Name: analysis of chromosome segregation, histone acetylation, and spindle morphology in horse oocytes
Uploaded: 2017-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes at JoVE.com

De auteurs willen Fabrice Vincent bedanken voor de ondersteuning met laserscanning confocal microscopy (LSCM) , en Philippe Barrière en Thierry Blard voor het uitvoeren van dagelijkse ultrasone ovarium scan en hCG injectie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het project &quot;Ex-Ovo Omnia&quot;, &quot;Regione Sardegna en Regione Lombardia&quot; (subsidie ​​nr. 26096200 naar AML); De &quot;L&#39;Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012&quot; gemeenschap (Contract 2012 tot FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, Research Executive Agency (REA) &quot;Pro-Ovum&quot; (Toekenning nr. 303640 tot VL); En door de Postdoctorale School van Landbouw en Veterinaire Geneeskunde, mede gefinancierd door het Europees Sociaal Fonds, Sectorieel Operationeel Programma voor Personeelsontwikkeling 2007-2013 (Contractnummer POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 tot IM). De in vivo oocyt collectie werd gefinancierd door de Institut Français du Cheval et de l&#39;Equitation.

Alle procedures werden goedgekeurd door het Comité Animal Care and Use CEEA Val de Loire nummer 19 en werden uitgevoerd volgens de richtlijnen voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren. 1. Oocyt Verzameling en In Vitro Maturatie <ol><li> Ovum pick-up <ol><li> Dagelijks beoordelen door middel van echografie de diameter van ovariale follikels in een cohort van volwassen merries. Bij de opkomst van een follikel ≥33 mm (dominante follikel) injecteer de mer...

<ol>
	<li>Dellenbach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transvaginal,+sonographically+controlled+ovarian+follicle+puncture+for+egg+retrieval.">Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval.</a> Lancet. 1 (8392), 1467 (1984).</li><li>Humaidan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+hyperstimulation+syndrome:+review+and+new+classification+criteria+for+reporting+in+clinical+trials.">Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials.</a> Hum Reprod. , (2016).</li><li>Pincus, G., Enzmann, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comparative+Behavior+of+Mammalian+Eggs+in+Vivo+and+in+Vitro+:+I.+The+Activation+of+Ovarian+Eggs.">The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs.</a> J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).</li><li>Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+oocyte+maturation+and+subsequent+delayed+fertilization+is+associated+with+increased+embryo+aneuploidy.">In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy.</a> Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).</li><li>Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+in+vitro+maturation+and+age+on+oocyte+quality+in+the+rhesus+macaque+Macaca+mulatta.">Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta.</a> Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).</li><li>Requena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+in-vitro+maturation+of+oocytes+on+aneuploidy+rate.">The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate.</a> Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).</li><li>Franciosi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+maturation+affects+chromosome+segregation,+spindle+morphology+and+acetylation+of+lysine+16+on+histone+H4+in+horse+oocytes.">In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes.</a> Reprod Fertil Dev. , (2015).</li><li>Franciosi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+histone+H4+acetylation+during+in+vivo+versus+in+vitro+maturation+of+equine+oocytes.">Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes.</a> Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).</li><li>Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+medium+variations+(zinc+supplementation+during+oocyte+maturation,+perifertilization+pH,+and+embryo+culture+protein+source)+on+equine+embryo+development+after+intracytoplasmic+sperm+injection.">Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection.</a> Theriogenology. , (2016).</li><li>Hendriks, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+age+and+in+vitro+culture+affect+mitochondrial+number+and+function+in+equine+oocytes+and+embryos.">Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos.</a> Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).</li><li>Carnevale, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mare+model+for+follicular+maturation+and+reproductive+aging+in+the+woman.">The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman.</a> Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).</li><li>Ginther, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mare:+a+1000-pound+guinea+pig+for+study+of+the+ovulatory+follicular+wave+in+women.">The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women.