Name: using zebrafish models of human influenza a virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses
Uploaded: 2017-01-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses at JoVE.com

The authors wish to thank Mark Nilan for zebrafish care and maintenance and Meghan Breitbach and Deborah Bouchard for propagating NS1-GFP and determining IAV titers. This research was supported by NIGMS grant NIH P20GM103534 and the Maine Agricultural and Forest Experiment Station (Publication Number 3493).

Tous les travaux doivent être effectués en utilisant le niveau de biosécurité 2 (ou NSB2) normes décrites par les US Centers for Disease Control (CDC) et conformément aux directives établies par Institutional Animal Care et l&#39;utilisation des comités (IACUC). S&#39;il vous plaît conférer avec les fonctionnaires compétents pour assurer la sécurité et la conformité. 1. Zebrafish Entretien et maintenance <ol><li> Spawn zebrafish et de recueillir le nombre requis d&#39;embryon...

Afin de maximiser les avantages tirés de l&#39;utilisation d&#39;un petit animal pour modéliser les interactions hôte-pathogène humain, il est important d&#39;encadrer les questions de recherche et de tester des hypothèses qui misent sur les avantages inhérents du système modèle. En tant que modèle pour l&#39;infection IAV humaine, le poisson zèbre a plusieurs points forts, y compris une fécondité élevée, la clarté optique, amenability au dépistage de drogues, et la disponibilité des lignées transgéni...

