Name: development of a refined protocol for trans-scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes
Uploaded: 2017-08-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes at JoVE.com

אנחנו רוצים להודות לפטי לדרמן על הסיוע על הניתוח, סוזן בורדן להכנה תאי RPE. אנו גם להכיר NYSTEM C028504 לצורך מימון לפרויקט זה. ג'סטין ד מילר נתמך על-ידי NIH הענק F32EY025931.

בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC)-המדינה באוניברסיטת ניו יורק באולבני.
1. הזרקת טרום הכנה
<ol><li>
הכנת השעיה תא hRPESC-RPE הערה: כל השלבים הבאים מבוצעות בתרביות רקמה סטרילי הוד, היכרות עם סטרילי טכניקה בסיסית נדרשת.<ol>
<li>ב?...

<ol>
	<li>De Jong, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration.">Age-related macular degeneration.</a> N Engl J Med. 355, 1474-1485 (2006).</li><li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).</li><li>Ambati, J., Fowler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+agerelated+macular+degeneration.">Mechanisms of agerelated macular degeneration.</a> Neuron. 75, 26-39 (2012).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+Pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration.">Age-related macular degeneration.</a> N Engl J Med. 358 (24), 2606-2617 (2008).</li><li>Lund, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats.">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li><li>Vugler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+and+retinal+repair.">Embryonic stem cells and retinal repair.</a> Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).</li><li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li><li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+Stargardt's+macular+dystrophy:+follow-up+of+two+open-label+phase+1/2+studies.">Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies.</a> Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).</li><li>Stanzel, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RPE+Stem+Cells+Grown+into+Polarized+RPE+Monolayers+on+a+Polyester+Matrix+Are+Maintained+after+Grafting+into+Rabbit+Subretinal+Space.">Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space.</a> Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).</li><li>Blenkinsop, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adult+retinal+pigment+epithelial+stem+cell-derived+RPE+monolayers+exhibit+key+physiological+characteristics+of+native+tissue.">Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).</li><li>Salero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+RPE+can+be+activated+into+a+multipotent+stem+cell+that+produces+mesenchymal+derivatives.">Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).</li><li>Davis, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RPE+Stem+Cell-Derived+RPE+Preserves+Photoreceptors+in+the+Royal+College+of+Surgeons+Rat:+Method+for+Quantifying+the+Area+of+Photoreceptor+Sparing.">Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).</li><li>Westenskow, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performing+Subretinal+Injections+in+Rodents+to+Deliver+Retinal+Pigment+Epithelium+Cells+in+Suspension.">Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension.</a> J Vis Exp. (95), e52247 (2015).</li><li>Lopez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+Retinal+Pigment+Epithelium+Modifies+the+Retinal+Degeneration+in+the+RCS+Rat.">Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).</li><li>Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+Transplantation+of+MACS+Purified+Photoreceptor+Precursor+Cells+into+the+Adult+Mouse+Retina.">Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina.</a> J Vis Exp. (84), e50932 (2014).</li><li>Nair, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Common+Anesthetics+on+Eye+Movement+and+Electroretinogram.">Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram.</a> Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).</li><li>McGill, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+central+nervous+system+stem+cells+-+neuroprotection+in+retinal+degeneration.">Transplantation of human central nervous system stem cells - neuroprotection in retinal degeneration.</a> Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).</li><li>Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+retinal+pigment+epithelium+cells+are+retained+in+the+cell+cycle+and+proliferate+in+vivo.">Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo.</a> Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).</li><li>Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+of+ARPE-19+and+Schwann+Cells+to+the+Subretinal+Space+in+RCS+Rats.">Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).</li><li>Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+corneal+opacities+in+the+rat.">Induced corneal opacities in the rat.</a> Br J Ophthalmol. 51 (2), 124-129 (1967).</li></ol>

טכניקת הזרקת subretinal המתואר במאמר זה היא באמצעות מסלול טרנס-scleral, שבו מחט מזרק חודר השכבות החיצוניות (sclera-שכבה דמית-RPE קומפלקס) של הקיר העין ללא פגיעה עצבית ברשתית או מטריד את חלל בזגוגית. גישה טרנס-vitreal חלופי יש סיכון פוטנציאלי של העדשה נזק המוביל קטרקט, מאז עדשה של מכרסמים שוכן הרוב של חלל בזג...

