Name: hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents
Uploaded: 2017-01-22T15:00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents at JoVE.com

We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience - DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.

Alle dieren werden behandeld in volledige overeenstemming met de Deense en Europese regelgeving. Toestemming nummer: 2012-15-2934. 1. Voorbereiding van de spuit voor hydraulische extrusie van het ruggenmerg <ol><li> Voor een volwassen rat, gebruik dan een 10 ml spuit. Voor een volwassen muis gebruikt een 5 ml spuit. Voor pups, gebruik dan een 2,5 ml spuit. </li><li> Stel een niet-filter pipet universeel geschikt voor 2-200 pl pipetten door het trimmen van de grote einde van de pipetpunt totdat deze goed past bij de spuit. Plaats de aangepaste pipet tip over de spuit. Voor pups, gebruik maken van een 23 G of soortgelijke naald in plaats van een aangepaste pipet tip. </li><li> Zuig ijskoude steriele PBS en laat de spuit op het ijs tot verder gebruik. </li></ol> 2. Euthanasie <ol><li> Do breken van de nek niet uit te voeren, omdat dit de wervelkolom verstoren waardoor extrusie onmogelijk. </li><li> Voor volwassen rat / muis, euthanaseren behulp van gas, zoals CO 2 of isofluRane. Deze stoffen zijn schadelijk. Voer euthanasie in een zuurkast en omgaan met de stoffen volgens de richtlijnen instelling. (LET OP: CO 2: H280, P410, P403, isofluraan: H361d, P260, P281, P280) <ol><li> Om ervoor te zorgen dat het knaagdier is dood, zorgen voor afwezigheid van reflex door knijpen een poot met een pincet. Onthoofden het knaagdier met behulp van grote schaar. Voor pups, euthanaseren door onthoofding. </li></ol></li></ol> 3. Isolatie van de wervelkolom <ol><li> Bestrooi water op de vacht om het haar te controleren. </li><li> Met behulp van een schaar, opengesneden de vacht langs de wervelkolom in een distale richting en isoleer de wervelkolom door te snijden aan beide zijden langs de wervelkolom langs het heupbeen. Snijd het ruggenmerg distaal aan het bekken met een schaar. OPMERKING: De rostrale-caudale as wordt aangeduid als de proximale-distale as gehele protocol. <ol><li> Trim de wervelkolom met een schaar om de proximal- voorkomenmeeste en meest distale gebieden omdat deze de wervelkolom te S-vormige succesvolle ruggenmerg extrusie maken. Controleer of de ruggenmerg zichtbaar is aan beide uiteinden. Als het ruggenmerg niet zichtbaar is, trim de wervelkolom met een schaar tot het ruggenmerg zichtbaar wordt. </li></ol></li></ol> 4. Hydraulische extrusie van het Spinal Cord <ol><li> Plaats een petrischaaltje (100 mm diameter) gevuld met steriele PBS op ijs. </li><li> Strek de wervelkolom door toepassing van een wijsvinger op het gebogen gedeelte (meest proximale uiteinde) van de wervelkolom, waardoor de wervelkolom zoveel mogelijk rechttrekken. <ol><li> Voor pups, vermijd buigen van de wervelkolom, de wervels wordt verstoord waardoor ruggenmerg extrusie onmogelijk. </li></ol></li><li> Plaats de pipetpunt (23 G naald voor pups, als alternatief 18 G naald voor volwassen muizen) aan het meest distale einde van de wervelkolom. Indien correct geplaatst, wordt de tip gestabiliseerd in de spinale holte. </li><li> Controleer of de wervelkolom zoveel mogelijk wordt rechtgetrokken. Solliciteer constante druk, en extrusie van de ruggenmerg in de petrischaal op ijs. Controleer of het ruggenmerg op ijs vochtig gehouden door hem in PBS totdat verdere behandeling. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig1.jpg" /> Figuur 1: Vertegenwoordiger ruggenmerg. Hydraulisch geëxtrudeerd ruggenmerg. Van links naar rechts: volwassen rat, volwassen muis, muis pup. Lumbale vergrotingen gekenmerkt door doos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 5. Identificatie van ganglia (DRG) <ol><li> Splitsing van de wervelkolom in twee gelijke langsdelen met een schaar en plaats de gespleten wervelkolom onder de microscoop. </li><li> Identificeer de T13 wervel segment door<html> lokaliseren van de bevestigingsplaats van de meest distale costae de wervelkolom aandacht niet aan de costae de buurt intercostale zenuwen verwarren. De meest distale costae zijn bevestigd aan het proximale gedeelte van de wervel segment T13 en T13 de DRG zich distaal wervel T13 en proximaal aan wervel L1. </li><li> Identificeer gelijktijdige DRG in de distale richting. Voor een volwassen rat, gelijktijdige DRG verschijnen wit met duidelijk zichtbare dorsale en ventrale wortels. Voor een volwassen muis, gelijktijdig DRG verschijnen wit met duidelijk zichtbare dorsale en ventrale wortels. Voor pups, gelijktijdige DRG&#39;s verschijnen als heldere bollen. </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig2.jpg" /> Figuur 2: Identificatie van DRG in wervelkolom na extrusie van het ruggenmerg. De wervelkolom is gesplitst waardoor visualisatie van DRG zoals met pijlen. Geïllustreerd door volwassen rat en muis pup.<html> ref = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. 6. Isolatie van DRG <ol><li> Aantal Petrischalen (30 mm in diameter) volgens de specifieke DRG&#39;s te isoleren, bijvoorbeeld L3, L4, L5. Vul het Petri gerechten met ijskoude steriele PBS en leg ze op ijs. </li><li> Met behulp van micro schaar, knippen dorsale en ventrale wortels dicht bij de DRG mogelijk worden gelost terwijl het vermijden van beschadiging van de DRG. </li><li> Met het puntje van gesloten pincet voorzichtig schep DRG en overbrengen naar de overeenkomstige genummerde petrischaaltjes. </li></ol><img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig3.jpg" /> Figuur 3: Representatieve geïsoleerd DRG. Van links naar rechts: volwassen rat, volwassen muis, muis pup.