Ca 2 +, MagFluo4 עבור Ca התוך-SR 2 + ו di-8-ANEPPS עבור פוטנציאל הממברנה. למרות לייזרים הנוכחי יתרונות שונים כמקור אור LFFM, סוגים אחרים של מקורות אור ניתן להשתמש כולל דיודות פולטות אור (LEDs). במקרה זה, מקור אור עירור כלל LED InGaN (איור 1 ג &#39;, PLEDFM). נוריות, פוטונים נפלטים באופן ספונטני כאשר אלקטרונים בפס ההולכה להשתלב מחדש עם חורים פס הערכיות. ההבדל עם לייזרים של מצב מוצק הוא כי הפליטה אינה מגורה על ידי פוטונים אחרים. התוצאה היא קרן בלתי קוהרנטיתפליטת ספקטרליים רחבה יותר עבור נוריות. ניתן להשתמש בסוגים שונים של נוריות חשמל גבוהות. עבור הקלטות AP באמצעות Di-8-ANEPPS ועבור Ca 2 + הארעיים להקליט באמצעות Fluo-4 או מג-Fluo-4, השתמשנו LED בעל פליטת שיא טיפוסי בבית 485 ננומטר (כחול) ברוחב חצי של 20 ננומטר (איור 1D). עבור 2 + ארעי Ca מוקלט עם רוד-2, הנורית הייתה פליטת שיא אופיינית ב 540 ננומטר (ירוק) ברוחב חצי 35 ננומטר (איור 1 ד). נוריות פולטות באורך גל להקה ולכן דורשות במסננים כדי לצמצם פליטת ספקטרליים שלהם. בנוסף, אור פעמו יכול להיווצר בשיעור של 1.6 kHz עם משך 20 מיקרו-שניות. נוריות היו פעמו עם טרנזיסטור אפקט שדה MOSFET כוח מהר. ניתן לבצע הקלטות סימולטני עם אינדיקטורים שונים על ידי ריבוב זמן הנוריות. למרבה הצער, האור הנפלט על ידי נוריות הוא יותר קשה להתמקד על גבי סיבים אופטיים לעומת קרן לייזר. לפיכך, החיסרון העיקרי מאיתנוing נוריות הוא כי פרופילי הפליטה שלהם יש התקות זוויתי (± 15 °) מהציר הראשי, וכן אופטי עזרו חייב לשמש כדי לתקן את זה. בכל התצורות האופטיות שתוארו לעיל, אור העירור משתקף בעזרת מראה dichroic. אלומת האור ממוקד בהמשך על ידי עדשה אספריים לבין מטרה מיקרוסקופ על גבי סיבים אופטיים multimode כי היא ממוצבת על הרקמה. כמו בכל הסדר epifluorescence, המראה dichroic משמש גם כדי להפריד בין עירור מן האור הנפלט. ספקטרום האור הנפלט נוסע בחזרה דרך פילטר מחסום כדי להסיר כל עירור משתקף. לבסוף, האור הנפלט מתמקד עם מטרה על גבי photodetector (איור 1). התמר מאור הזרם חשמלי מבוצעת על ידי פוטודיודות מפולת סיליקון. יש דיודות אלה תגובה מהירה ורגישות גבוהה המאפשרת זיהוי באור נמוך. הפוטונים המיוצרים על ידי פוטודיודות המפולת יכולים להיות מוגברים בשתי דרכים: מגבר transimpedance שיש אלמנט משוב resistive (1e איור) או על ידי אינטגרטור להמיר זרם אל (1F איור) מתח. השימוש בגישה הראשונה, מתח המוצא הוא יחסי הפוטונים ואת נגד המשוב. דוגמה טיפוסית של זיהוי התנגדות של פעימות לייזר picosecond מוצג דמויות 2a, 2b ו 2c. 2a הלוח ממחיש את הפלט של מגבר transimpedance ו -2 לוח מציג התרחבות זמן של המרווח המסומנים בכוכבית (*). אלגוריתם מעקב שיא יושם כדי לזהות את השיא (אדום) ובסיס (ירוק) עבור התגובות פלורסנט 12. מדידת קרינת הבסיס מספקת מידע הן של הזרם האפל של photodiode המפולת ואת הפרעות שהנהיג lig הסביבהht צימוד אלקטרומגנטי. ייצוג של פסגות ובסיסים מוצג איור 2 ג. נתון זה ממחיש את הקרינה הנפלטת לצבוע (Rhod-2) כבול Ca 2+ במהלך מחזור הלב של לב תוכי מכות. בשיטה השנייה, מתח המוצא של האינטגרטור היא פונקציה של המשוב הנוכחי קיבולי (איורים 2, 2e, ו 2f). איור 2f מציג שני מחזורי אינטגרציה רצופים: ראשון ללא וחיצונית שנייה עם להבזקי אור שימושיים מתוך LED פעם. תיאור מפורט מוצג 2G דמויות 2h. גישה זו, אם כי מייגע יותר, מספקת S גדול / N בשל היעדר רעש תרמי קבל המשוב. המכשיר כולל שלב עיתוי שיוצר כל המלאה ריבוב של אור העירור ופקודות שילוב headstage מילet תקופות. זה מבוצע בדרך כלל עם מעגל עיבוד אות דיגיטלי כי גם מבצע בידול דיגיטלי של אות המוצא המשולבת באמצעות חישוב רגרסיה on-line של הנתונים. במקרה של שימוש משוב resistive, בכל ועדת רכישת A / D ניתן להשתמש. לבסוף, טכניקת LFFM שלנו היא תכליתיות מאוד יכולה להיות מותאמת כדי להקליט יותר באזור אחד. הוספת מפצל אלומת נתיב האור מאפשרת לנו לפצל את האור לשתי סיבים אופטיים. כל סיב אופטי ניתן למקם ואילך באזורים שונים של רקמות, באופן עצמאי, לרגש פליטת שיא מן בדיקות ניאון אקסוגניים. שינוי זה מאפשר לנו להעריך כיצד הבדלים אזוריים אנטומיים להשפיע משתנים פיזיולוגיים. איור 3 מראה ספליטר הקורה להיות מועסק לפצל את אור עירור CW כך שני סיבים אופטיים משמשים למדידה או תאיים חשמל transmural [Ca 2 +] שנינות רמותh-הפולשנות קטין. אותות transmural ניתן להקליט על ידי הנחת סיב אחד על endocardium והשני על השכבה epicardium של קיר החדר. לכן, טכניקת LFFM יש את היכולת למדוד את מהלך הזמן של אותות סלולריים באזורים שונים וניתן להשתמש בו כדי לבדוק אם שינויים אזוריים להתרחש תחת מצבים פתולוגיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hyrdoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2um nylon membrane filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7402-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold MPP</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0216&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G1.5 Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)</td>
			<td>AllMech Tech</td>
			<td>LOOK-SP105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection 1000USP/mL</td>
			<td>AllMech Tech</td>
			<td>NDC63323-540-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO D8779</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>856925-71-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 20% solution</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>59004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materflex C/L peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>77122-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isostim stimulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>A320RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform generator</td>
