Name: mitoception: transferring isolated human msc mitochondria to glioblastoma stem cells
Uploaded: 2017-02-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells at JoVE.com

Nous remercions Andrea Parmeggiani (L2C et DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier), ainsi que des membres du laboratoire pour des discussions utiles, Christophe Duperray pour l&#39;aide avec l&#39;analyse FACS, l&#39;installation d&#39;imagerie RIO Montpellier (IRM) pour fournir le environnement adéquat pour FACS et microscopie confocale. BNM a été soutenue par une bourse d&#39;études supérieures du LabEx Numev (convention ANR-10-LabX-20). AB a été soutenu par une bourse de premier cycle de l&#39;Université de Varsovie et de l&#39;Union européenne (n ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV est un scientifique du personnel du Centre national de la recherche scientifique (CNRS).

jour 1 1. Le marquage de la cellule souches mésenchymateuses (MSC) mitochondries (Facultatif) <ol><li> Deux jours avant la préparation des mitochondries, des semences MSCs humaines dans une boîte de culture de 100 mm, dans 10 ml aMEM / FBS 10%, de manière à avoir 4 x 10 5 MSCs en culture le jour 1. </li><li> Rincer avec du PBS MSCs (4 ml) et on ajoute 4 ml d&#39;aMEM / FBS à 1% (préchauffée à 37 ° C). </li><li> Ajouter la quantité requise de mitochondries colorant vital ...

<ol>
	<li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+signaling+organelles.">Mitochondria as signaling organelles.</a> BMC Biol. 12 (1), 34 (2014).</li><li>Schulze, A., Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cancer+metabolism+is+tuned+for+proliferation+and+vulnerable+to+disruption.">How cancer metabolism is tuned for proliferation and vulnerable to disruption.</a> Nature. 491 (7424), 364-373 (2012).</li><li>Peiris-Pages, M., Martinez-Outschoorn, U. E., Pestell, R. G., Sotgia, F., Lisanti, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+metabolism.">Cancer stem cell metabolism.</a> Breast Cancer Res. 18 (1), 55 (2016).</li><li>LeBleu, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1alpha+mediates+mitochondrial+biogenesis+and+oxidative+phosphorylation+in+cancer+cells+to+promote+metastasis.">PGC-1alpha mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis.</a> Nat Cell Biol. 16 (10), 992-1003 (2014).</li><li>Liu, S., Feng, M., Guan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+sensing+by+STING+signaling+participates+in+inflammation,+cancer+and+beyond.">Mitochondrial DNA sensing by STING signaling participates in inflammation, cancer and beyond.</a> Int J Cancer. 139 (4), 736-741 (2016).</li><li>Islam, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transfer+from+bone-marrow-derived+stromal+cells+to+pulmonary+alveoli+protects+against+acute+lung+injury.">Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury.</a> Nat Med. 18 (5), 759-765 (2012).</li><li>Pasquier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+transfer+of+mitochondria+from+endothelial+to+cancer+cells+through+tunneling+nanotubes+modulates+chemoresistance.">Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance.</a> J Transl Med. 11, 94 (2013).</li><li>Plotnikov, E. Y., Khryapenkova, T. G., Galkina, S. I., Sukhikh, G. T., Zorov, D. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+block+of+tunneling+nanotube+(TNT)+formation+inhibits+intercellular+organelle+transfer+between+PC12+cells.">Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells.</a> FEBS Lett. 583 (9), 1481-1488 (2009).</li><li>Gurke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotube+(TNT)-like+structures+facilitate+a+constitutive,+actomyosin-dependent+exchange+of+endocytic+organelles+between+normal+rat+kidney+cells.">Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells.</a> Exp Cell Res. 314 (20), 3669-3683 (2008).</li><li>Vallabhaneni, K. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+cross-talk+between+mesenchymal+stem+cells+and+cardiomyocytes+in+co-culture.">Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture.</a> J Cell Mol Med. 12 (5A), 1622-1631 (2008).</li><li>Acquistapace, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+reprogram+adult+cardiomyocytes+toward+a+progenitor-like+state+through+partial+cell+fusion+and+mitochondria+transfer.">Human mesenchymal stem cells reprogram adult cardiomyocytes toward a progenitor-like state through partial cell fusion and mitochondria transfer.</a> Stem Cells. 29 (5), 812-824 (2011).</li><li>Hase, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-Sec+promotes+membrane+nanotube+formation+by+interacting+with+Ral+and+the+exocyst+complex.">M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex.</a> Nat Cell Biol. 11 (12), 1427-1432 (2009).</li><li>Phinney, D. 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Un nombre croissant d&#39;études montrent que les cellules peuvent échanger des mitochondries et que ces mitochondries ont des effets profonds sur le métabolisme et les fonctions de la cellule cible. Par conséquent, il est essentiel de maîtriser les outils pour transférer quantitativement dans les mitochondries des cellules du donneur à ces cellules cibles afin de permettre une étude précise de leurs effets biologiques. Le protocole décrit ici a été initialement élaboré pour tr...

