Name: using zebrafish models of human influenza a virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses
Uploaded: 2017-01-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses at JoVE.com

The authors wish to thank Mark Nilan for zebrafish care and maintenance and Meghan Breitbach and Deborah Bouchard for propagating NS1-GFP and determining IAV titers. This research was supported by NIGMS grant NIH P20GM103534 and the Maine Agricultural and Forest Experiment Station (Publication Number 3493).

כל העבודה צריכה להתבצע באמצעות biosafety ברמה 2 (או BSL2) סטנדרטים המתוארים על-ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות (CDC) ובהתאם להוראות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדות שימוש (IACUC). אנא להתייעץ עם הגורמים המתאימים על מנת להבטיח בטיחות ותאימות. <p class="jove_title" style=";text-align:right...

כדי למקסם את היתרונות זכו משימוש חיה קטנה מודל אינטראקציות מארח הפתוגן אנושיים, חשוב לנסח שאלות מחקר ושערות בדיקה כי לנצל את היתרונות טמונים במערכת המודל. כמודל הידבקות בני אדם IAV, דג הזברה יש מספר חוזקות, כוללים פוריות גבוהה, בהירות אופטית, amenability כדי הקרנת סמים, וזמי?...

על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), נגיפי שפעת להדביק 5-10% של מבוגרים 20-30% מהילדים בשנה ולגרום 3-5 מיליון מקרים של מחלה חמורה עד 500,000 מקרי מוות ברחבי העולם 1. חיסונים נגד שפעת שנתיים להישאר האפשרות הטובה ביותר כדי למנוע מחלות. מאמצים מהסוג תוכנית הפעולה העולמי WHO גדלו השימוש בחיסון העונתי, קיבולת ייצור החיסון, ומחקר ופיתוח לתוך אסטרטגיות חיסון חזקה יותר על מנת להפחית את התחלואה והתמותה הקשורים התפרצויות שפעת עונתית 2. תרופות אנטי-ויראליות כמו מעכבי נורמינידאז (למשל Zanamivir ו Oseltamivir) זמינות במדינות מסוימות ו הוכיחו יעיל בתסמינים מקילות, כאשר מנוהלות בתוך 48 שעות מהופעה 3 הראשונות, 4, 5. למרות מאמצים הגלובליים, הכלה של שפעת עונתית outbreaks עדיין מהווה אתגר עצום בשלב זה, כפי להיסחף אנטיגני וירוס שפעת לעיתים קרובות עולה היכולות הנוכחיות להסתגל הגנום המשתנה של הנגיף 6. אסטרטגיות חיסון מיקוד זנים של וירוס חדש יש לפתח מראש ולפעמים ניתנים פחות יעיל בצורה אופטימלית בשל שינויים בלתי צפויים סוגי זנים שבסופו של דבר שולטים מגיפת שפעת. מסיבות אלו, יש צורך ברור לפתח אסטרטגיות טיפוליות חלופיות המכיל זיהומים וצמצום תמותה. על ידי השגת הבנה טובה יותר של האינטראקציה המאכסנת-הווירוס, זה עשוי להיות אפשרי לפתח תרופות נגד שפעת חדשות וטיפולים אדג&#39;ובנט 7, 8. מארח השפעת האנושית וירוס (IAV) אינטראקציה מורכבת. במודלים של בעלי חיים כמה הידבקות בני אדם IAV פותחו על מנת לקבל תובנות לגבי האינטראקציה מאכסן-וירוס, including עכברים, שרקנים, חולדות כותנה, אוגרים, חמוסים, ואת קופי 9. תוך מתן מידע חשוב שיפרו את הבנת הדינמיקה מאכסן IAV, כל אורגניזם מודל בעל חסרונות משמעותיים כי יש לקחת בחשבון כאשר מנסים לתרגם את הממצאים רפואת האדם. לדוגמה, עכברים, שהן המודל הנפוץ ביותר, לא בקלות לפתח סימפטומים IAV הנגרמת זיהום כאשר נגוע בשפעת אדם מבודד 9. הסיבה לכך היא כי עכברים חסרי הכמיהות הטבעיות לשפעת אדם מבודדות מאז תאי אפיתל העכבר להביע α-2,3 קשרי חומצת sialic במקום α-2,6 קשרי חומצת sialic הביעו על תאים אנושיים אפיתל 10. חלבוני hemagglutinin נוכח אדם IAV מבודדים לאגד לטובה וזן תאי מארחי נושאות α-2,6 קשרי חומצת sialic באמצעות אנדוציטוזה מתווך קולטן 9, 11, </sעד&gt; 12, 13. כתוצאה מכך, הוא היום מקובל בפיתוח מודלי עכבר לשפעת אדם, יש להקפיד על מנת לשייך את המתח המתאים של עכבר עם הזן המתאים של שפעת על מנת להשיג פנוטיפים מחלה כי לשחזר היבטים של המחלה האנושית. לעומת זאת, תאי אפיתל דרכי הנשימה העליונות של חמוסים להחזיק α-2,6 קשרי חומצת sialic דומות 14 תאים אנושיים. חמוסים אינפקטד לשתף רבות מהתכונות פתולוגיים וקליניים שנצפתה מחלות אנושיות, כולל פתוגניות ויכולת ההעברה של נגיפי שפעת אנושית העופות 14, 15. הם גם מאוד מקובלים ניסוייים יעילות חיסון. עם זאת, המודל החמוס לשפעת אדם יש מספר חסרונות הקשורים בעיקר גודלן ועלות הגידול בעלי שהופכים רכישת סטטיסטית מובהקתנתוני צביעות מאתגרים. בנוסף, חמוסים הפגינו בעבר בדלים הפרמקוקינטיקה סמים, זמינות ביולוגית, ורעילות שהופכים יעילות בדיקות קשות. לדוגמה, חמוסים להפגין רעילות amantadine מעכב ערוץ יון M2 16. לפיכך, ברור כי בבחירה במודל חיה בחקר שאלות על זיהומי אדם IAV, חשוב לשקול יתרונות הטבועים בו ומגבלות, וההיבט של האינטראקציה מאכסן-הווירוס כי הוא תחת חקירה. דג הזברה, Danio rerio, הוא במודל חיה המספק הזדמנויות ייחודיות לחקר זיהום מיקרוביאלי, לארח תגובה חיסונית, וטיפולים תרופתיים פוטנציאל 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, &lt;sup class = &quot;Xref&quot;&gt; 24, 25, 26, 27, 28. הנוכחות של α-2,6 צמודות חומצות sialic על פני השטח של תאי דג הזברה הציעה הרגישות שלו IAV, אשר היה מובל החוצה במחקרי זיהום צלם in vivo באמצעות זן כתב ניאון של IAV 19. בשנת דג הזברה IAV נגועים, ביטוי מוגבר של תמלילי ifnphi1 ו MXA אנטי הצביעו על כך תגובה חיסונית מולדת היה מגורה, ואת הפתולוגיה שהפגינו דג הזברה IAV נגועים, כולל בצקת והרס רקמות, היה דומה לזה שנצפה זיהומים