Name: local field fluorescence microscopy: imaging cellular signals in intact hearts
Uploaded: 2017-03-08T13:00:00
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Agradecemos ao Dr. Alicia Mattiazzi para a discussão crítica do trabalho apresentado. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do NIH (R01 HL-084487) para ALE.

Este protocolo e todo o tratamento ratos foi aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use a UC Merced (No. 2008-201). Experimentos com periquitos foram realizadas em 1999, de acordo com as condições gerais do uso de animais estabelecida pela comissão científica do Instituto Venezuelano de Pesquisas Científicas (IVIC). 1. Langendorff Set Up Preparação <ol><li> Preparar a solução de Tyrode contendo as seguintes concentrações de soluto em mM: 140 de NaCl, 5,4 de KCl, 2 <su...

<ol>
	<li>Fabiato, A., Fabiato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractions+induced+by+a+calcium-triggered+release+of+calcium+from+the+sarcoplasmic+reticulum+of+single+skinned+cardiac+cells.">Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells.</a> J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).</li><li>Mitra, R., Morad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+uniform+enzymatic+method+for+dissociation+of+myocytes+from+hearts+and+stomachs+of+vertebrates.">A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates.</a> Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).</li><li>Escobar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+of+intracellular+Ca2++transients+in+beating+rat+hearts.">Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).</li><li>Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+Heart+Loose+Patch+Photolysis+Reveals+Ionic+Current+Kinetics+During+Ventricular+Action+Potentials.">Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials.</a> Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).</li><li>Mitra, R., Morad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+uniform+enzymatic+method+for+dissociation+of+myocytes+from+hearts+and+stomachs+of+vertebrates.">A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates.</a> Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).</li><li>Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channel+currents+during+spontaneous+action+potentials+in+embryonic+chick+heart+cells.+The+action+potential+patch+clamp.">Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp.</a> Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).</li><li>Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profile+of+L-type+Ca(2+)+current+and+Na(+)/Ca(2+)+exchange+current+during+cardiac+action+potential+in+ventricular+myocytes.">Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes.</a> Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).</li><li>Apkon, M., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+two+distinct+depolarization-activated+K++currents+in+isolated+adult+rat+ventricular+myocytes.">Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes.</a> J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).</li><li>Valverde, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Ca2++depletion+of+the+sarcoplasmic+reticulum+at+the+onset+of+reperfusion.">Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion.</a> Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).</li><li>Valverde, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholamban+phosphorylation+sites+enhance+the+recovery+of+intracellular+Ca2++after+perfusion+arrest+in+isolated,+perfused+mouse+heart.">Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart.</a> Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).</li><li>Escobar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+in+the+regulation+of+ventricular+Ca(2+)+signaling+in+intact+mouse+heart.">Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).</li><li>Mej&#237;a-Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+local-field+fluorescence+microscopy:+a+new+approach+for+measuring+cellular+signals+in+the+beating+heart.">Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart.</a> Pfl&#252;gers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).</li><li>Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++release+underlies+the+development+of+phase+2+in+mouse+ventricular+action+potentials.">Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).</li><li>Kornyeyev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calsequestrin+2+deletion+shortens+the+refractoriness+of+Ca2++release+and+reduces+rate-dependent+Ca2+-alternans+in+intact+mouse+hearts.">Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).</li><li>Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++Sparks+and+Ca2++waves+are+the+subcellular+events+underlying+Ca2++overload+during+ischemia+and+reperfusion+in+perfused+intact+hearts.">Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts.</a> J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).</li><li>Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+Ca(2+)+content+regulates+intracellular+Ca(2+)+release+in+subepicardial+myocytes+of+intact+beating+mouse+hearts:+effect+of+exogenous+buffers.">Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).</li><li>Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+differences+between+guinea+pig+atrial+endocardium+and+epicardium:+evidence+for+a+role+of+Ito.">Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito.</a> Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).</li><li>Liu, D. W., Gintant, G. 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H., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+outward+current+prominent+in+canine+ventricular+epicardium+but+not+endocardium.">Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium.</a> Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).</li><li>Lukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+of+Myocardial+Cells+in+the+Epicardial,+Midmyocardial,+and+Endocardial+Layers+of+the+Ventricle.">Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle.</a> J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).</li><li>Antzelevitch, C., Fish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+heterogeneity+within+the+ventricular+wall.">Electrical heterogeneity within the ventricular wall.</a> Basic Res Cardiol. 96 (6), 517-527 (2001).</li><li>Gomez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+electrical+heterogeneity+by+compensated+hypertrophy+in+rat+left+ventricle.">Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle.</a> Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).</li><li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+in+optical+imaging:+looking+inside+the+heart.">Innovation in optical imaging: looking inside the heart.</a> Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).</li><li>Boukens, B. J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+optocardiography.">A century of optocardiography.</a> IEEE Rev Biomed Eng. 7, 115-125 (2014).</li><li>Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+membrane+potential+and+epicardial+deformation+in+beating+hearts.">Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts.</a> Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).</li></ol>