Selon l&#39;Organisation mondiale de la santé (OMS), les virus grippaux infectent 5-10% des adultes et 20-30% des enfants chaque année et causent 3-5 millions de cas de maladie grave et jusqu&#39;à 500.000 décès dans le monde 1. vaccinations annuelles contre la grippe restent la meilleure option pour prévenir les maladies. Des efforts comme le Plan d&#39; action mondial de l&#39; OMS ont augmenté l&#39; utilisation du vaccin saisonnier, la capacité de production de vaccins, et la recherche et le développement dans les stratégies de vaccination plus puissants afin de réduire la morbidité et la mortalité associées à des flambées de grippe saisonnière 2. Les médicaments antiviraux tels que les inhibiteurs de la neuraminidase (par exemple zanamivir et l&#39; oseltamivir) sont disponibles dans certains pays et se sont avérés efficaces dans les symptômes atténuants, lorsqu&#39;il est administré dans les 48 premières heures d&#39;apparition 3, 4, 5. Malgré les efforts mondiaux, le confinement de la grippe saisonnière oustbreaks reste un formidable défi à ce moment, que le virus de la grippe dérive antigénique dépasse souvent les capacités actuelles pour adapter à l&#39;évolution du génome du virus 6. stratégies de vaccins ciblant de nouvelles souches de virus doivent être mis au point à l&#39;avance et sont parfois rendues moins une efficacité optimale en raison de changements imprévus dans les types de souches qui prédominent éventuellement dans une saison grippale. Pour ces raisons, il y a un besoin évident de développer des stratégies thérapeutiques alternatives pour contenir les infections et réduire la mortalité. En obtenant une meilleure compréhension des interactions hôte-virus, il peut être possible d&#39;élaborer de nouveaux médicaments anti-grippaux et des traitements adjuvants 7, 8. L&#39;hôte-grippe humaine Une interaction virus (IAV) est complexe. Plusieurs modèles animaux d&#39;infection IAV humaine ont été développés afin de mieux comprendre l&#39;interaction hôte-virus, yment les souris, les cobayes, les rats de cotonniers, les hamsters, les furets et les macaques 9. Tout en fournissant des données importantes qui ont amélioré la compréhension de la dynamique hôte-IAV, chaque organisme modèle possède des inconvénients importants qui doivent être considérés lors de la tentative de traduire les résultats en médecine humaine. Par exemple, les souris, qui sont le modèle le plus largement utilisé, ne développent pas facilement des symptômes d&#39;infection IAV induites lorsqu&#39;ils sont infectés par la grippe humaine isole 9. En effet , les souris manquent de tropisme naturel pour les isolats de la grippe humaine étant donné que les cellules epitheliales de souris expriment des liaisons alpha-2,3 d&#39;acide sialique à la place des liaisons α-2,6 d&#39;acide sialique exprimés sur les cellules épithéliales humaines 10. Les protéines hémagglutinine présentes dans IAV isolats humains se lient favorablement et pénètrent dans les cellules hôtes portant des liaisons acide sialique alpha-2,6 par endocytose médiée par le récepteur 9, 11, </sup&gt; 12, 13. En conséquence, il est maintenant admis que dans le développement de modèles de souris pour la grippe humaine, il faut prendre soin de jumeler la souche appropriée de la souris avec la souche appropriée de la grippe afin d&#39;atteindre phénotypes de la maladie qui récapitulent les aspects de la maladie humaine. En revanche, les cellules épithéliales des voies respiratoires supérieures du furet possèdent des liaisons alpha-2,6 d&#39;acide sialique qui ressemblent à des cellules humaines 14. Furets infectés partagent plusieurs des caractéristiques pathologiques et cliniques observées dans la maladie humaine, y compris la pathogénicité et la transmissibilité des virus grippaux humains et aviaires 14, 15. Ils sont aussi extrêmement sensibles à des essais d&#39;efficacité du vaccin. Néanmoins, le modèle de furet pour la grippe humaine présente plusieurs inconvénients principalement liés à leur taille et le coût de l&#39;élevage qui font l&#39;acquisition de statistiquement signifidonnées catifs difficiles. En outre, les furets ont déjà affiché des différences dans la pharmacocinétique des médicaments, la biodisponibilité et la toxicité qui rendent les tests d&#39;efficacité difficile. Par exemple, les furets présentent une toxicité pour le canal ionique M2 16 inhibiteur amantadine. Ainsi, il est clair que dans le choix d&#39;un modèle animal pour étudier des questions sur les infections IAV humaines, il est important de tenir compte des avantages et des limites inhérentes, et l&#39;aspect de l&#39;interaction hôte-virus qui est sous enquête. Le poisson zèbre, Danio rerio, est un modèle animal qui offre des possibilités uniques pour enquêter sur l&#39; infection microbienne, hôte réponse immunitaire, et les thérapies médicamenteuses potentielles 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, &lt;classe sup = &quot;xref&quot;&gt; 24, 25, 26, 27, 28. La présence d&#39;acide sialique α-2,6-liés à la surface des cellules dans le poisson zèbre a suggéré sa sensibilité à l&#39; IAV, qui a été confirmé dans des études d&#39;infection et imager in vivo en utilisant une souche rapporteuse fluorescente de 19 IAV. Chez le poisson zèbre IAV infectées, l&#39; augmentation de l&#39; expression des ifnphi1 et MXA transcrits anti - viraux ont indiqué qu&#39;une réponse immunitaire innée a été stimulée, et la pathologie affichée par le poisson zèbre IAV infectés, y compris l&#39; oedème et la destruction des tissus, a été similaire à celui observé dans les infections de la grippe humaine . En outre, l&#39;IAV inhibiteur de neuraminidase antiviral Zanamivir mortalité limitée et la réplication virale réduite dans zebrafish 19. Dans ce rapport, un protocole de système d&#39;amorçageinfections ic IAV dans des embryons de poisson zèbre est décrite. Utilisation de zanamivir à des doses cliniquement pertinentes comme une preuve de principe, l&#39;utilité de ce modèle d&#39;infection zebrafish IAV pour les composés de criblage pour l&#39;activité antivirale est démontrée. En outre, un protocole pour générer une version localisée, l&#39; infection de l&#39; épithélium IAV dans la vessie natatoire du poisson zèbre, un organe qui est considéré comme anatomiquement et fonctionnellement analogue au poumon de mammifère 21, 29, 30, 31, est décrit. L&#39;utilisation de ce modèle d&#39;infection IAV localisée, le recrutement des neutrophiles au site de l&#39;infection peut être suivi, ce qui permet des enquêtes sur le rôle des neutrophiles dans la biologie infection IAV et de l&#39;inflammation. Ces modèles se complètent de poisson zèbre modèles animaux existants d&#39;infections IAV humaines et sont particulièrement utiles pour tester de petites molécules et les réponses des cellules immunitaires à cause de la possibilité de renforcer spuissance STATISTIQUE, capacité de modérée à des essais à haut débit, et les capacités de suivre le comportement des cellules immunitaires et la fonction de la lumière-microscopie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>Spectrum Brands</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x 25 mm sterile disposable Petri dishes&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;89107-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine- S (MS-222)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary with filament&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument&#160;</td>
			<td>BF120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>&#160;P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zanamivir</td>
			<td>AK Scientific</td>
			<td>G939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72700-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage calibration slide&#160;</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>MR095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-3 pressure injector&#160;</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Back pressure unit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>BPU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder kit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPIP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot switch</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>FSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MM33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>Magnetic Base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P-4758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SteREO Discovery.V12</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>HXP 200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold light source</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>CL6000 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom multiwell plate, 24 well</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P24G-0-13-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td colspan="2">IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism v6</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus&#160;</td>
			<td>Charles River&#160;</td>
			<td>490710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)&#160;</td>
			<td>Charles River&#160;</td>
			<td>490715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza NS1-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Referenced in Manicassamy et al. 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpx:mCherry)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Referenced in Lam et al. 2013</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using zebrafish models of human influenza a virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Ici, des données montrant comment l&#39; infection IAV systémique chez le poisson zèbre peut être utilisé pour tester l&#39; efficacité des médicaments (figure 1A) sont fournis. Embryons à 48 heures après la fécondation sont injectés avec APR8 (figures 1C, 1E), X-31 (figures 1D, 1G) ou NS1-GFP (figures 1 H-1I) par l&#39; intermédiaire du canal de Cuvier pour initier une infection virale. Une autre cohorte d&#...

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Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Utilisation de modèles Zebrafish de grippe humaine A Infections au virus pour le dépistage médicaments antiviraux et Caractériser hôte réponses immunitaires cellulaires

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

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