הרשתית האנושית ממוקם בירכתי הפונקציות העין כמו רקמה חושית אור, משחק תפקיד קריטי בתפיסה חזון. תפקוד לקוי של תאים ברשתית או מוות של תאים ולכן גורם בעיות ראייה או עיוורון תמידי. הפרעות ניוון או תפקוד לקוי של התאים בשכבות השונות של הרשתית ידועים כמו מחלות רשתית ניווניות, ביניהם AMD הוא הסוג הנפוץ ביותר הגורם המוביל לעיוורון בלתי הפיך אצל הקשישים במדינות המפותחות 1,2. תהליך פתולוגי של AMD מזוהה עם הצטברות "drusen" בין השכבה RPE הקרום של ברוך הבסיסית, אשר בתורו פוגע RPE תמיכה של פיזיולוגיה קולט אור, המוביל ניוון רשתית עצבי הראייה הפסד3, 4,5. עד כה, אין שום תרופה לקבלת מתקדם יבש AMD (שאינם neovascular). הופעתה של טיפול בתאי גזע כמו פרדיגמה חדשה ב רפואה רגנרטיבית מביא את התקווה של החלפת תאי RPE לקוי או מת עם תאי גזע-derived תאים בריאים. ואכן, מחקרים מקיפים פרה של משתילים גזע תאים (למשל, תאי גזע עובריים אנושיים)-תאי RPE נגזר לתוך מודלים RPE-ניוונית היית בביצוע6,7, אשר חלקם התקדמו אל ניסויים קליניים8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). לאחרונה, מקור חלופי של תאי גזע תושב בשכבה RPE האנושי, תאי הגזע האנושי RPE (hRPESCs), זוהה על ידי המעבדה שלנו ומשמש כיום במחקרים פרה של טיפול השתלת תאים (hRPESC-RPE) נגזר-RPE hRPESC ל- AMD 10 , 11 , 12 , 13.
טכניקת הזרקת subretinal מוחל במחקרים פרה שהוזכרו לעיל על ידי קבוצות מרובות, כולל הקבוצה שלנו. ישנן שתי גישות כלליות להזרקה subretinal בבעלי חיים: טרנס-vitreal, טרנס-scleral. הגישה הטרנס-vitreal יש את היתרון של המנתח היכולת לצפות ישירות בקצה המחט כפי שזה חודר העין הקדמי, חוצה את החלל כולו vitreal סמוכים על העדשה, חודר הרשתית מאחור את העין כדי להגיע את subretinal מקום14,15,16. עם זאת, זה דורש שיבוש הרשתית בשני מיקומים (anterior ואת אחורי), נושאת את הסיכון של פגיעה העדשה והיא יכולה לגרום בתוך זרם אחורי של תאים לתוך הזגוגיות כאשר המחט "ניתק". לעומת זאת, הגישה הטרנס-בסקלרה, בעקרון, מונע מעורבות של הרשתית, הזגוגיות, ויוצא זרם אחורי העין. בחולדות פיגמנט, המנתח יכול לצפות בתחילה חדירה בסקלרה, אבל לאחר המעבר לתוך דמית פיגמנט, בקצה המחט אינה גלויה. ללא התבוננות ישירה, פורצים הרשתית נפוץ, עלול לגרום הקרע ברשתית ואספקה של תאים ו/או דם לתוך הזגוגיות. יתר על כן, כי השטח העין עקום, זה מאוד קשה לדעת איזה זוויות המחט ועומקי יעילים ביותר לזריקות טרנס-scleral.
במאמר זה דמיינו, אנחנו מציגים את שיטת הזרקת subretinal טרנס-scleral הודיע על ידי שימוש הערכות לאחר ניתוח עם אופטי טומוגרפיה קוהרנטיות (אוקטובר), אשר מאפשר בדיקה מקיפה של ההזרקה. הטכניקה שלנו הזרקה טרנס-scleral מנצל במיקומים מוגדרים, זוויות, בעומק של מחטים הזרקת לייצר טראומה כירורגי נמוך מאוד, אמינות גבוהה. כאן, במיוחד נדגים ההזרקה של תאי hRPESC-RPE לחלל subretinal של העכברוש RCS, דגם פרה-קליניים של AMD אנושי. בשיטה זו זריקה, בהצלחה ובעקביות נמסר לנו תאים hRPESC-RPE לחלל subretinal RCS עיניו חולדה עם שיעור הצלחה גבוה מאוד. הזרקה של תאי נמצאה בעבר את התוצאה שימור RCS photoreceptors לפחות 2 חודשים לאחר הזרקת13. הליך זה מבוצע תחת המיקרוסקופ ויבתר והוא קל ללמוד. זה דורש שני אנשים (מנתח ועוזר) כדי לבצע את הזריקה, הזמן הממוצע של הזרקת עבור כל בעל חיים הוא פחות מ-5 דקות. זוויות מוגדר ועומקי מחטים הזרקת מאפשרים עבור מעבדות, איפה OCT אינה זמינה להשיג הזרקת subretinal מוצלח. הוא מאפשר גישה subretinal מאוד לשחזור, יכול לשמש לא רק עבור השתלת תא, אלא גם עבור טיפולים תרופתיים משלוח וג'ין.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td style="width:256px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-072</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DNAse I</td>
			<td style="width:256px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN-25</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">1xDulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline without Calcium &#38; Magnesium (1xDPBS-CMF)</td>
			<td style="width:256px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">431219</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sterile Balanced Salt Solution (BSS)</td>
			<td style="width:256px;">Alcon</td>
			<td style="width:119px;">00065079550</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sterile eye wash</td>
			<td style="width:256px;">Moore Medical</td>
			<td style="width:119px;">75519</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sterile 0.9% saline</td>
			<td style="width:256px;">Hospira</td>
			<td style="width:119px;">488810</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%)</td>
			<td style="width:256px;">Akorn</td>
			<td style="width:119px;">17478026312</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%)</td>
			<td style="width:256px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:119px;">24208058559</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock</td>
			<td style="width:256px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:119px;">42702010305</td>
			<td style="width:231px;">This is used to make 2.5% Phenylepherine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Buprenex</td>
			<td style="width:256px;">Patterson</td>
			<td style="width:119px;">433502</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:256px;">APP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">63323051610</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">615090040</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:256px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:119px;">2546.70-5</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:259px;">Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel</td>
			<td style="width:256px;">Novartis</td>
			<td style="width:119px;">78042947</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops</td>
			<td style="width:256px;">Alcon</td>
			<td style="width:119px;">00065143105</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:259px;">hRPESC-RPE cells</td>
			<td style="width:256px;">Not available commercially</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">Please refer to &#34;Reference #12&#34; for cell isolation and mainteinance.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">24-well plates</td>
			<td style="width:256px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3526</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Conical tubes (15 ml)</td>
			<td style="width:256px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62554002</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Microcentrifuge cap with o-ring</td>
			<td style="width:256px;">LPS inc</td>
			<td style="width:119px;">L233126</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml)</td>
			<td style="width:256px;">LPS inc</td>
			<td style="width:119px;">L233041</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:256px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5804R</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sterile alcohol wipe</td>
			<td style="width:256px;">McKesson</td>
			<td style="width:119px;">58-204</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sterile cotton tip applicators</td>
			<td style="width:256px;">McKesson</td>
			<td style="width:119px;">24-106-2S</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sterile Weck-Cel spears</td>
			<td style="width:256px;">Beaver-Visitec International&#160;</td>
			<td style="width:119px;">0008680</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sterile surgical drapes&#160;</td>
			<td style="width:256px;">McKesson</td>
			<td style="width:119px;">25-515</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Gauze</td>
			<td style="width:256px;">McKesson</td>
			<td style="width:119px;">16-4242</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Nanofil syringe (10 ul)</td>
			<td style="width:256px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">Nanofil</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Nanofil beveled 33-gauge needle</td>
			<td style="width:256px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">NF33BV-2</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Insulin syringe needles 31-gauge</td>
			<td style="width:256px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">328418</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Rat toothed forceps</td>
			<td style="width:256px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">555041FT</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:259px;">Vannas Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td style="width:256px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-5602</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Circulating water T pump&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Stryker</td>
			<td style="width:119px;">TP700</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Heating pad</td>
			<td style="width:256px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:119px;">TPZ-814</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Animal anesthesia system</td>
			<td style="width:256px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">EZ-7000</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Balance</td>
			<td style="width:256px;">Ohaus</td>
			<td style="width:119px;">PA1502</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:256px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Stemi 2000</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Microscope light source</td>
			<td style="width:256px;">Schott</td>
			<td style="width:119px;">ACE series</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:259px;">Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System</td>
			<td style="width:256px;">Bioptigen</td>
			<td style="width:119px;">R2210</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sterile black marker pen</td>
			<td style="width:256px;">Viscot Industries</td>
			<td style="width:119px;">1416S-100</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Miniature measuring scale</td>
			<td style="width:256px;">Ted Pella Inc</td>
			<td style="width:119px;">13623</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">Infrared Basking Spot Lamp&#160;</td>
			<td style="width:256px;">EXO-TERRA</td>
			<td style="width:119px;">PT2144</td>
			<td style="width:231px;">This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery&#160; phase</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a refined protocol for trans-scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes

מחלות רשתית ניווניות כגון הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD) הן הגורם המוביל של אובדן ראייה בלתי הפיך ברחבי העולם. AMD מאופיין על ידי ניוון תאים (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית, אשר הם טפט של תאים פונקציונלית ותמיכה אנטומית לעטוף עצביים ברשתית. טיפולי תרופתי הנוכחי AMD שאינו neovascular (AMD יבש) רק להאט את התקדמות המחלה, אך לא ניתן לשחזר את החזון, המחייב מחקרים שמטרתם זיהוי אסטרטגיות טיפוליות מקוריות. החלפת תאי RPE ניוונית עם תאים בריאים מביאות הבטחה להתייחס AMD יבש בעתיד. מחקרים מקיפים פרה של תאי גזע החלפת טיפולים ל- AMD לערב את השתלת תאי RPE נגזר תאי גזע לתוך מרחב subretinal של דגמים בעלי חיים, שבו מוחל על טכניקת ההזרקה subretinal. הגישה תכוף במחקרים אלה בעלי חיים פרה היא דרך המסלול טרנס-scleral, אשר נעשית קשה על ידי חוסר של פריט חזותי ישיר של הסוף מחט יכול לעיתים קרובות לגרום נזקים ברשתית. גישה חלופית דרך הזגוגיות מאפשר התבוננות ישירה של העמדה קצה המחט, אבל זה סיכון גבוה של טראומות כירורגיים כמו רקמות העין יותר נגרמת הפרעה. פיתחנו פחות מסוכן לשחזור ששונה הזרקה טרנס-scleral שיטה המשתמשת המחט מוגדר זוויות ועומקי בהצלחה ובעקביות לספק תאי RPE לחלל subretinal חולדה, למנוע פגיעה ברשתית מוגזמת. תאים מועברים באופן זה הוכחו בעבר בתמימותה בחולדה המלכותי המנתחים (RCS) לפחות 2 חודשים. טכניקה זו יכולה לשמש לא רק עבור השתלת תא, אלא גם עבור משלוח של מולקולות קטנות או בטיפולים גנטיים.