Este artigo é centrada em descrever as técnicas de fluorescência de campo locais para avaliar a função dos miócitos cardíacos ex vivo. O estudo destas células em um ambiente acoplado é não só mais fisiológico, mas também é altamente adequada para a avaliação de nível patologias de órgãos. Os eventos celulares subjacentes acoplamento de excitação-contracção (ECC) pode ser avaliado em todo o nível do órgão com o uso de sondas moleculares que monitoram Ca2 + intracelular dinâm...

O coração é o órgão central do sistema cardiovascular. A contracção do coração é iniciado por um aumento intracelular [Ca2 +]. A relação entre a excitabilidade elétrica e as mudanças no intracelular liberação de Ca2 + tem sido historicamente estudado em células enzimaticamente dissociada 1, 2. No entanto, as células cardíacas estão electricamente, metabolicamente e mecanicamente acoplada 3, 4. Quando isolado, os miócitos não são só fisicamente desacoplado, mas miócitos de diferentes camadas são misturados durante a dissociação 5. Além disso, apesar das enormes vantagens que surgiram a partir do estudo de células isoladas, sob condições de fixação de tensão, 6, 7, 8 a natureza intrínseca do coração como um alwa sincício elétricays coloca a questão de como funcionalmente diferentes são células dissociadas das presente no tecido 3. Neste artigo, descrevemos os avanços obtidos no conhecimento da fisiologia cardíaca através da utilização de técnicas de microscopia de fluorescência de campo locais (LFFM) no coração intacto. LFFM utiliza indicadores fluorescentes para medir múltiplas variáveis fisiológicas, como citosólica de Ca2 +, intra retículo sarcoplasmático (RS) Ca 2+ e potencial de membrana. Estas medições podem ser obtidos simultaneamente e em conjunto com a pressão ventricular 9, 10, eletrocardiogramas 9, potenciais de ação elétricos (APs), gravações atuais iónicos e fotólise de compostos enjaulados 4, 11. Além disso, estas medidas podem ser obtidas pelo ritmo do coração intacto em frequências mais altas pertor para taxas fisiológicas. Apesar de vários artigos 9, 11, 12, 13, 14 foram publicados pelo nosso grupo usando técnicas LFFM, a presunção de complexidades técnicas associadas com esta técnica tem impedido a sua utilização maciça em estudar fenômenos fisiológicos ex vivo no coração e outros órgãos. A técnica LFFM (Figura 1) é baseado em medidas epifluorescência obtidos usando uma fibra óptica multimodo em contacto com o tecido. Como qualquer técnica de imagiologia de fluorescência de contacto, a resolução óptica depende do diâmetro e a abertura numérica (NA) da fibra. Um diâmetro maior e menor de NA da fibra irá aumentar a resolução espacial das medições. AEs e diâmetro das fibras pode variar 0,22-0,66 e de 50 um a 1 mm, respectivamente. Dentrovincar a AN irá melhorar a relação sinal-ruído (S / N), aceitando fotões que chegam a partir de um ângulo sólido maior. A fim de actuar como um dispositivo de epifluorescência, o feixe de luz é focado na fibra óptica com uma lente asférica ou um objectivo epifluorescência onde a NA da lente e o fósforo de fibra. Esta correspondência maximiza a transferência de energia para a excitação e para recolher de volta os fótons emitidos pelo fluoróforo. A fim de excitar os indicadores fluorescentes exógenos carregados no tecido, diferentes fontes de luz e modos de iluminação pode ser utilizada. Nossos estudos pioneiros utilizando a microscopia pulsada de campo local de fluorescência 3, 12 (PLFFM) empregue um laser low-cost de picossegundos (Figura 1a, PLFFM). Este tipo de fonte de luz tem a enorme vantagem de excitar uma grande fracção de moléculas fluoróforo sob a área de iluminação, sem branqueamento substancialmente o corante devidoao pulso curto durações 12. Além disso, a utilização de impulsos ultracurtos permitiu a avaliação do tempo de vida de fluorescência do corante 12. O tempo de vida de fluorescência é uma propriedade que pode ser utilizada para quantificar a fracção de moléculas de corante ligado ao Ca2 +. Infelizmente, a tremulação temporal dos pulsos e das variações na amplitude de impulso-para-impulso de limitar a aplicação desta estratégia experimental para casos em que a alteração na fluorescência produzida pela ligação com o ligando corante é grande. Onda contínua (CW) lasers são usados geralmente como a principal fonte de iluminação em LFFM (Figura 1b, CLFFM). O feixe de laser pode continuamente iluminar o tecido ou pode ser modulado ferroelectrically. A modulação ferroeléctrica do feixe permite a geração de impulsos de luz microssegundos. Esta modulação pode ser controlada pelo hardware externo. Este procedimento não só reduz drasticamente tele jittering temporal dos pulsos de luz, mas também permite misturar vigas de diferentes comprimentos de onda. A mistura de vigas é feito por multiplexagem de diferentes raios laser. Como consequência, vários corantes possuindo diferentes propriedades espectrais pode ser animado para realizar medições de uma variedade de variáveis fisiológicas, por exemplo, Rhod-2 para o Ca2 + citosólico, MagFluo4 para administração intra-SR Ca 2+ e di-8-ANEPPS para potencial de membrana. Embora lasers apresentam várias vantagens como a fonte de luz em LFFM, outros tipos de fontes de luz podem ser utilizados, incluindo díodos emissores de luz (LEDs). Neste caso, a fonte de luz de excitação consistiu de um LED InGaN (Figura 1c, PLEDFM). Em LEDs, os fótons são espontaneamente emitida quando elétrons da banda de condução recombinar com furos na banda de valência. A diferença com lasers de estado sólido é que a emissão não é estimulada