			<td>Teledyne Lecroy</td>
			<td>WaveStation 2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1533530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing ID:1/32&#34; OD:3/32&#34; Wall 1/32&#34;</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing ID:3/32&#34; OD:5/32&#34; Wall 1/32&#34;</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>TET-094A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter luer lock to 3-way valve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-31200-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tee adapters and plastic fittings</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic clamp</td>
			<td>WaterZoo</td>
			<td>2465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TE-127-2.0-2.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Fluo-4AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M14206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acupunture needles</td>
			<td>LHASA</td>
			<td>TC1.20x13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mL BD syringe with luer-lok</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed vacuum Eppendorf Vagufuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-748-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital signal processing circuit DSP TMS 320</td>
			<td>Texas Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass Dichroic mirror 567nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>DMLP567L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>Stock# 33-437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>Stock# 33-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass colored glass filter 590 nm&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>FGL590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator for laser</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MX130R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode fiber optic 200&#181;m NA 0.39</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>FT200UMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEDs blue</td>
			<td>Lumileds</td>
			<td colspan="2">L135-B475003500000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEDs green</td>
			<td>Lumileds</td>
			<td colspan="2">L135-G525003500000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cube beam splitter, non-polarizing</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BS007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36&#34; Length, Dovetail Optical Rail</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>54-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5&#34; Width, Dovetail Carrier</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>54-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75&#34; Travel, micrometer stage</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>37-983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail optical rail 3&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RLA075/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail rail carrier 1&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode Helix 902</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>HELIX-902-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective holder XY Translator&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>ST1XY-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum breadboard 6&#34;x6&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MB6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexus otpical table 4&#39;x6&#39;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>T46HK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel cap screws</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>HW-KIT5/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic&#160; sheet</td>
			<td>Home Depot/Lowes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy gel&#160;</td>
			<td>Walmart/Home Depot</td>
			<td>2-part 5 min clr 1oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G1.5 Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base, 25mmx75mmx10mm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BA1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire shelve posts 36&#34;</td>
			<td>Alera</td>
			<td>AALESW59PO36SR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire shelves</td>
			<td>Alera</td>
			<td>ALESW582424SR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post and angle clamp</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC/M-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe for dye chamber</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W851020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper</td>
			<td>Home Science Tools</td>
			<td>CE-STOP01C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