שימוש בטכניקה המתוארת במאמר זה, אנחנו בעקביות נמסר hRPESC-RPE תאים לחלל subretinal של חולדות RCS על ידי שליטה בדיוק את מיקום, זווית ועומק של החדרת מחט מזרק לתוך הרקמה (איור 1B-D ). מיד בוצעה ההשתלה הבאים, בדיקת OCT להתבונן ההזרקה, את bleb subretinal שנוצרו על-ידי התאים המושתלים....

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes at JoVE.com

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

הזרקת subretinal הוחל נרחב במחקרים פרה של טיפול בתאי גזע חלופי עבור ניוון מקולרי הקשור לגיל. במאמר זה דמיינו, נתאר טכניקה הזרקת subretinal פחות מסוכן, הדירים בדיוק ששונתה באמצעות הגישה הטרנס-scleral להעביר תאים לתוך עיניו חולדה.

פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת Subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: ​​פרוטוקול מהיר

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

העשרה של ממברנה של ברוך מעיני אדם תורמות

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

יחיד תא RNA-Seq של קבוצות מוגדרות של תאים גנגליון רשתית

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

A Protocol for Measuring Cue Reactivity in a Rat Model of Cocaine Use Disorder

פרוטוקול למדידת Cue תגובתיות במודל של עכברים של הפרעה לשימוש בקוקאין

Cocaine use disorder (CUD) follows a trajectory of repetitive self-administration during which previously neutral stimuli gain incentive value. Cue ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

השתלת Homochronic של סימנים מקדימים Interneuron לתוך מוח העכבר כמחנכת מוקדם

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D ניתוח קימטי עבור הערכה פונקציונלית במודל חולדה של פציעה העצבים הגיד מעיכה

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...