Name: local field fluorescence microscopy: imaging cellular signals in intact hearts
Uploaded: 2017-03-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts at JoVE.com

Vi takker Dr. Alicia Mattiazzi for kritisk diskusjon av de presenterte arbeidet. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra NIH (R01 HL-084487) til ALE.

Denne protokollen og alle mus håndtering ble godkjent av UC Merced Institutional Animal Care og bruk Committee (No. 2008-201). Eksperimenter med parakitter ble gjennomført i 1999 i henhold til generelle retningslinjer for bruk av dyr etablert av den vitenskapelige provisjon av den venezuelanske Institute for Scientific Research (Ivic). 1. Langendorff Set Up Forberedelse <ol><li> Fremstille Tyrode-oppløsning inneholdende følgende oppløste konsentrasjoner i mM: 140 NaCl, 5,4 KCl, 2 <sub...

<ol>
	<li>Fabiato, A., Fabiato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractions+induced+by+a+calcium-triggered+release+of+calcium+from+the+sarcoplasmic+reticulum+of+single+skinned+cardiac+cells.">Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells.</a> J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).</li><li>Mitra, R., Morad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+uniform+enzymatic+method+for+dissociation+of+myocytes+from+hearts+and+stomachs+of+vertebrates.">A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates.</a> Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).</li><li>Escobar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+of+intracellular+Ca2++transients+in+beating+rat+hearts.">Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).</li><li>Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+Heart+Loose+Patch+Photolysis+Reveals+Ionic+Current+Kinetics+During+Ventricular+Action+Potentials.">Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials.</a> Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).</li><li>Mitra, R., Morad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+uniform+enzymatic+method+for+dissociation+of+myocytes+from+hearts+and+stomachs+of+vertebrates.">A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates.</a> Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).</li><li>Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channel+currents+during+spontaneous+action+potentials+in+embryonic+chick+heart+cells.+The+action+potential+patch+clamp.">Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp.</a> Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).</li><li>Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profile+of+L-type+Ca(2+)+current+and+Na(+)/Ca(2+)+exchange+current+during+cardiac+action+potential+in+ventricular+myocytes.">Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes.</a> Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).</li><li>Apkon, M., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+two+distinct+depolarization-activated+K++currents+in+isolated+adult+rat+ventricular+myocytes.">Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes.</a> J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).</li><li>Valverde, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Ca2++depletion+of+the+sarcoplasmic+reticulum+at+the+onset+of+reperfusion.">Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion.</a> Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).</li><li>Valverde, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholamban+phosphorylation+sites+enhance+the+recovery+of+intracellular+Ca2++after+perfusion+arrest+in+isolated,+perfused+mouse+heart.">Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart.</a> Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).</li><li>Escobar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+in+the+regulation+of+ventricular+Ca(2+)+signaling+in+intact+mouse+heart.">Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).</li><li>Mej&#237;a-Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+local-field+fluorescence+microscopy:+a+new+approach+for+measuring+cellular+signals+in+the+beating+heart.">Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart.</a> Pfl&#252;gers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).</li><li>Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++release+underlies+the+development+of+phase+2+in+mouse+ventricular+action+potentials.">Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).</li><li>Kornyeyev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calsequestrin+2+deletion+shortens+the+refractoriness+of+Ca2++release+and+reduces+rate-dependent+Ca2+-alternans+in+intact+mouse+hearts.">Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).</li><li>Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++Sparks+and+Ca2++waves+are+the+subcellular+events+underlying+Ca2++overload+during+ischemia+and+reperfusion+in+perfused+intact+hearts.">Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts.</a> J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).</li><li>Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+Ca(2+)+content+regulates+intracellular+Ca(2+)+release+in+subepicardial+myocytes+of+intact+beating+mouse+hearts:+effect+of+exogenous+buffers.">Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).</li><li>Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+differences+between+guinea+pig+atrial+endocardium+and+epicardium:+evidence+for+a+role+of+Ito.">Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito.</a> Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).</li><li>Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+bases+for+electrophysiological+distinctions+among+epicardial,+midmyocardial,+and+endocardial+myocytes+from+the+free+wall+of+the+canine+left+ventricle.">Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle.</a> Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).</li><li>Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+outward+current+prominent+in+canine+ventricular+epicardium+but+not+endocardium.">Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium.</a> Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).</li><li>Lukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+of+Myocardial+Cells+in+the+Epicardial,+Midmyocardial,+and+Endocardial+Layers+of+the+Ventricle.">Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle.</a> J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).</li><li>Antzelevitch, C., Fish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+heterogeneity+within+the+ventricular+wall.">Electrical heterogeneity within the ventricular wall.</a> Basic Res Cardiol. 96 (6), 517-527 (2001).</li><li>Gomez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+electrical+heterogeneity+by+compensated+hypertrophy+in+rat+left+ventricle.">Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle.</a> Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).</li><li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+in+optical+imaging:+looking+inside+the+heart.">Innovation in optical imaging: looking inside the heart.</a> Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).</li><li>Boukens, B. J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+optocardiography.">A century of optocardiography.</a> IEEE Rev Biomed Eng. 7, 115-125 (2014).</li><li>Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+membrane+potential+and+epicardial+deformation+in+beating+hearts.">Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts.</a> Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).</li></ol>