local field fluorescence microscopy: imaging cellular signals in intact hearts

בלב, מחקרי איתות מולקולריים בדרך כלל מבוצעים מיוציטים מבודדים. עם זאת, במצבים פתולוגיים רבים כגון איסכמיה והפרעות קצב ניתן רק מובנים לחלוטין ברמת האיבר השלמה. כאן, אנו מציגים טכניקה ספקטרוסקופיות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה המקומי (LFFM) המאפשר מדידת אותות סלולריים בלב שלם. הטכניקה מבוססת על שילוב של לב perfused Langendorff וסיבים אופטיים להקליט אותות ניאון. יש LFFM יישומים שונים בתחום הפיזיולוגיה הלב וכלי הדם ללמוד את הלב בתנאים נורמליים ופתולוגיים. משתנה לב מרובה ניתן לנטר באמצעות אינדיקטורים ניאון שונים. אלה כוללים cytosolic [Ca 2 +], הרטיקולום תוך sarcoplasmic [Ca 2 +] ופוטנציאלים הממברנה. בדיקות ניאון אקסוגניים נרגשות הקרינה הנפלטת מזוהית עם שלושה הסדרים שונים של טכניקת LFFM epifluorescenceהם מובאים במאמר זה. ההבדלים המרכזיים בין הטכניקות האלה הם הסוג של מקור אור המשמש עירור ובדרך אור העירור היא מווסתת. LFFM פעם (PLFFM) משתמש פעימות ליזר אור בעוד LFFM גל מתמשך (CLFFM) משתמש באור הליזר רציף עבור עירור. לבסוף, דיודות פולטות אור (LEDs) שימשו כמקור האור השלישי. סדר אי-קוהרנטי זה נקרא מיקרוסקופ פלואורסצנטי LED פעם (PLEDFM).

AP ו Ca 2 + ארעי ב endocardium ו epicardium על מנת להשוות אותות ברחבי קיר החדר, סיב אופטי אחד ממוקם ב endocardium ואת האחרים epicardium. השוואת המורפולוגיה של AP שנרשם בגין endocardium עם אחד מן ...

Watch this Scientific Journal Video about Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts at JoVE.com

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

בלב, אירועים מולקולריים לתאם את פונקצית חשמל התכווצות של האיבר. סט של טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה מקומיות הציגו כאן מאפשר ההקלטה של ​​משתני הסלולר לבבות שלמים. זיהוי מנגנונים בהגדרת תפקוד הלב הוא קריטי להבנה כיצד הלב עובד תחת מצבים פתולוגיים.

בשדה מקומי מיקרוסקופ פלואורסצנטי: הדמיה איתותי הסלולר לבבות שלמים

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

לטווח ארוך הדמיה בתאי יונקים באמצעות מיקרוסקופית שדה רחב

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

הדמיה Exocytosis בתאים עם הפרעה דו רשתית מיקרוסקופית TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

התאוששות נייד באמצעות פרופילים תוכן גבוהה מיקרוסקופית

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...