</a> Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).</li><li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+weakened+centromere+cohesion+is+a+leading+cause+of+age-related+aneuploidy+in+oocytes.">Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes.</a> Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).</li><li>Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+a+defective+spindle+assembly+checkpoint+is+not+the+primary+cause+of+maternal+age-associated+aneuploidy+in+mouse+eggs.">Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs.</a> Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).</li><li>Larionov, A., Krause, A., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standard+curve+based+method+for+relative+real+time+PCR+data+processing.">A standard curve based method for relative real time PCR data processing.</a> BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).</li><li>Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+maturation+of+equine+oocytes+collected+by+follicle+aspiration+and+by+the+slicing+of+ovaries.">In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries.</a> Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inadequate+histone+deacetylation+during+oocyte+meiosis+causes+aneuploidy+and+embryo+death+in+mice.">Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).</li><li>Homer, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad2+prevents+aneuploidy+and+premature+proteolysis+of+cyclin+B+and+securin+during+meiosis+I+in+mouse+oocytes.">Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes.</a> Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).</li><li>Rambags, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+chromosomal+abnormalities+in+equine+embryos+produced+in+vivo+and+in+vitro.">Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro.</a> Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).</li><li>Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-mode+regulation+of+the+APC/C+by+CDK1+and+MAPK+controls+meiosis+I+progression+and+fidelity.">Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity.</a> J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).</li><li>Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubule+establishment+is+defective+in+oocytes+from+aged+mice.">Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice.</a> Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).</li><li>Luzzo, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+diet+induced+developmental+defects+in+the+mouse:+oocyte+meiotic+aneuploidy+and+fetal+growth+retardation/brain+defects.">High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects.</a> PLoS One. 7 (11), e49217 (2012).</li><li>Ma, P., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+2+(HDAC2)+regulates+chromosome+segregation+and+kinetochore+function+via+H4K16+deacetylation+during+oocyte+maturation+in+mouse.">Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003377 (2013).</li><li>Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+hyperacetylation+during+meiosis+interferes+with+large-scale+chromatin+remodeling,+axial+chromatid+condensation+and+sister+chromatid+separation+in+the+mammalian+oocyte.">Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte.</a> Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).</li><li>Luciano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocytes+isolated+from+dairy+cows+with+reduced+ovarian+reserve+have+a+high+frequency+of+aneuploidy+and+alterations+in+the+localization+of+progesterone+receptor+membrane+component+1+and+aurora+kinase+B.">Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B.</a> Biol Reprod. 88 (3), 58 (2013).</li><li>Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+membrane+component+1+expression+and+putative+function+in+bovine+oocyte+maturation,+fertilization,+and+early+embryonic+development.">Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development.</a> Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).</li><li>Terzaghi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGRMC1+participates+in+late+events+of+bovine+granulosa+cells+mitosis+and+oocyte+meiosis.">PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis.</a> Cell Cycle. , 1-14 (2016).</li><li>Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+in+the+mammalian+oocyte+in+space+and+time.">Translation in the mammalian oocyte in space and time.</a> Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).</li><li>Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternally+recruited+DCP1A+and+DCP2+contribute+to+messenger+RNA+degradation+during+oocyte+maturation+and+genome+activation+in+mouse.">Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse.</a> Biol Reprod. 88 (1), 11 (2013).</li></ol>