por outros fotões. Isto resulta num feixe coerente e não-uma emissão espectral mais amplo para os LEDs. Podem ser usados ​​diferentes tipos de LEDs de alta potência. Para as gravações PA usando Di-8-ANEPPS e para Ca 2+ transientes registados utilizando Fluo-4 ou MAG-Fluo-4, utilizou-se um diodo emissor de luz que tem um pico de emissão a 485 nm típico (azul) e uma meia largura de 20 nm (Figura 1D). Para Ca 2 + transientes gravados com Rhod-2, o LED teve um pico de emissão típica a 540 nm (verde) e uma meia largura de 35 nm (Figura 1d). LEDs emitem em um comprimento de onda de banda e, portanto, exigem filtros para reduzir sua emissão espectral. Além disso, a luz pulsada pode ser gerado a uma taxa de 1,6 kHz com duração de 20 uS. Os LEDs foram pulsadas com uma potência MOSFET de efeito de campo transistor rápido. gravações em simultâneo com diferentes indicadores pode ser realizada por tempo-de multiplexação os LEDs. Infelizmente, a luz emitida pelos LEDs é mais difícil de foco para uma fibra óptica em relação a um feixe de laser. Assim, a principal desvantagem de nósing LEDs é que os seus perfis de emissão têm deslocamentos angulares (± 15 °) em relação ao eixo principal, e uma óptica auxiliar deve ser usada para corrigir o problema. Em todas as configurações ópticas anteriormente descritos, a luz de excitação é reflectida com a ajuda de um espelho dicróico. O feixe é subsequentemente focada por uma lente asférica e uma objectiva de microscópio sobre uma fibra óptica multimodo que é posicionada sobre o tecido. Como em qualquer arranjo de epifluorescência, o espelho dicróico também serve para separar a excitação da luz emitida. O espectro de luz emitida viaja de volta através de um filtro de barreira para remover qualquer excitação reflectida. Por fim, a luz emitida é focada, com uma objectiva para um fotodetector (Figura 1). A transdução de luz a corrente eléctrica é feita pelos fotodíodos de avalanche de silício. Estes diodos têm uma resposta rápida e uma alta sensibilidade permitindo a detecção de pouca luz. ofotocorrente produzida pelos fotodiodos de avalanche pode ser amplificado em duas formas: um amplificador de transimpedância resistiva tendo um elemento de retorno (Figura 1e) ou por um integrador para converter a corrente em tensão (Figura 1F). Usando o primeiro método, a tensão de saída é proporcional à fotocorrente e a resistência de realimentação. Um exemplo típico de detecção resistiva de pulsos de laser de picossegundos é mostrado nas Figuras 2a, 2b e 2c. Painel 2a ilustra a saída do amplificador de transimpedância e o painel 2b mostra uma expansão no tempo do intervalo indicado com um asterisco (*). Um algoritmo de rastreamento de pico foi implementada para detectar o pico (vermelho) e a base (verde) para as respostas fluorescentes 12. A medição da fluorescência de base fornece informações tanto da corrente escura do fotodiodo avalanche e as interferências introduzido por lig ambienteht e acoplamento electromagnético. Uma representação de picos e bases é mostrado na Figura 2c. Esta figura ilustra a fluorescência emitida pelo corante (Rhod-2) ligado ao Ca2 + durante o ciclo cardíaco de um coração a bater periquito. No segundo método, a tensão de saída do integrador é uma função de realimentação de corrente e capacitiva (Figuras 2d, 2e, 2f). Figura 2f mostra dois ciclos de integração consecutivos: o primeiro sem iluminação exterior eo segundo com pulsos de luz aplicada a partir de um diodo emissor de luz pulsada. Uma descrição detalhada é apresentada nas Figuras 2G e 2H. Esta abordagem, apesar de mais laborioso, proporciona uma maior S / N devido à ausência de ruído térmico no condensador de realimentação. O instrumento inclui um estágio de tempo que gera todo o controle e multiplexação da luz de excitação e comanda a integração headstage e resperíodos et. Esta é normalmente realizada com um circuito de processamento de sinal digital que executa também uma diferenciação digital do sinal de saída integrado calculando uma regressão on-line dos dados. No caso de se utilizar um gabarito resistiva, qualquer de A / D placa de aquisição pode ser usado. Finalmente, a técnica LFFM é altamente versátil e pode ser adaptado para gravar a partir de mais do que uma região. Adicionando um divisor de feixe no caminho da luz nos permite dividir a luz em duas fibras ópticas. Cada fibra óptica pode então ser colocado em diferentes regiões de tecido para um, independentemente, excita e emissão ficha das sondas fluorescentes exógenos. Esta modificação permite-nos avaliar como anatômica diferenças regionais influenciam variáveis ​​fisiológicas. A Figura 3 mostra um separador de feixe a ser utilizado para separar a luz de excitação CW de tal modo que duas fibras ópticas são utilizados para medir transmural intracelular eléctrica ou [Ca 2+] níveis with minor-invasivo. transmurais sinais podem ser gravados pela colocação de uma fibra no endocárdio e a outra na camada epicárdio da parede ventricular. Portanto, a técnica LFFM tem a capacidade de medir o curso de tempo dos sinais celulares em diferentes regiões e pode ser utilizado para testar se as alterações regionais ocorrer em situações patológicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hyrdoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2um nylon membrane filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7402-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold MPP</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0216&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G1.5 Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)</td>