&quot;_blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. 7. Verwerking van weefsels voor verdere analyse <ol><li> Western blotting <ol><li> Isoleer het weefsel gebied van belang, zoals het ruggenmerg lumbale uitbreiding. Indien nodig, scheiden het ruggenmerg in ipsilaterale en contralaterale zijden en verder in dorsale en ventrale horens. </li><li> Plaats het weefsel in lysisbuffer zoals TNE lysisbuffer (10 mM Tris-base, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 in tweemaal gedestilleerd H 2 O) die geschikte enzymremmers op ijs. </li><li> Homogeniseer het weefsel gedurende ongeveer 30 s op ijs met behulp van een mechanisch malen stamper. </li><li> Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 16.000 xg bij 4 ° C en het supernatant gebruikt voor verdere verwerking volgens standaardprotocollen 5, 6 of laat de supernatant bij -20 ° C tot verder gebruik. </li></ol></li><li> RNA-analyse <ol><li> Isoleer het weefsel van belang. </li><li> Onmiddellijk in zijn weefsel in RNA stabilisatie oplossing van het RNA voor opslag stabiliseren. </li><li> Isoleer RNA volgens standaardprotocollen 7. </li><li> Converteren RNA in cDNA en qPCR uitgevoerd volgens standaardprotocollen 7. </li></ol></li><li> immunohistochemie <ol><li> Voor vers ingevroren weefsel (van toepassing op ruggenmerg): <ol><li> Bereid droog ijs poeder door het verpulveren van droge ijsblokjes tot een bedrag dat overeenkomt met twee eetlepels poeder. Bedek droog ijsblokjes in een doek en verpulveren de kubussen met een hamer. Plaats zilverfolie (ongeveer 5 cm x 5 cm) op een laag droog ijsblokjes en hebben betrekking op de zilverfolie met droog ijs poeder. </li><li> Plaats het ruggenmerg gebied geselecteerd voor verdere analyse op de droge poeder ijs met een pincet, laat het snap-vries, en de overdracht van het ruggenmerg naar een cryo buis. Houd het op droog ijs te allen tijde of op te slaan bij -80 ° C tot verder geleide. </li><li> Transfer het ruggenmerg naar een cryostaat (-20 ° C). Indien nodig, trim het ruggenmerg in de cryostaat. Plaats het ruggenmerg inbedden materiaal binnen de cryostaat om het hechten aan de objectplaatje. </li><li> Snijd het ruggenmerg in de gewenste dikte, bijvoorbeeld 5 micrometer, en laat op glasplaten. Verwarm de glasplaten met een vinger onmiddellijk vóór weefselverzameling beter verankeren. Houd overgebleven weefsel in cryo buizen bij -80 ° C tot verder gebruik. </li><li> Laat de secties op glasplaten in de cryostaat tot klaar voor post-fixing. </li><li> Post-fix secties door onderdompeling in 4% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeren kleuring volgens standaardprotocollen 8. </li></ol></li><li> Vaste weefsel voor cryo snijden (van toepassing op ruggenmerg en DRG) <ol><li> Fix ruggenmerg en DRG&#39;s in 4% PFA (2 uur voor het ruggenmerg, 1,5 uur voor de muis DRG en 4 uur voor rat DRG) bij4 ° C (plaats ruggenmerg horizontaal geplaatst om te voorkomen dat bevestiging in een gebogen positie). </li><li> Breng het weefsel tot 25% w / v sucrose overnacht bij 4 ° C. Het weefsel kan worden opgeslagen in 25% w / v sucrose aangevuld met enkele druppels 10% natriumazide microbiële contaminatie bij 4 ° C tot verder gebruik te voorkomen. Indien nodig, trim het ruggenmerg te maken van de lumbale uitbreiding alleen op een silicone boord of iets dergelijks. </li><li> Gebruik de punt van een papieren handdoek zuigen overmaat sucrose oplossing van het weefsel. </li><li> Vul een cryo mal helft met het inbedden van materiaal. Duw eventuele luchtbellen aan de zijkanten van de cryo mal met hulpmiddelen zoals gesloten pincet. </li><li> Plaats het weefsel op de inbedding materiaal met behulp van een pincet en zorgen voor de gewenste weefsel oriëntatie. </li><li> Vul het cryo mal volledig met het inbedden van materiaal en duw eventuele luchtbellen zo ver mogelijk van het weefsel mogelijk (bijvoorbeeld door het gebruik van gesloten pincet). </li><li> Vul een petrischaal (100 mmin diameter) met 2-methylbutaan. Deze stof is schadelijk. Voer deze stap in een zuurkast en omgaan met de stof volgens instelling richtlijnen (LET OP: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310). </li><li> Plaats de petrischaal op een laag van droog ijs en voeg twee droge ijsblokjes de petrischaal. Plaats de cryo schimmel in de petrischaal en laat de inbedding materiaal om volledig te bevriezen. </li><li> Houd de ingebed weefsel op droog ijs te allen tijde en bij -80 ° C omwikkeld met Parafilm tot verdere verwerking. </li><li> Snijd het weefsel op een cryostaat (-20 ° C) in de gewenste dikte, bijvoorbeeld 5 micrometer. </li><li> Voeren kleuring volgens standaardprotocollen 8. </li></ol></li><li> Vaste weefsel voor paraffine-inbedding (van toepassing op ruggenmerg en DRG) <ol><li> Fix ruggenmerg en DRG&#39;s in 4% PFA (2 uur voor het ruggenmerg 1,5 uur voor muizen en DRG&#39;s 4 h voor rat DRG) bij 4 ° C (place ruggenmerghorizontaal geplaatst om te voorkomen dat bevestiging in een gebogen positie). </li><li> Breng het weefsel tot 25% w / v sucrose overnacht bij 4 ° C. Het weefsel kan worden opgeslagen in 25% w / v sucrose aangevuld met enkele druppels 10% natriumazide microbiële contaminatie bij 4 ° C tot verder gebruik te voorkomen. </li><li> Isoleer het weefsel gebied van belang, zoals het ruggenmerg lumbale uitbreiding. </li><li> Vul een inbedding mal helft met paraffine. </li><li> Afkoelen de inbedding mal kort door het op de koeling gebied van de inbedding machine om de paraffine licht verharden. Dit zorgt voor een betere positionering weefsel. </li><li> Plaats het weefsel in de gewenste oriëntatie in de inbedding mal. Vul het inbedding mal met paraffine en onmiddellijk te koelen. </li><li> Plaats de paraffine bevattende inbedding vorm bij 4 ° C gedurende de nacht volledig laten uitharden en verwijder het paraffineblok met het weefsel van de matrijs insluiten. </li><li> Cut secties ona microtoom in de gewenste dikte, bijvoorbeeld 5 micrometer. </li><li> Voeren kleuring volgens standaardprotocollen 8. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Res Notes. 9, 82 (2016).</li><li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice.">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li><li>Meikle, A. D., Martin, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+removal+of+the+spinal+cord.">A rapid method for removal of the spinal cord.</a> Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+using+the+thermo+scientific+Solaris+qPCR+assay.">Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections">https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections</a> (2014)</li><li>Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Nervous System. , 424-426 (2012).</li><li>Rigaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+and+strain+differences+in+rodent+sciatic+nerve+anatomy:+implications+for+studies+of+neuropathic+pain.">Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain.</a> Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).</li><li>Green, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+non-genetic+factors+which+influence+the+type+of+the+skeleton+in+an+inbred+strain+of+mice.">Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice.</a> Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).</li><li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+electrophysiology.">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+in+vitro+morphofunctional+analysis+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia.</a> Ann Anat. , 62-67 (2016).</li><li>Peeraer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+evaluation+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+as+an+in+vitro+model+for+diabetic+neuropathy.">Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy.</a> J Pain Res. 4, 55-65 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Wanneer de wervelkolom wordt verstoord, bijvoorbeeld door cervicale dislocatie, de ruggenmerg splitsen tijdens extrusie. Als het ruggenmerg kan worden geëxtrudeerd, kan de wervelkolom iets afgesneden buiten en binnen de extrusie poging kan worden herhaald. Indien het gehele ruggemerg noodzakelijk voor verdere analyse, namelijk bestaande uit de cervicale uitbreiding en de lumbale vergroting, de wervelkolom moet alleen worden bijgesneden. Als alleen de lumbale vergroting noodzakelijk voor verdere analyse, moet het ruggenmerg worden getrimd volgens de onderhavige protocol. De wervelkolom moet worden rechtgetrokken met behulp van de vingertoppen aan de extrusie te verlichten. Het protocol geldt voor knaagdieren van alle leeftijden en wordt hier geïllustreerd door een volwassene muizen (8 weken), een muis pup (5 dagen) en volwassen ratten (10 weken). Afhankelijk van het type dier en de stam, kan het aantal thoracale en lumbale secties variëren 9, </sup&gt; 10, 11. Afhankelijk van de eiwitten te analyseren, volwassen knaagdieren worden geperfuseerd met enzym remmende oplossingen voorafgaand aan euthanasie. Als het uitvoeren van een experiment met eenzijdige zenuwletsel, kan het ruggenmerg worden gesplitst in ipsilaterale en contralaterale zijden met behulp van ultra-fijne pincet direct na de extrusie. Verder kan elke zijde worden gesplitst in dorsale en ventrale zijden. Het weefsel kan vervolgens worden verwerkt voor verdere analyses, zoals Western blotting. Transcardial perfusie-fixatie met PFA vóór ruggenmerg extrusie moet worden vermeden, aangezien dit maakt het ruggenmerg niet flexibel en voorkomt ruggenmerg hydraulische extrusie. Hydraulische ruggenmerg extrusie zal afscheuren de dorsale wortels. Voor experimenten waarbij bevestigd dorsale wortels nodig zijn, wordt laminectomie aanbevolen. Bovendien worden spinale hersenvliezen verloren hydraulische extrusie, die kan worden vermeden door standaard laminectomie Hydraulische extrusie van het ruggenmerg en DRG isolatie kan ook worden uitgevoerd met geoxygeneerd kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) plaats ijskoude PBS. Het gebruik van ACSF maakt behoud van het geïsoleerde weefsel in een betere fysiologische omgeving, hetgeen vooral van belang bij latere elektrofysiologische opnames 12, 13. Een alternatief kan zijn ACSF PBS dat 1 g / l glucose voor het genereren van primaire DRG culturen 14. Hydraulische extrusie van het ruggenmerg is een beduidend snellere methode dan de traditionele manier ruggenmerg isolatie door laminectomie, waardoor weefsel doorlooptijd en dus minder kans op schade aan eiwitten. Perfusie met een hechtmiddel voorafgaand aan het isoleren van het ruggenmerg door laminectomie kan het risico van weefselbeschadiging tijdens dissectie en tijdens de laatste verwijdering van het verminderenruggenmerg van de wervelkolom. Echter, weefsel fixatie de weg staat aan de toepasselijkheid ervan op analyses, zoals Western blotting. Hydraulische extrusie opbrengsten structureel beschadigd weefsel 3 geschikt voor een breder scala van analyses. Consistente identificatie van DRG&#39;s kan moeilijk zijn. Dit is echter essentieel voor weefselanalyse, bijvoorbeeld na heupzenuw letsel. Nummering van de DRG volgens hun lokalisatie ten opzichte van de costae, kan DRG consistent geïdentificeerd. Kleuring van ruggenmergweefsel en DRG kunnen worden geoptimaliseerd door middel van de geïllustreerde weefselbehandeling variaties in Protocol stap 7.

