Name: local field fluorescence microscopy: imaging cellular signals in intact hearts
Uploaded: 2017-03-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts at JoVE.com

Biz sunulan çalışmanın kritik tartışma için Dr. Alicia Mattiazzi teşekkür ederim. Bu çalışma NIH hibe yoluyla (R01 HL-084487) ALE için desteklenmiştir.

Bu protokol ve tüm fareler taşıma UC Merced Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (No 2008-201) tarafından onaylandı. parakeets yapılan deneyler Bilimsel Araştırma Venezüella Enstitüsü (Ivic) bilimsel komisyon tarafından kurulan hayvan kullanımı için genel politikalarına göre 1999 yılında yapılmıştır. 1. Langendorff Kurma Hazırlık <ol><li> 140 NaCl, 5.4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 0.33 HPO 4, 10 glukoz, 10 HEPES 2 Na mM a...

<ol>
	<li>Fabiato, A., Fabiato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractions+induced+by+a+calcium-triggered+release+of+calcium+from+the+sarcoplasmic+reticulum+of+single+skinned+cardiac+cells.">Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells.</a> J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).</li><li>Mitra, R., Morad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+uniform+enzymatic+method+for+dissociation+of+myocytes+from+hearts+and+stomachs+of+vertebrates.">A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates.</a> Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).</li><li>Escobar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+of+intracellular+Ca2++transients+in+beating+rat+hearts.">Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).</li><li>Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+Heart+Loose+Patch+Photolysis+Reveals+Ionic+Current+Kinetics+During+Ventricular+Action+Potentials.">Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials.</a> Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).</li><li>Mitra, R., Morad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+uniform+enzymatic+method+for+dissociation+of+myocytes+from+hearts+and+stomachs+of+vertebrates.">A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates.</a> Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).</li><li>Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channel+currents+during+spontaneous+action+potentials+in+embryonic+chick+heart+cells.+The+action+potential+patch+clamp.">Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp.</a> Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).</li><li>Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profile+of+L-type+Ca(2+)+current+and+Na(+)/Ca(2+)+exchange+current+during+cardiac+action+potential+in+ventricular+myocytes.">Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes.</a> Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).</li><li>Apkon, M., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+two+distinct+depolarization-activated+K++currents+in+isolated+adult+rat+ventricular+myocytes.">Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes.</a> J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).</li><li>Valverde, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Ca2++depletion+of+the+sarcoplasmic+reticulum+at+the+onset+of+reperfusion.">Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion.</a> Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).</li><li>Valverde, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholamban+phosphorylation+sites+enhance+the+recovery+of+intracellular+Ca2++after+perfusion+arrest+in+isolated,+perfused+mouse+heart.">Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart.</a> Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).</li><li>Escobar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+in+the+regulation+of+ventricular+Ca(2+)+signaling+in+intact+mouse+heart.">Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).</li><li>Mej&#237;a-Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+local-field+fluorescence+microscopy:+a+new+approach+for+measuring+cellular+signals+in+the+beating+heart.">Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart.</a> Pfl&#252;gers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).</li><li>Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++release+underlies+the+development+of+phase+2+in+mouse+ventricular+action+potentials.">Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).</li><li>Kornyeyev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calsequestrin+2+deletion+shortens+the+refractoriness+of+Ca2++release+and+reduces+rate-dependent+Ca2+-alternans+in+intact+mouse+hearts.">Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).</li><li>Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++Sparks+and+Ca2++waves+are+the+subcellular+events+underlying+Ca2++overload+during+ischemia+and+reperfusion+in+perfused+intact+hearts.">Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts.</a> J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).</li><li>Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+Ca(2+)+content+regulates+intracellular+Ca(2+)+release+in+subepicardial+myocytes+of+intact+beating+mouse+hearts:+effect+of+exogenous+buffers.">Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).</li><li>Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+differences+between+guinea+pig+atrial+endocardium+and+epicardium:+evidence+for+a+role+of+Ito.">Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito.</a> Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).</li><li>Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+bases+for+electrophysiological+distinctions+among+epicardial,+midmyocardial,+and+endocardial+myocytes+from+the+free+wall+of+the+canine+left+ventricle.">Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle.</a> Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).</li><li>Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+outward+current+prominent+in+canine+ventricular+epicardium+but+not+endocardium.">Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium.</a> Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).</li><li>Lukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+of+Myocardial+Cells+in+the+Epicardial,+Midmyocardial,+and+Endocardial+Layers+of+the+Ventricle.">Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle.</a> J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).</li><li>Antzelevitch, C., Fish, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+heterogeneity+within+the+ventricular+wall.">Electrical heterogeneity within the ventricular wall.</a> Basic Res Cardiol. 96 (6), 517-527 (2001).</li><li>Gomez, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+electrical+heterogeneity+by+compensated+hypertrophy+in+rat+left+ventricle.">Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle.</a> Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).</li><li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+in+optical+imaging:+looking+inside+the+heart.">Innovation in optical imaging: looking inside the heart.</a> Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).</li><li>Boukens, B. J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+optocardiography.">A century of optocardiography.</a> IEEE Rev Biomed Eng. 7, 115-125 (2014).</li><li>Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+membrane+potential+and+epicardial+deformation+in+beating+hearts.">Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts.</a> Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).</li></ol>