Hoewel IVM al meer dan 20 jaar 16 is uitgevoerd in paarden, weten we nog niet of de oocyt de oorsprong kan zijn van embryonale aneuploïdie, zoals voor mensen is voorgesteld 17 . De reden is waarschijnlijk dat de bereiding van oocytspreidingen voor chromosoomtelling resulteert in aanzienlijk monsterverlies. Met dit in het achterhoofd werd een onderzoek uitgevoerd naar de methoden die gebruikt werden om fouten bij chromosoom-segregatie te onderzoeken om te zoeken naar de me...

Een groot aantal geassisteerde voortplantingstechnieken is ontwikkeld om onvruchtbaarheid bij vrouwen, gezelschapsdieren en bedreigde diersoorten te behandelen. Een van de meest voorkomende procedures in klinische instellingen is het ophalen van metafase II (MII) -stage-oocyten uit de ovariumfollikels door middel van ultrageluidgeleide transvaginale aspiratie, Ovumopname (OPU) 1 . Deze oocyten worden vervolgens in vitro (IVF) bevrucht, waarbij de resulterende embryo&#39;s in een ontvanger van de ontvanger geïmplanteerd worden. De MII-fase (rijpe) oocyten worden opgehaald na de toediening van exogene gonadotropinen. Deze behandeling is echter bij sommige patiënten geassocieerd met de ontwikkeling van ovarium hyperstimulatie syndroom (OHSS) 2 . Profiteer van het intrinsieke vermogen van volgroeide, onvolwassen oocyten (GV-stadium) om meiosis spontaan te hervatten zodra ze zijn geïsoleerd uit hun follikels, het is mogelijk om volwassen oocyten te verkrijgen zonder adminisGonadotropine 3 . Deze procedure heet oocyt in vitro rijping (IVM) en vertegenwoordigt een minder geneesmiddelgeoriënteerde, goedkopere en meer patiëntvriendelijke aanpak van geassisteerde voortplantingstechnologie. Echter, het succes van embryo-ontwikkeling met in vitro- veroude oocyten is in het algemeen lager dan bij in vivo gerijpte oocyten 4 , 5 . Een mogelijke verklaring is dat in vitro rijpende oocyten meer getroffen worden door fouten bij chromosomsegregatie, en de resulterende aneuploïdie vermindert de normale embryonale ontwikkeling 6 . Het begrijpen van de moleculaire basis van chromosomale mis-segregatie tijdens IVM zou uiteindelijk het volledige potentieel van deze techniek onthullen. In deze ader gebruikte de experimentele aanpak de morfologische en biochemische kenmerken van in vitro- veroude oocyten, in vergelijking met in vivo maturEd oocyten wordt hier beschreven 7 , 8 . Specifiek worden de procedures voor de OPU van onvolwassen en rijpe oocyten en de IVM van onrijpe oocyten geïllustreerd met behulp van volwassen en natuurlijk fietsende paarden als een experimenteel model. Daarna worden immunofluorescentie en beeldanalyse gebruikt om chromosomsegmentatie, spindelmorfologie en het globale patroon van histonacetylering op deze gameten te onderzoeken. Tenslotte wordt een protocol van omgekeerde transcriptie en kwantitatieve PCR beschreven voor de analyse van mRNA expressie. In vergelijking met knaagdierdiermodellen, laten paarden geen genetische manipulatie toe, zijn ze minder makkelijk te manipuleren en duur onderhoud nodig. Dit model krijgt echter grote belangstelling voor de studie van oocytematuratie 9 , 10 door de gelijkenis met menselijke eierstokkenfysiologie 11 , 12 &lt;/ Sup&gt;. Bovendien heeft de ontwikkeling van betrouwbare protocollen van IVM-IVF in het paard een aanzienlijk economisch belang, aangezien het het aantal veulen van merries van hoge genetische waarde zou kunnen verhogen. Een van de beperkingen van het uitvoeren van experimenten op oocyten, vooral bij monovulatoire soorten, is de beperkte beschikbaarheid van het monster. Deze limiet is hier overwonnen door een aanpak, die eerder in muizen is ontwikkeld, aan te passen aan paardocyten 13 , 14 om chromosoomtelling te verrichten die het monsterverlies minimaliseert (zie de bespreking voor een vergelijking met andere beschikbare technieken). Bovendien is een triple-fluorescentie kleuring protocol geoptimaliseerd om meerdere analyses op hetzelfde monster te voeren en q-PCR analyses werden alleen uitgevoerd op pools van 2 oocyten. Over het geheel genomen beschrijft de onderhavige studie een experimentele aanpak gericht op morfologisch en biochemisch chaRacterize het paard oocyt, een celtype dat uitermate uitdagend is om te studeren door de lage beschikbaarheid van het monster. Het kan echter onze kennis van de voortplantingsbiologie en onvruchtbaarheid van monovulatoire soorten uitbreiden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">ultrasound probe</td>
			<td style="width:159px;">Aloka</td>
			<td style="width:113px;">UST-5820-7,5</td>
			<td style="width:161px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human chorionic gonadotrophin&#160;</td>
			<td>centravet</td>
			<td>CHO004</td>
			<td>1500unit/animal IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">detomidine</td>
			<td>centravet</td>
			<td>MED010</td>
			<td>9-15&#181;g/kg IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">butylscopolamine bromure&#160;</td>
			<td>centravet</td>
			<td>EST001</td>
			<td>0,2mg/kg IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:159px;">NIKON</td>
			<td style="width:113px;">SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">butorphanol</td>
			<td>centravet</td>
			<td>DOL003</td>
			<td>10&#181;g/kg IV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzyl-penicillin</td>
			<td>centravet</td>
			<td>DEP203 IM</td>
			<td>15000UI/animal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCM199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3769 10X1L</td>
			<td>powder for hepes-buffered TCM199</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3784-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaHCO3-buffered TCM199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2154-500ML</td>
			<td>liquid for IVM medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">epidermal growth factor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">newborn calf serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4762-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well dishes</td>
			<td>NUNCLON</td>
			<td>144444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">incubator</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>BB6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">monastrol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hyaluronidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pronase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>341584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">normal donkey serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>636102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>711-025-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vecta-Shield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">YOPRO1</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Y3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal laser scanning microscope&#160;</td>
			<td>LSM 780&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal laser scanning microscope&#160;</td>
			<td>LSM 700&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ software</td>
			<td colspan="2">rsb.info. nih.gov/ij/download.html&#160;</td>
			<td>free resource</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse anti-alpha-tubulin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-acH4K16</td>
			<td>Upstate Biotechnology</td>
			<td>07-329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNALater</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferase RNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PicoPure RNA Isolation Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>12204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">random hexamers&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>N8080127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>28025013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green supermix&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">specific primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thermal-cycler&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>MyiQ&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse monoclonal anti-CENPA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse monoclonal anti-Aurora B</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3609</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of chromosome segregation, histone acetylation, and spindle morphology in horse oocytes