Les mitochondries sont des organites présents dans les cellules eucaryotes où ils jouent un rôle central dans l&#39;absorption des nutriments, ainsi que dans l&#39;énergie et métabolite production. Ces organites contiennent circulaire de l&#39; ADN mitochondrial (ADNmt), 16,6 kb, qui code pour les protéines des complexes de la chaîne de transport d&#39;électrons, ARNt et ARNr 1. La fonctionnalité de ces organites est essentielle pour l&#39; homéostasie cellulaire et de nombreuses pathologies sont associées à une dysfonction mitochondriale 1, 2, 3. L&#39;état de la mitochondrie a par exemple été liée à l&#39; inflammation, les maladies infectieuses et le cancer, dans ce dernier cas avec des conséquences sur les métastases et la résistance à la thérapie 4, 5, 6, 7. Mitochondries afficher la capacité remarquable de<html> se transférer entre «donneur» et les cellules «cibles». Cela conduit à des changements dans le métabolisme énergétique des cellules cibles, ainsi que dans d&#39; autres modifications fonctionnelles telles que la réparation tissulaire et la résistance aux agents chimiothérapeutiques, comme montré récemment par différents laboratoires 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. Les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM) présentent cette aptitude à transférer les mitochondries à une grande variété de cellules cibles, y compris les cardiomyocytes, les cellules endothéliales, les cellules épithéliales alvéolaires pulmonaires, des cellules tubulaires rénales et les cellules cancéreuses, ce qui conduit à des modifications des propriétés fonctionnelles de ces cellules 8,&gt; 9, 10, 12, 17, 18. l&#39;échange de mitochondrie apparaît maintenant comme un mécanisme largement utilisé qui permet à un certain nombre de types cellulaires différents de communiquer entre eux et modifier leurs propriétés biologiques. Cet échange de mitochondries peut se produire par effet tunnel nanotubes (TNT) formation, impliquant connexine 43 contenant des jonctions lacunaires 8 ou M-Sec / TNFaip2 et exocyste complexes 19. En variante, le transfert de mitochondries a également été montré pour être médiée par arrestine microvésicules domaine contenant la protéine 1-médiation (ARMMS) 20. Fait intéressant, l&#39;efficacité du transfert de mitochondries était liée au taux d&#39;expression de la Rho GTPase 1 MIRO1 21, un facteur clé pour expliquer les différences dans les efficacités de transfert de mitochondries entre iPSC-MSCs et adulte BM-MSCs 22. En dépit de cette richesse des données relatives à l&#39;échange de mitochondries de cellule à cellule, on sait relativement peu sur le métabolisme et le résultat biologique de ce transfert de mitochondries. Par conséquent, il justifie pleinement la mise en place des outils appropriés pour évaluer pleinement les effets biologiques de ce transfert. Au fil des années, plusieurs approches techniques pour transférer les mitochondries des cellules du donneur accepteur ont été proposés. Cela comprend l&#39; injection directe de mitochondries dans des ovocytes 23, 24, 25, la fusion cellulaire pour produire transmitochondrial cybrides 26, 27 et, plus récemment, le transfert des mitochondries isolées à l&#39; aide photothermique nanoblades 28. Nous et d&#39;autres ont démontré précédemment la capacité de mitochond isoléeria à être internalisé par les cellules vivantes, comme on l&#39; observe à la fois in vitro et in vivo , 29, 30, 31, grâce à des mécanismes proposés pour impliquer macropinocytose 32. Nous avons également mis au point un procédé, appelé MitoCeption, pour transférer quantitativement mitochondries isolées ( à partir de cellules souches mésenchymateuses) à des cellules cibles, comme le montre le (adhérent) MDA-MB-231 lignée de cellules de cancer du sein 31. Ce protocole a été adapté ici pour le transfert des mitochondries isolées de MSC humaines aux cellules souches de glioblastome (CSS). Le glioblastome est une tumeur maligne agressives du cerveau qui sont rapidement devenues résistantes au traitement, principalement en raison des cellules souches de glioblastome (GSC) présents dans la tumeur 33. Ces GSCs poussent comme neurosphères in vitro et de générer des tumeurs dans des modèles de xénogreffe. Les cellules cancéreuses au sein de glioblastome ont lala capacité d&#39;établir des connexions de cellule à cellule, comme indiqué récemment pour les cellules astrocytaires de tumeurs cérébrales qui relient via microtubes élargie, à travers laquelle les mitochondries (ainsi que de calcium et de cellules noyaux) peut migrer, ce qui entraîne dans les réseaux d&#39;astrocytome radiothérapie résistant à 34. Glioblastome peut recruter de nombreuses cellules différentes au sein du microenvironnement tumoral, y compris MSCs 35, 36. Nous avons montré que MSCs peut établir des connexions entre cellules avec CSS en coculture et transférer leurs mitochondries (données non représentées), qui devrait modifier les propriétés fonctionnelles de la CGC. Le présent protocole décrit comment la technique de MitoCeption peut être utilisé pour transférer des mitochondries, préalablement isolé de cellules souches mésenchymateuses humaines, GSCs humaines dans le but de déterminer leur résultat biologique fonctionnel. Le multipotentes et la ligne Gb4 CGC hautement tumorigène 37 a été utilisé dans cette étude.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mitochondria Isolation Kit for Tissue&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10579663</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11520536</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement W/O VIT A (50X)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11500446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>H4385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly Heme&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P3932</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aMEM w/o glutamine</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td>BE12-169F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 without glutamine,&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11540566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>G7021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insuline&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I 1882&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Human&#160;bFGF&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF&#160;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>AF-100-15&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>2382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine Inhibitor&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T9003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>10104159001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine 0.25% /EDTA 1 mM</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>25200056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15090-046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors EDTA free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4693159001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17850-5G-F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungine&#160;</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-fn-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone&#160;</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15290018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0410</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MitoTracker Green FM</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>M7514</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MitoTracker Red CMXRos</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>&#160;M7512</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red FM</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>&#160;M22426&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;CellTracker Green CMFDA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C7025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;CellTracker Blue CMF2HC</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C12881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-24948</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Sterile Culture Dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>2,523,749</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS apparatus</td>
			<td>Gallios&#160;</td>
			<td>&#160;3L 10C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC FAST START DNA MASTER PLUS&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3515885001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitoception: transferring isolated human msc mitochondria to glioblastoma stem cells