Bu yazıda, kardiyak miyositlere ex vivo fonksiyonu değerlendirmek için yerel alan floresan tekniklerini anlatan merkezli. Bir bağlanmış bir ortamda, bu hücrelerin bir çalışma, sadece daha fizyolojik değil, aynı zamanda, organ düzeyinde patolojileri değerlendirmek için son derece uygundur. Eksitasyon-kasılma kaplin (ECC) altında yatan hücresel olaylar hücre içi Ca 2 + dinamiklerini izlemek moleküler probların kullanımı ile tüm organ düzeyinde (Rhod 2 sitozolik Ca 2+,</su...

Kalp damar sisteminin merkezi organıdır. Kalbin kasılma intrasellüler artışa [Ca2 +] tarafından başlatılır. Hücre içi Ca 2 + sürümde elektrik uyarılabilmenin ve değişimler arasındaki ilişki tarihsel enzimatik ayrışmış hücreleri 1, 2 olarak ele alınmıştır. Bununla birlikte, kalp hücreleri, elektriksel olarak, metabolik ve mekanik, 4 3 bağlanmış. Izole zaman miyositler sadece fiziksel Kuplajsız değildir, fakat farklı katmanlardan miyositler ayrışma 5 boyunca karıştırılır. Bundan başka, voltaj kenetleme şartları altında izole edilmiş hücrelerin çalışma ortaya çıkan büyük bir avantaj, 6, 7, 8, bir elektrik sinsityum ALWA olarak kalbin iç doğasına rağmenys dokusunda 3 bulunanların hücreleri ayrışmış nasıl işlevsel olarak farklı sorusunu oluşturmaktadır. Bu yazıda, sağlam kalbinde yerel alan floresan mikroskobu (LFFM) tekniklerinin kullanımı ile kardiyak fizyoloji bilgisine elde gelişmeleri açıklar. LFFM gibi sitozolik Ca 2+, içi sarkoplazmik retikulum (SR) Ca 2+ ve membran potansiyeli gibi çoklu fizyolojik değişkenleri ölçmek için floresan göstergeler kullanır. Bu ölçümler ventrikül basıncı 9, 10, Elektrokardiyogram 9, elektrik aksiyon potansiyeli (AP), iyon akımı kayıtları ve kafesli bileşikler 4 flaş fotoliz 11 ile aynı anda ve bağlantılı olarak elde edilebilir. Buna ek olarak, bu ölçümler yakınında yüksek frekanslarda sağlam kalp ilerleme hızı ile elde edilebilirFizyolojik oranlarda r. Çeşitli makaleler rağmen 9, 11, 12, 13, 14 LFFM teknikleri kullanarak grubumuz tarafından yayınlanmıştır, bu teknikle ilgili teknik karmaşıklıklar karinesi kalp ve diğer organlarda ex vivo fizyolojik olayları okuyan büyük miktarlarda kullanımını engellemiştir. LFFM tekniği (Şekil 1) doku ile temas halinde olan bir çoklu optik fiber kullanılarak elde epifloresans ölçümlerine dayanır. herhangi bir temas floresan görüntüleme tekniği gibi, optik çözünürlük çapı ve lif sayısal açıklık (NA) bağlıdır. lif A NA yüksek ve daha küçük çaplı ölçümlerinin uzaysal çözünürlüğü artacaktır. NAS ve elyaf çapları sırasıyla 0.22 mm 0.66 ve um 1 ila 50 arasında olabilir. İçindeNA katlama bir büyük katı açı gelen fotonları kabul ederek gürültü oranı (S / N) sinyali artıracaktır. Epifloresans cihazı olarak hareket etmek amacıyla, ışık huzmesi bir asferik lens veya Epifloresans amacı ile optik fiber içine odaklanmış nerede lens NA ve fiber maç. Bu eşleştirme uyarma ve fluorofor tarafından yayılan fotonlar geri toplamak için enerji transferini maksimuma çıkarır. dokuda yüklenen eksojen floresan göstergeleri heyecanlandırmak için, farklı ışık kaynakları ve aydınlatma modları kullanılabilir. Darbeli yerel alan floresan mikroskobu 3, 12 (PLFFM) kullanarak ilk çalışmalarda düşük maliyetli pikosaniye lazer (Şekil 1a, PLFFM) kullanılmıştır. ışık kaynağının Bu tip büyük ölçüde nedeniyle boya kasar olmadan aydınlatma alanı altında florofor moleküllerinin heyecan verici büyük bir fraksiyonun büyük bir avantaja sahiptirkısa nabız 12 süreleri. Buna ek olarak, ultra bakliyat kullanımı boya 12 floresan ömrü değerlendirmesini sağladı. Floresans ömrü Ca2 + bağlanmış boya molekülleri kısmını ölçmek için kullanılabilecek bir özelliktir. Ne yazık ki, Darbeli darbe genliği bakliyat ve varyasyon zamana jittering boyasına ligand tarafından üretilen parlaklıkta meydana gelen değişiklikler büyük olduğu durumlarda, bu deney strateji uygulanmasını sınırlar. Sürekli dalga (CW) lazeri genellikle LFFM (Şekil 1b, CLFFM) içindeki ana aydınlatma kaynağı olarak kullanılır. Lazer