			<td>AllMech Tech</td>
			<td>LOOK-SP105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection 1000USP/mL</td>
			<td>AllMech Tech</td>
			<td>NDC63323-540-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO D8779</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>856925-71-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 20% solution</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>59004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materflex C/L peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>77122-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isostim stimulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>A320RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform generator</td>
			<td>Teledyne Lecroy</td>
			<td>WaveStation 2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1533530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing ID:1/32&#34; OD:3/32&#34; Wall 1/32&#34;</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing ID:3/32&#34; OD:5/32&#34; Wall 1/32&#34;</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>TET-094A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter luer lock to 3-way valve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-31200-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tee adapters and plastic fittings</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic clamp</td>
			<td>WaterZoo</td>
			<td>2465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TE-127-2.0-2.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Fluo-4AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M14206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acupunture needles</td>
			<td>LHASA</td>
			<td>TC1.20x13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mL BD syringe with luer-lok</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed vacuum Eppendorf Vagufuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-748-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital signal processing circuit DSP TMS 320</td>
			<td>Texas Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass Dichroic mirror 567nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>DMLP567L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>Stock# 33-437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>Stock# 33-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass colored glass filter 590 nm&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>FGL590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator for laser</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MX130R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode fiber optic 200&#181;m NA 0.39</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>FT200UMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEDs blue</td>
			<td>Lumileds</td>
			<td colspan="2">L135-B475003500000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEDs green</td>
			<td>Lumileds</td>
			<td colspan="2">L135-G525003500000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cube beam splitter, non-polarizing</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BS007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36&#34; Length, Dovetail Optical Rail</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>54-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5&#34; Width, Dovetail Carrier</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>54-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75&#34; Travel, micrometer stage</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>37-983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail optical rail 3&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RLA075/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail rail carrier 1&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode Helix 902</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>HELIX-902-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective holder XY Translator&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>ST1XY-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum breadboard 6&#34;x6&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MB6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexus otpical table 4&#39;x6&#39;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>T46HK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel cap screws</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>HW-KIT5/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic&#160; sheet</td>
			<td>Home Depot/Lowes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy gel&#160;</td>
			<td>Walmart/Home Depot</td>
			<td>2-part 5 min clr 1oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G1.5 Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base, 25mmx75mmx10mm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BA1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire shelve posts 36&#34;</td>
			<td>Alera</td>
			<td>AALESW59PO36SR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire shelves</td>
			<td>Alera</td>
			<td>ALESW582424SR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post and angle clamp</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC/M-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe for dye chamber</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W851020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper</td>
			<td>Home Science Tools</td>
			<td>CE-STOP01C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