Dette papiret er sentrert i beskriver lokale felt fluorescens teknikker for å evaluere funksjonen av hjertemuskelceller ex vivo. Studiet av disse cellene i en koplet miljø er ikke bare mer fysiologiske, men er også svært egnet for vurdering av organ-nivå patologier. De cellulære hendelser som ligger til grunn eksitasjons-kontraksjon kobling (ECC) kan evalueres ved hele organet nivå med bruk av molekylære prober som overvåker intracellulære Ca2 + dynamikk (Rhod 2 cytosolisk Ca2 +,...

Hjertet er det sentrale organet i det kardiovaskulære systemet. Hjertets sammentrekning blir initiert ved en økning i intracellulær [Ca2 +]. Forholdet mellom elektrisk oppstemthet og endringer i intracellulær Ca 2+ utgivelsen har vært historisk studert i enzymatisk dissosierte celler 1, 2. Imidlertid, hjerteceller er elektrisk, metabolisk og mekanisk forbundet tre, fire. Når isolert, myocytes er ikke bare fysisk frakoplet, men myocytter fra forskjellige lag blandes i løpet av 5 dissosiasjon. Videre, til tross for de enorme fordelene som har dukket opp fra studiet av isolerte celler under spenning klemme forhold, 6, 7, 8 den iboende natur av hjertet som en elektrisk syncytium Always stiller spørsmålet om hvordan funksjonelt forskjellige dissosiert celler fra de som er tilstede i vevet tre. I dette manuskriptet, beskriver vi fremskritt oppnådd i kunnskapen om hjertefysiologi ved bruk av lokale feltet fluorescens mikroskopi (LFFM) teknikker i intakt hjerte. LFFM bruker fluorescerende indikatorer for å måle flere fysiologiske variabler som cytosolic Ca 2+, intra sarcoplasmic retikulum (ER) Ca 2+ og membranpotensialet. Disse målingene kan fås samtidig og i forbindelse med ventrikkel press 9, 10, elektro 9, elektriske aksjonspotensialer (APS), ioniske dagens opptak og flash fotolyse av bur forbindelser 4, 11. I tillegg kan disse målingene oppnås ved pacing det intakte hjertet ved høyere frekvenser nærr til fysiologiske priser. Selv om flere artikler 9, 11, 12, 13, 14 har blitt publisert av vår gruppe ved hjelp LFFM teknikker, har den antagelse av tekniske kompleksiteten knyttet til denne teknikken hindret sin massive bruk i å studere ex vivo fysiologiske fenomener i hjertet og andre organer. Den LFFM teknikk (figur 1) er basert på epifluorescens målinger oppnådd ved bruk av et multimodus optisk fiber er i kontakt med vevet. Som enhver kontakt fluorescens avbildningsteknikk avhenger den optiske oppløsning av diameteren og den numeriske apertur (NA) av fiberen. En høyere NA og mindre diameter av fiberen vil øke den romlige oppløsningen av målingene. NAS og fiberdiametere kan ligge i området 0,22 til 0,66 og fra 50 um til 1 mm, henholdsvis. Iskarpe bretter på NA vil forbedre signal-til-støy-forholdet (S / N) ved å ta imot fotoner som kommer fra en større romvinkel. For å virke som en epifluorescens-enhet, blir lysstrålen fokuseres til den optiske fiberen med en asfærisk linse eller et epifluorescens objektiv der NA av linsen og fiber match. Dette passer maksimerer energioverføringen for eksitasjon og for oppsamling tilbake fotonene som utsendes av fluoroforen. For å opphisse eksogene fluorescerende indikatorer som er lagt i vevet, kan forskjellige lyskilder og belysningsmoduser utnyttes. Våre banebrytende studier med puls lokale feltet fluorescens mikros 3, 12 (PLFFM) ansatt en lav-kost picosecond laser (Figur 1a, PLFFM). Denne type lyskilde har den store fordelen av spennende en stor del av fluoroformolekyler under belysning område uten vesentlig bleking fargestoff grunnav den korte pulsvarigheter 12. I tillegg er bruken av Ultra pulser tillot evaluering av fluorescens levetid av fargestoffet 12. Fluorescens levetid er en egenskap som kan brukes til å kvantifisere brøkdel av fargestoffmolekyler bundet til Ca 2+. Dessverre har den temporale jittering av pulsene og variasjoner i amplitude fra puls-til-puls begrense anvendelsen av denne eksperimentelle strategien til tilfeller hvor endringen i fluorescens som produseres av ligand binding til fargestoffet er stor. Kontinuerlig bølge (CW) lasere er vanligvis brukt som den viktigste belysning kilde i LFFM (Figur 1b, CLFFM). Laserstrålen kan kontinuerlig belyse vev eller kan ferroelectrically modulert. Den ferroelektriske modulering av strålen tillater generering av mikrosekunders pulser av lys. Denne modulasjon kan styres av ytre maskinvare. Denne prosedyren reduserer ikke bare dramatisk than temp jittering av lyspulser men tillater også blande bjelker av forskjellige bølgelengder. Blandingen av bjelkene gjøres ved multipleksing av stråler fra forskjellige lasere. Som en konsekvens, kan flere fargestoffer som har forskjellige spektrale egenskaper eksiteres for å utføre målinger av en rekke fysiologiske variable, for eksempel, Rhod-2 for cytosolisk Ca2 +, MagFluo4 for intra-SR Ca 2+ og di-8-ANEPPS for membranpotensialet. Selv lasere presentere ulike fordeler som lyskilde i LFFM, kan andre typer lyskilder brukes blant annet lysdioder (LED). I dette tilfellet er det eksitasjonslyskilde besto av en InGaN LED (figur 1c, PLEDFM). I lysdioder, er fotoner spontant avgis når elektroner fra ledningsbåndet rekombinerer med hull i valensbåndet. Forskjellen med halvlederlasere er at utslipp ikke er stimulert av andre fotoner. Dette resulterer i en ikke-sammenhengende stråle oget bredere spektral utslipp for lysdioder. Ulike typer kraftige LED kan