ışını sürekli olarak doku aydınlatmak veya ferroelektrik modüle edilebilir. kirişin ferroelektrik modülasyon ışığın mikrosaniye bakliyat üretimi sağlar. Bu modülasyon dış donanım ile kontrol edilebilir. Bu prosedür sadece dramatik t azaltırO ışık darbeleri zamansal jittering değil, aynı zamanda farklı dalga boylarında ışınları karıştırma sağlar. Kirişlerin karıştırma farklı lazerler çoklayıcı ışınları ile yapılır. Bunun bir sonucu olarak, farklı bir spektral özelliklere sahip olan birden fazla boya, örneğin, fizyolojik değişikliklerin çeşitli ölçümler yapmak için büyük bir heyecan olabilir Rhod-2 sitosolik Ca2 + için MagFluo4-içi SR Ca2 + ve di-8-ANEPPS için için membran potansiyeli. LFFM ışık kaynağı olarak lazer mevcut çeşitli avantajları olmasına rağmen, ışık kaynaklarının başka tür ışık yayan diyot (LED) gibi kullanılabilir. Bu durumda, uyarım ışığı kaynağı, bir InGaN LED (Şekil 1c, PLEDFM) oluşuyordu. iletim bandı elektronlar değerlik bandında deliklerle recombine zaman LED&#39;ler, fotonlar kendiliğinden yayılır. katı hal lazerleri ile farkı emisyon diğer fotonlar tarafından uyarılan olmadığıdır. Bu eşevrelı olmayan bir kiriş meydana getirir veLED&#39;ler için daha geniş bir spektral emisyon. yüksek güç LED Farklı türleri kullanılabilir. Di-8-ANEPPS Ca kullanılarak AP kayıtları için 2 + geçici Fluo-4 veya MAG-Fluo-4, 485 nm&#39;de (mavi) ve 20 nm&#39;lik bir yarı genişliği tipik tepe emisyon olan bir LED kullanılan kullanılarak kaydedildi (Şekil 1d). Rhod-2 ile kaydedilmiş Ca 2 + transientler için, LED 540 nm (yeşil) ve 35 nm (Şekil 1d) yarım genişlikte tipik bir tepe emisyonu vardı. LED&#39;ler bir grup dalga boyunda yayar ve bu nedenle onların spektral emisyon daraltmak için filtreleri gerektirir. Buna ek olarak, darbeli ışığı 20 ms&#39;den süresi 1.6 kHz&#39;lik bir hızda oluşturulabilir. LEDLER hızlı bir güç MOSFET alan etkili transistör ile pulse edildi. Farklı göstergeler ile eş zamanlı olarak kayıtlar zaman çoklama LED&#39;ler tarafından yapılabilir. Ne yazık ki, LED&#39;ler tarafından yayılan ışık, bir lazer ışınına göre fiber optik üzerine odaklanmak daha zordur. Böylece, bize büyük dezavantajıLED&#39;ler ing emisyon profilleri, ana eksenden açısal yer değiştirmelere (± 15 °), ve bir yardımcı optik düzeltmek için kullanılması gerekir olmasıdır. Daha önce tarif edilmiş olan optik konfigürasyonlarda tümünde, uyarım ışık dikroik ayna yardımıyla yansıtılır. kiriş sonra doku üzerinde konumlandırılmış bir modlu fiber optik üzerine bir asferik lens ve mikroskop objektif ile odaklanmıştır. Herhangi bir epifluorışıma düzenlemede olduğu gibi, dikroik ayna da yayılan ışık uyarma ayırmak için hizmet eder. yayılan ışık spektrumu herhangi yansıyan uyarma çıkarmak için geri bariyer filtresi üzerinden geçecek. Son olarak, yayılan ışık, bir fotodetektör (Şekil 1) üzerinde bir hedefi ile odaklanmıştır. elektrik akımına ışık iletim silikon çığ fotodiyotları ile gerçekleştirilir. Bu diyotlar hızlı tepki ve düşük ışık algılama sağlayan yüksek duyarlılığa sahip.çığ fotodiyotlar tarafından üretilen fotoakım iki şekilde amplifiye edilebilir: a transempedans kuvvetlendirici bir voltaj (Şekil 1 f) içine mevcut dönüştürmek için bir direnç geribesleme elemanı (Şekil 1 E) sahip olan ya da entegratör tarafından. İlk yaklaşımı kullanarak, çıkış voltajı fotoakım ve geri bildirim direnci ile doğru orantılıdır. Pikosaniye lazer darbelerinin direnç tespit tipik bir örneği Şekil 2a, 2b ve 2c&#39;de gösterilmiştir. Paneli 2a transempedans yükselticinin çıkışı göstermektedir ve panel 2b bir yıldız işareti (*) ile belirtilen aralığın bir zaman genişleme gösterir. Bir tepe izleme algoritması floresan yanıtları 12 zirve (kırmızı) ve taban (yeşil) saptamak amacıyla yapılmıştır. Baz floresan ölçümü ortam lig getirdiği çığ fotodiyot karanlık akımı ve etkileşimler hem bilgi sağlarht ve elektromanyetik kavrama. Tepe ve bazların bir temsili Şekil 2c&#39;de gösterilmektedir. Bu rakam, bir dayak parakeet kalbin