שפעת אנושית . יתר על כן, התמותה המוגבלת אנטי נורמינידאז IAV מעכב Zanamivir ו שכפול נגיפי מופחת של דג זברה 19. בדו&quot;ח זה, פרוטוקול לייזום מערכתic IAV זיהומים עוברי דג הזברה מתואר. שימוש Zanamivir במינונים רלוונטיים קליני בתור הוכחה של עיקרון, השירות של מודל דג זברת IAV זיהום בתרכובת הקרנה לפעילות אנטי מודגם. בנוסף, פרוטוקול להפקה מקומית, דלקת IAV אפיתל של דג הזברה לשחות שלפוחית שתן, איבר נחשב מבחינה אנטומית והן מבחינה תפקודית מקביל הריאה היונקת 21, 29, 30, 31, מתואר. שימוש זה מודל זיהום מקומי IAV, גיוס נויטרופילים לאתר של זיהום יכול להיות במעקב, המאפשר חקירות לתוך התפקיד של ביולוגיה נויטרופילים זיהום ודלקת IAV. מודלי דג זברה אלה משלימים במודלים של בעלי חיים קיימים של זיהומי אדם IAV והם שימושיים במיוחד לבדיקת מולקולות קטנות ותגובות תא חיסון בשל האפשרות של ים משופרכוח tatistical, יכולת בינונית מבחני תפוקה גבוהה, ואת היכולות לעקוב אחר התנהגות התא החיסונית ותפקוד עם מיקרוסקופ אור.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>Spectrum Brands</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x 25 mm sterile disposable Petri dishes&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;89107-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine- S (MS-222)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary with filament&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument&#160;</td>
			<td>BF120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>&#160;P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zanamivir</td>
			<td>AK Scientific</td>
			<td>G939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72700-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage calibration slide&#160;</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>MR095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-3 pressure injector&#160;</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Back pressure unit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>BPU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder kit</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPIP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot switch</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>FSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MM33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic base</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>Magnetic Base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P-4758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low temperature incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SteREO Discovery.V12</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>HXP 200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold light source</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>CL6000 LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom multiwell plate, 24 well</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P24G-0-13-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td colspan="2">IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism v6</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus&#160;</td>
			<td>Charles River&#160;</td>
			<td>490710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)&#160;</td>
			<td>Charles River&#160;</td>
			<td>490715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza NS1-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Referenced in Manicassamy et al. 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mpx:mCherry)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Referenced in Lam et al. 2013</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using zebrafish models of human influenza a virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

הנה, נתונים המראים כיצד מערכתי זיהום IAV דג הזברה יכול לשמש כדי לבדוק את יעילות תרופה (איור 1 א) הנם מסופקים. עובר ב 48 שעות לאחר הפריה מוזרקת עם APR8 (1C הדמוי, 1F), X-31 (1D הדמוי, 1G), או שהם ns1-GFP (איורי 1H-ט 1) דרך הצינור של קיביה ל...

Watch this Scientific Journal Video about Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses at JoVE.com

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

באמצעות מודלי דג זברה של נגיף שפעת A האדם למסך תרופות אנטי ולאפיין מארח תגובות תא חיסון

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

שלית Decidual אדם תרבויות איברים ללמוד זיהומים בבית הממשק האם והעובר

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

מבחני מדידת שפעת בנטרול תגובות נוגדנים וירוסים A(H3N2) סרה האנושי על-ידי Microneutralization באמצעות תאים MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

הדמיה קונאפוקלית של זוגיות גדילי RNA ודפוס זיהוי רצפטורים להדבקת וירוס RNA שלילי-סנס

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...