brukes. For AP opptak med Di-8-ANEPPS og for Ca 2 + transienter innspilt med Fluo-4 eller Mag-Fluo-4, vi brukte en LED som har en typisk topp emisjon ved 485 nm (blå) og en halv bredde på 20 nm (Figur 1d). For Ca 2+ transienter tatt opp med Rhod-2, lampen hadde en typisk maksimal emisjon ved 540 nm (grønn) og en halv bredde på 35 nm (figur 1d). LED avgir i et band bølgelengde og krever derfor filtrene til å begrense sin spektral utslipp. I tillegg kan pulset lys bli generert ved en hastighet på 1,6 kHz med en varighet på 20 us. Lysdiodene ble pulset med en rask strøm MOSFET felteffekttransistor. Samtidige innspillinger med ulike indikatorer kan utføres av tids multipleksing lysdiodene. Dessverre, er lyset som emitteres ved hjelp av LED mer vanskelig å fokusere på en fiberoptisk sammenlignet med en laserstråle. Dermed største ulempen med ossing LED er at utslippsprofiler har vinkelbevegelser (± 15 °) fra hovedaksen, og en ekstra optisk må brukes for å rette det opp. I alle de optiske utforminger som tidligere er beskrevet, er eksitasjonslys som reflekteres ved hjelp av et dikroisk speil. Bjelken blir deretter fokuseres ved hjelp av en asfærisk linse og et mikroskopobjektiv til en flermodusfiberoptisk som er plassert på vevet. Som i enhver epifluorescens arrangement, det dikroiske speil tjener også til å skille magnetiseringen fra det utsendte lys. Det emitterte lys-spekteret reiser tilbake gjennom en barriere filter for å fjerne eventuelle gjenspeiles eksitasjon. Til slutt blir den utsendte lys fokusert med et objektiv på en fotodetektor (figur 1). Transduksjon fra lys til elektrisk strøm er utført av silisium skredfotodioder. Disse diodene har en rask respons og høy følsomhet slik at lite lys gjenkjenning. Defotostrøm som produseres av skredfotodioder kan forsterkes på to måter: en transimpedansforsterker som har et motstandselement tilbakemelding (figur 1E), eller ved hjelp av en integrator for å omdanne strømmen til en spenning (figur 1f). Ved hjelp av den første fremgangsmåten, er utgangsspenningen proporsjonal med photo og tilbakekoplingsmotstanden. Et typisk eksempel på det resistive påvisning av picosecond laserpulser er vist i figurene 2a, 2b og 2c. Panel 2a illustrerer utgangen fra transimpedansforsterker og panel 2b viser en tid utvidelse av intervallet merket med en stjerne (*). En topp sporingsalgoritme ble gjennomført for å detektere topp (rød) og basen (grønn) for de fluorescerende responser 12. Målingen av basen fluorescensen gir informasjon om både den mørkestrøm av skredfotodiode og interferenser innført ved omgivelses light og elektromagnetisk kobling. En representasjon av topper og baser er vist i figur 2c. Denne figuren illustrerer fluorescensen avgitt av det fargestoff (Rhod-2) bundet til Ca 2+ i løpet av hjertesyklusen av et bankende hjerte undulat. I den andre fremgangsmåten, er utgangsspenningen fra integratoren en funksjon av strømmen og kapasitive tilbake (figurene 2d, 2e og 2f). Figur 2f viser to påfølgende integrasjons sykluser: den første uten ekstern belysning og andre med anvendt lyspulser fra en pulserende LED. En detaljert beskrivelse er gitt i figurene 2g og 2h. Denne fremgangsmåten, selv om mer arbeidskrevende og gir en større S / N på grunn av fravær av termisk støy i tilbakekoblings kondensator. Instrumentet har en timing scene som genererer all kontroll og multipleksing av eksitasjon lys og kommanderer heads integrering og resET perioder. Dette blir vanligvis utført med en digital signalbehandlingskrets som også utfører en digital differensiering av den integrerte utgangssignal ved å beregne en on-line regresjon av dataene. I tilfelle av anvendelse av en resistiv tilbake, kan en hvilken som helst A / D-anskaffelse brett anvendes. Endelig er vår LFFM teknikk svært allsidig og kan tilpasses til å ta opp fra mer enn én region. Tilsetning av en stråledeler i lysbanen gjør det mulig for oss å splitte lyset i to optiske fibre. Hver optisk fiber kan deretter plasseres på forskjellige regioner i et vev til, uavhengig av hverandre, eksitere og ta opp emisjon fra eksogene fluorescerende prober. Denne endringen tillater oss å vurdere hvordan anatomiske regionale forskjeller påvirke fysiologiske variabler. Figur 3 viser en strålesplitter som anvendes for å splitte CW eksitasjonslyset slik at to optiske fibre anvendes for å måle transmural elektrisk eller intracellulær [Ca2 +] nivåer vetth moll-invasivitet. Transmuralt signaler kan tas opp ved å plassere en fiber på endocardium og den andre på epikardet laget av ventrikkel veggen. Derfor har LFFM teknikk evnen til å måle tidsforløpet av cellulære signaler i forskjellige regioner, og kan brukes for å teste om regionale endringer skje under patologiske situasjoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hyrdoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2um nylon membrane filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7402-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold MPP</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0216&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G1.5 Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)</td>
			<td>AllMech Tech</td>
			<td>LOOK-SP105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection 1000USP/mL</td>
			<td>AllMech Tech</td>