kalp döngüsü sırasında Ca2 + bağlı boya (Rhod-2) yaydığı floresan göstermektedir. İkinci yöntemde, birleştiricinin çıkışı gerilim akım ve kapasitif geri besleme bir fonksiyonudur (Şekil 2D, 2E ve 2F). Herhangi bir dış aydınlatma ilk ve darbeli LED&#39;den uygulamalı ışık darbeleri ile ikinci: Şekil 2f iki ardışık entegrasyon döngüleri gösterir. Ayrıntılı bir açıklama Şekiller 2G ve 2 içinde sunulmaktadır. Bu yaklaşım, daha zahmetli olmasına rağmen nedeniyle geri kapasitör termal gürültü olmaması daha büyük bir S / N sağlar. enstrüman ikaz ışığı tüm kontrol ve çoğullama üretir ve headstage entegrasyon ve res komutları bir zamanlama aşamasını kapsamaktadıret dönemleri. Bu, genellikle aynı zamanda bir veri bir on-line regresyon hesaplama tarafından entegre çıkış sinyalinin sayısal farklılaşmasını gerçekleştiren bir dijital sinyal işleme devresi ile gerçekleştirilir. bir dirençli geri kullanılması durumunda, bir A / D toplama kartı kullanılabilir. Son olarak, LFFM tekniği son derece çok yönlüdür ve birden fazla bölgeye kayıt için adapte edilebilir. ışık yolu bir ışın ayırıcı ekleme bize iki fiber optik içine ışık split sağlar. Her optik fiber tel daha sonra eksojen floresan probları bir, bağımsız bir şekilde, tahrik doku ve kayıt emisyon farklı bölgelere yerleştirilebilir. Bu değişiklik fizyolojik değişkenleri nasıl etkilediğini anatomik bölgesel farklılıklar değerlendirmek için bize izin verir. Şekil 3, bu iki fiber optik transmural elektrikli veya hücre içi ölçmek için kullanılan CW uyarma ışık bölmek üzere kullanıldığı bir ışın ayırıcı göstermektedir [Ca2 +] seviyeleri with minör-invaziv. Transmural sinyaller tek endokardiyumda lif ve ventriküler duvar epicardium katmandaki diğer koyarak kaydedilebilir. Bu nedenle, LFFM tekniği farklı bölgelerde hücresel sinyallerin zaman sürecini ölçmek için yeteneği ve bölgesel değişiklikler patolojik durumlar altında meydana test etmek için de kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hyrdoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2um nylon membrane filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7402-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold MPP</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0216&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G1.5 Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)</td>
			<td>AllMech Tech</td>
			<td>LOOK-SP105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection 1000USP/mL</td>
			<td>AllMech Tech</td>
			<td>NDC63323-540-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO D8779</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>856925-71-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 20% solution</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>59004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materflex C/L peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>77122-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isostim stimulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>A320RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform generator</td>
			<td>Teledyne Lecroy</td>
			<td>WaveStation 2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1533530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing ID:1/32&#34; OD:3/32&#34; Wall 1/32&#34;</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing ID:3/32&#34; OD:5/32&#34; Wall 1/32&#34;</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>TET-094A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter luer lock to 3-way valve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-31200-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tee adapters and plastic fittings</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic clamp</td>
			<td>WaterZoo</td>
			<td>2465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TE-127-2.0-2.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Fluo-4AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M14206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acupunture needles</td>