local field fluorescence microscopy: imaging cellular signals in intact hearts

No coração, os estudos de sinalização molecular são geralmente realizadas em miócitos isolados. No entanto, muitas situações patológicas, tais como isquemia e arritmias só pode ser totalmente entendido a todo o nível do órgão. Aqui, apresentamos a técnica de espectroscopia de fluorescência microscopia de campo local (LFFM) que permite a medição de sinais celulares no coração intacto. A técnica baseia-se numa combinação de um coração perfundido de Langendorff e fibras ópticas para gravar sinais fluorescentes. LFFM tem várias aplicações no campo da fisiologia cardiovascular para estudar o coração em condições normais e patológicas. Várias variáveis ​​cardíacas pode ser monitorizada utilizando diferentes indicadores fluorescentes. Estes incluem citosólica [Ca2 +], retículo sarcoplasmático intra-[Ca 2+] e potenciais de membrana. As sondas fluorescentes exógenos são animado e a fluorescência emitida detectada com três arranjos diferentes de técnica LFFM epifluorescências apresentada neste artigo. As diferenças central entre estas técnicas são o tipo de fonte de luz utilizada para excitação e sobre a forma como a luz de excitação é modulada. O LFFM pulsada (PLFFM) usa pulsos de luz laser, enquanto onda contínua LFFM (CLFFM) usa luz laser contínuo para a excitação. Finalmente, diodos emissores de luz (LEDs) foram usadas como uma fonte de luz terceiro. Este arranjo não coerente é chamado pulsada microscopia de fluorescência LED (PLEDFM).

AP e Ca 2 + transientes em endocárdio e epicárdio A fim de comparar os sinais do outro lado da parede ventricular, uma fibra óptica é posicionada no endocárdio e a outra no epicárdio. Comparando-se a morfologia de um AP gravado a partir do endocárdio com um a partir do epicárdio é a melhor maneira de avaliar a função transmural. A parede ventricular é altam...

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Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

No coração, os eventos moleculares coordenar a função contráctil e eléctrica do órgão. Um conjunto de técnicas de microscopia de fluorescência de campo locais aqui apresentadas permite a gravação de variáveis ​​de celular em corações intactos. Identificação de mecanismos que definem a função cardíaca é fundamental na compreensão de como o coração trabalha em situações patológicas.

O campo local microscopia de fluorescência: Geração de sinais de celular em corações intactos

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Longo prazo células de mamíferos utilizando imagens do Largo-Campo Microscopia

Biologia

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Exocitose imagem em células da retina com Bipolar Microscopia TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

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Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Análise rápida e Exploração de microscopia de fluorescência Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

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In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem congelamento de pressão alta e rápida substituição em congelamento dos tecidos vegetais por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

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Imagem local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em células de mamíferos em cultura

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Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

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