Het algemene doel van deze methode is het ruggenmerg isoleren alsook DRG 1 identificeren en te isoleren, 2. Hydraulische extrusie van het ruggenmerg is een beduidend snellere methode dan de traditionele manier ruggenmerg isolatie door laminectomie, dwz door het breken van de wervelkolom een voor een, en dit reduceert de kans op weefselbeschadiging veroorzaakt door de dissectie proces 3, 4 . DRG kan moeilijk te identificeren zijn. Correcte identificatie is van groot belang voor tissue-analyse, bijvoorbeeld na heupzenuw letsel. Nummering van de DRG volgens hun lokalisatie ten opzichte van de costae, kan DRG consistent geïdentificeerd. Weefsel geïsoleerd door technieken die hier getoond kunnen worden toegepast op een groot aantal analyses zoals Western blotting 5,6, 7 en qPCR immunohistochemische kleuring 8. Bij de identificatie DRG, is het belangrijk om rekening te houden dat bekend het aantal ruggemerg segmenten te variëren met diersoort en stam 9, 10, 11. De voordelen bij het uitvoeren van deze werkwijze in muizen het grote aantal genetisch gemodificeerde varianten beschikbaar en de relatief lage kosten behuizing. De voordelen in het gebruik van ratten zijn de relatief hoge opbrengst en weefsel als betrekken zenuw verwondingen, zal de procedure worden verlicht met de grootte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 14084-08</td>
			<td>For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td># 5427 R</td>
			<td>For centrifugation of homogenized tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># CM 3050 S</td>
			<td>For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont, # 3</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 11231-30</td>
			<td>For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont, # 5</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 11252-20</td>
			<td>For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 %</td>
			<td>Abbott</td>
			<td># 002185</td>
			<td>For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane GPR rectapur</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td># 24872.298</td>
			<td>For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># RM 2155</td>
			<td>For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 76243</td>
			<td>For paraffin embedding; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin tissue embedding station</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># EG1160</td>
			<td>For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestel, motor cordless</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># Z359971-1EA</td>
			<td>For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td># 121V</td>
			<td>For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># P7741</td>
			<td>For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor, Phosstop</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 04906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, 1-200 &#956;l, no filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td># 70.1189.105</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Complete</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 05892791001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># R0901</td>
			<td>For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Protect Mini KiT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 74124</td>
			<td>For RNA isolation; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td># REF0203</td>
			<td>For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge</td>
			<td>Bochem</td>
			<td># 4070</td>
			<td>For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, 130 mm cutting edge</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td># 1902.0130</td>
			<td>For isolation of spinal cord (adult rat)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 15009-08</td>
			<td>For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Terumo</td>
			<td># SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x</td>
			<td>Leica</td>
			<td># 10446370</td>
			<td>Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td># 10010-015</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 23 G x 1&#34;, 0.6 x 25 mm</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td># NN-2325R</td>
			<td>For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td># NN-1838S</td>
			<td>Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura</td>
			<td># 4583</td>
			<td>Tssue embedding material for later cryosectionning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNE-lysis buffer</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td># 10128-582</td>
			<td>For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