			<td>LHASA</td>
			<td>TC1.20x13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mL BD syringe with luer-lok</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed vacuum Eppendorf Vagufuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-748-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital signal processing circuit DSP TMS 320</td>
			<td>Texas Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass Dichroic mirror 567nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>DMLP567L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>Stock# 33-437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>Stock# 33-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass colored glass filter 590 nm&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>FGL590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator for laser</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MX130R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode fiber optic 200&#181;m NA 0.39</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>FT200UMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEDs blue</td>
			<td>Lumileds</td>
			<td colspan="2">L135-B475003500000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEDs green</td>
			<td>Lumileds</td>
			<td colspan="2">L135-G525003500000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cube beam splitter, non-polarizing</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BS007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36&#34; Length, Dovetail Optical Rail</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>54-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5&#34; Width, Dovetail Carrier</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>54-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75&#34; Travel, micrometer stage</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>37-983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail optical rail 3&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RLA075/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail rail carrier 1&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode Helix 902</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>HELIX-902-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective holder XY Translator&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>ST1XY-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum breadboard 6&#34;x6&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MB6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexus otpical table 4&#39;x6&#39;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>T46HK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel cap screws</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>HW-KIT5/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic&#160; sheet</td>
			<td>Home Depot/Lowes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy gel&#160;</td>
			<td>Walmart/Home Depot</td>
			<td>2-part 5 min clr 1oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G1.5 Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base, 25mmx75mmx10mm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BA1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire shelve posts 36&#34;</td>
			<td>Alera</td>
			<td>AALESW59PO36SR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire shelves</td>
			<td>Alera</td>
			<td>ALESW582424SR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post and angle clamp</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC/M-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe for dye chamber</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W851020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper</td>
			<td>Home Science Tools</td>
			<td>CE-STOP01C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