			<td>NDC63323-540-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO D8779</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>856925-71-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 20% solution</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>59004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materflex C/L peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>77122-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isostim stimulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>A320RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform generator</td>
			<td>Teledyne Lecroy</td>
			<td>WaveStation 2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1533530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing ID:1/32&#34; OD:3/32&#34; Wall 1/32&#34;</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing ID:3/32&#34; OD:5/32&#34; Wall 1/32&#34;</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>TET-094A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter luer lock to 3-way valve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-31200-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tee adapters and plastic fittings</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic clamp</td>
			<td>WaterZoo</td>
			<td>2465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TE-127-2.0-2.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Fluo-4AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M14206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acupunture needles</td>
			<td>LHASA</td>
			<td>TC1.20x13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mL BD syringe with luer-lok</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed vacuum Eppendorf Vagufuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-748-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital signal processing circuit DSP TMS 320</td>
			<td>Texas Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass Dichroic mirror 567nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>DMLP567L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>Stock# 33-437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>Stock# 33-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass colored glass filter 590 nm&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>FGL590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator for laser</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MX130R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode fiber optic 200&#181;m NA 0.39</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>FT200UMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEDs blue</td>
			<td>Lumileds</td>
			<td colspan="2">L135-B475003500000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEDs green</td>
			<td>Lumileds</td>
			<td colspan="2">L135-G525003500000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cube beam splitter, non-polarizing</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BS007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36&#34; Length, Dovetail Optical Rail</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>54-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5&#34; Width, Dovetail Carrier</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>54-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75&#34; Travel, micrometer stage</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>37-983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail optical rail 3&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RLA075/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail rail carrier 1&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode Helix 902</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>HELIX-902-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective holder XY Translator&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>ST1XY-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum breadboard 6&#34;x6&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MB6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexus otpical table 4&#39;x6&#39;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>T46HK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel cap screws</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>HW-KIT5/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic&#160; sheet</td>
			<td>Home Depot/Lowes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy gel&#160;</td>
			<td>Walmart/Home Depot</td>
			<td>2-part 5 min clr 1oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G1.5 Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base, 25mmx75mmx10mm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BA1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire shelve posts 36&#34;</td>
			<td>Alera</td>
			<td>AALESW59PO36SR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire shelves</td>
			<td>Alera</td>
			<td>ALESW582424SR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post and angle clamp</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC/M-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe for dye chamber</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W851020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper</td>
			<td>Home Science Tools</td>
			<td>CE-STOP01C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