Hydraulisch geëxtrudeerd ruggenmerg vertonen een glad oppervlak onbeschadigd figuur 1. De uitbreiding lumbale kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd als het verdikte gebied van het ruggenmerg, ingesloten figuur 1. De dorsale en ventrale zijden van het ruggenmerg kan worden geïdentificeerd op het oog volgens de morfologie. In figuur 1 wordt de ventrale zijde naar de kijker, herkenbaar door een duidelijke scheiding langs de gehele ruggemerg. Twee bredere lijnen langs de ruggengraat nauwkeurig worden bepaald rugzijde. Op het meest distale uiteinde, kan de cauda equina soms verbonden blijven bij volwassen ratten en volwassen muizen. Individuele DRG kunnen alleen worden geïdentificeerd die zich bevinden in de ruggengraat, figuur 2. Na afsluiting figuur 3, kunnen de individuele DRG niet worden aangetoond uiterlijk. Indien nodig, is dusbelangrijk om ze duidelijk gescheiden op isolement. Na isolatie kan het ruggenmerg en DRG&#39;s verwerkt en gekleurd zoals beschreven in stap 7.3 en weergegeven in figuur 4. Figuur 4a toont een immunohistochemische kleuring van DRG waar de neuronen en hun omgeving satelliet gliacellen zijn duidelijk zichtbaar. Door correcte identificatie van de DRG is het mogelijk om het effect van heupzenuw letsel analyseren op soma van de verwonde neuronen en hun omgeving satelliet gliacellen. Figuur 4b een Nissl-kleuring van een hydraulisch geëxtrudeerd ruggenmerg waarbij het weefsel intact gereflecteerd door de gladde randen van het profiel. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig4.jpg" /> Figuur 4: representatieve weefselsecties. A. Immunohistochemische kleuring van DRG sectie. B. Nissl gebrandschilderd section hydraulisch geëxtrudeerd ruggenmerg. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents at JoVE.com