local field fluorescence microscopy: imaging cellular signals in intact hearts

kalbinde, moleküler sinyal çalışmaları genellikle izole miyositlerde yapılmaktadır. Ancak, bu tür iskemi ve aritmi gibi birçok patolojik durum sadece tamamen tüm organ düzeyinde anlaşılabilir. Burada, bozulmamış kalbinde hücresel sinyallerin ölçümünü sağlar yerel alan floresan mikroskobu (LFFM) spektroskopik tekniğini sunuyoruz. teknik, bir Langendorff perfüze kalp ve flüoresan sinyal kaydetmek için bir optik elyafın bir kombinasyonuna dayanmaktadır. LFFM normal ve patolojik şartlar altında kalbi incelemek için kardiyovasküler fizyoloji alanında çeşitli uygulamalar vardır. Birden fazla kalp değişkenler farklı floresan göstergeler kullanılarak izlenebilir. Bunlar sitozolik [Ca2 +], intra-sarkoplazmik retikulum [Ca2 +] ve membran potansiyelleri bulunmaktadır. eksojen floresan sondalar heyecanlı ve yayılan floresan LFFM Epifloresans tekniğinin üç farklı düzenlemeler ile tespitBu çalışmada sunulan s. Bu teknikler arasında merkezi farklar uyarma ve ikaz ışığı modüle edilir yolda kullanılan ışık kaynağının türü vardır. sürekli dalga LFFM (CLFFM) uyarma sürekli lazer ışığı kullanır iken darbeli LFFM (PLFFM) lazer ışık darbeleri kullanır. Son olarak, ışık yayan diyotlar (LED), bir üçüncü ışık kaynağı olarak kullanıldı. Bu sigara, tutarlı bir düzenleme darbeli LED floresan mikroskobu (PLEDFM) olarak adlandırılır.

Endokardiyuma ve epikarda AP ve Ca 2 + transientler ventriküler duvar boyunca sinyalleri karşılaştırmak için, bir fiber optik endokarda konumlandırılmış ve endokard diğer. epicardium gelen biriyle endokarda kaydedilen bir AP morfolojisi karşılaştırılması transmural fonksiyonunu değerlendirmek için en iyi yoldur. vent...

Watch this Scientific Journal Video about Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts at JoVE.com

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

kalbinde, moleküler olaylar organın elektrik ve kasılma fonksiyonunu koordine ederler. Burada sunulan yerel alan floresan mikroskopi teknikleri bir dizi sağlam kalplerinde hücresel değişkenlerin kaydedilmesini sağlar. kalp fonksiyonlarını tanımlayan mekanizmaları belirleme kalp patolojik durumlar altında nasıl çalıştığını anlamada önemlidir.

Yerel Alan Floresan Mikroskopi: Bozulmamış Kalpler Hücresel Sinyalleri Görüntüleme

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Geniş Alan Mikroskop kullanarak Uzun vadeli Görüntüleme Memeli Hücreleri

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Retina Bipolar Hücreler TIRF Mikroskopi Görüntüleme ekzositoz

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...