Het gebied van geassisteerde voortplanting is ontwikkeld om onvruchtbaarheid bij vrouwen, gezelschapsdieren en bedreigde soorten te behandelen. In het paard zorgt geassisteerde voortplanting ook voor de productie van embryo&#39;s van hoge performers zonder hun sportcarrière te onderbreken en draagt ​​bij aan een toename van het aantal veulen van merries van hoge genetische waarde. Het huidige manuscript beschrijft de procedures die worden gebruikt voor het verzamelen van onvolwassen en rijpe oocyten uit paard eierstokken met behulp van ovum pick-up (OPU). Deze oocyten werden vervolgens gebruikt om de incidentie van aneuploïdie te onderzoeken door een protocol dat eerder is ontwikkeld in muizen aan te passen. Specifiek werden de chromosomen en de centromeren van metafase II (MII) oocyten fluorescent gelabeld en geteld op sequentiële brandpuntsplannen na confocale lasermicroscoopscanning. Deze analyse onthulde een hogere incidentie in de aneuploïditempo wanneer onvolwassen oocyten uit de follikels werden verzameld en in vitro gerijpte vergeleken metIn vivo. Immunostaining voor tubuline en de geacyleerde vorm van histon vier bij specifieke lysine residuen bleek ook verschillen in de morfologie van de meiotische spindel en in het globale patroon van histon acetylering. Tenslotte werd de expressie van mRNA&#39;s die coderen voor histon-deacetylasen (HDAC&#39;s) en acetyltransferases (HAT&#39;s) onderzocht door reverse transcriptie en kwantitatieve-PCR (q-PCR). Geen verschillen in de relatieve expressie van transcripten werden waargenomen tussen in vitro en in vivo rijpe oocyten. In overeenstemming met een algemene stilzetting van de transcriptieactiviteit tijdens oocytmaturatie, kan de analyse van het totale transcriptiemengsel alleen mRNA stabiliteit of afbraak onthullen. Daarom wijzen deze bevindingen erop dat andere vertaal- en post-translationele regelingen zouden kunnen worden beïnvloed. In het algemeen beschrijft de onderhavige studie een experimentele aanpak om de paardococyt morfologisch en biochemisch te karakteriseren, een ceHet type dat uitermate uitdagend is om te studeren, is vanwege de lage beschikbaarheid van het monster. Het kan echter onze kennis uitbreiden over de voortplantingsbiologie en onvruchtbaarheid bij monovulatoire soorten.

De oorspronkelijke bevindingen van deze experimenten werden eerder beschreven in de diepte en worden hierin beschreven als een voorbeeld van resultaten die kunnen worden verkregen met behulp van de beschreven protocollen. Rijpingspercentage Van de 32 COC&#39;s die door OPU werden verkregen van dominante follikels, waren 28 (88%) in de MII-fase. Veertien van de 58 COC&#...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes at JoVE.com

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

Dit manuscript beschrijft een experimentele aanpak om paardocyten morfologisch en biochemisch te karakteriseren. Specifiek illustreert het onderhavige werk hoe u onrijpe en volwassen paardocyten verzamelt door middel van ultrageluidgeleide ovumopname (OPU) en hoe u chromosoom-segregatie, spindemorfologie, globale histonacetylering en mRNA-expressie kunt onderzoeken.

Analyse van Chromosoom Segregatie, Histon Acetylatie, En Spindel Morfologie In Paard Oocyten

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Human Biology

Reproduction and Development

SCIENTISTS IN ACTION

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expressie van fluorescerende eiwitten in<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Door mRNA Injectie in onbevruchte eicellen

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Isolatie en karakterisering van de Muis Antral Eicellen Gebaseerd op Hergroepering van nucleoli chromatine Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Ruimtelijke en temporele analyse van Active ERK in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Kiembaan

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende cel beeldvorming van chromosoom segregatie tijdens de mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluatie van de bemesting staat door het traceren van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Visualisatie en analyse van faryngeale boogslagaders met behulp van Whole-mount Immunohistochemie en 3D Reconstructie

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

Minimale volume vitrificatie van onvolwassen feline oocyten

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

In Vitro Cultuur Strategie voor Eicellen uit early antral follikel bij runderen

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...