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents (Video) | JoVE

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

Hydraulische extrusie van het ruggenmerg en isolatie van achterwortelganglia in Knaagdieren

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord (Video) | JoVE

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury (Video) | JoVE

Chromatine immunoprecipitatie van achterwortelganglia Tissue volgende axonale schade

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo (Video) | JoVE

Meten Spinal Presynaptische Remming in muizen door dorsale wortel Potentiële Recording<em&gt; In Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration (Video) | JoVE

Achterwortelganglia Neuronen en Gedifferentieerde Adipose-afgeleide stamcellen: Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultuur Model naar regeneratie van perifere zenuwen Bestudeer

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model (Video) | JoVE

In Vitro Modellering van kanker zoals Neurale Invasion: De dorsale wortel ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation (Video) | JoVE

De Voorbereiding van de Oblique Spinal Cord Slices voor Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice (Video) | JoVE

Spinal Cord Neurons Isolatie en Cultuur van Neonatale Muizen

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release (Video) | JoVE

Dorsal Root Ganglia isolatie en primaire cultuur te bestuderen van de Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages (Video) | JoVE

Snelle isolatie van dorsale wortel ganglion macrofagen

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning (Video) | JoVE

Verrijking van volwassen muis dorsale wortel ganglia neuronculturen door immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...