local field fluorescence microscopy: imaging cellular signals in intact hearts

I hjertet, er molekylsignaleringsstudier vanligvis utført i isolerte myocytter. Men mange patologiske tilstander slik som iskemi og arytmier kan bare bli fullt ut forstått på hele organet nivå. Her presenterer vi den spektroskopiske teknikk av lokale feltet fluorescens mikroskopi (LFFM) som tillater måling av cellulære signaler i intakt hjerte. Teknikken er basert på en kombinasjon av et Langendorff perfusert hjerte og optiske fibre for å ta opp fluorescente signalene. LFFM har ulike bruksområder innen kardiovaskulær fysiologi til å studere hjertet under normale og patologiske tilstander. Flere hjertevariabler kan overvåkes ved hjelp av ulike fluorescerende indikatorer. Disse inkluderer cytosolic [Ca 2+], intra-sarkoplasmatisk retikulum [Ca 2+] og membranpotensialer. De eksogene fluorescerende prober er spent og utsendt fluorescens påvises med tre forskjellige arrangementer av LFFM epifluorescence teknikks presentert i denne artikkelen. De sentrale forskjellene mellom disse teknikkene er av type lyskilde som brukes for eksitasjon og på vei eksitasjon lys moduleres. Den pulserende LFFM (PLFFM) bruker laser lyspulser mens kontinuerlig bølge LFFM (CLFFM) bruker kontinuerlig laserlys for eksitasjon. Endelig Lysdioder (LED) ble brukt som en tredje lyskilde. Denne ikke-koherent ordningen kalles pulset LED fluorescens mikroskopi (PLEDFM).

AP og Ca 2+ transienter i endocardium og epikardet For å sammenligne signaler over den ventrikulære veggen, er en fiberoptisk plassert i endocardium og den andre i epikardet. Sammenligning morfologien til en AP registreres fra endocardium med en fra epikardet er den beste måte å vurdere transmuralt funksjon. Ventrikkel veggen er svært heterogen og dermed morfologi...

Watch this Scientific Journal Video about Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts at JoVE.com

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

I hjertet, molekylære hendelser som koordinerer den elektriske og kontraktile funksjon av organet. Et sett av lokale felt fluorescens-mikroskopi teknikker som presenteres her muliggjør opptak av cellulære variabler i intakte hjertet. Identifisere mekanismer som definerer hjertefunksjonen er avgjørende for å forstå hvordan hjertet fungerer under patologiske situasjoner.

Lokal Feltet Fluorescensmikroskopi: Imaging Cellular Signaler i Intakte Hearts

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-basert Måling av Store-opererte Calcium Entry i levende celler: fra Helstøpt Cancer Cell til Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Rapid Analyse og Utforskning av fluorescens mikros Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Høytrykks Frysing og Quick Freeze Bytte av plantemateriale for transmisjonselektronmikroskopi

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Lokal Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i dyrkede pattedyrceller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Cellular Redox Profiling ved hjelp av høy innholdsmikroskopi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...