Les mitochondries jouent un rôle central pour le métabolisme cellulaire, la production d&#39;énergie et le contrôle de l&#39;apoptose. la fonction mitochondriale inadéquate a été trouvé responsable de la très diverses maladies, allant de pathologies neurologiques au cancer. Fait intéressant, les mitochondries ont été récemment démontré pour afficher la capacité d&#39;être transféré entre les types de cellules, notamment de cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC) pour des cellules cancéreuses dans des conditions de co-culture avec métaboliques et fonctionnels conséquences pour les cellules réceptrices des mitochondries, améliorant encore l&#39;intérêt actuel pour les propriétés biologiques de ces organites. L&#39;évaluation des effets des mitochondries MSC transférés dans les cellules cibles est de première importance pour comprendre le résultat biologique de ces interactions cellule-cellule. Le protocole MitoCeption décrit ici permet le transfert des mitochondries préalablement isolées à partir des cellules du donneur aux cellules cibles, en utilisant MSC mitochondrieset les cellules souches de glioblastome (CGC) en tant que système modèle. Ce protocole a été précédemment utilisé pour transférer des mitochondries, isolée de cellules souches mésenchymateuses pour adhérentes cellules cancéreuses MDA-MB-231. Ce protocole de transfert de mitochondries est adapté ici pour GSCs qui présentent la particularité spécifique de plus en plus comme neurosphères in vitro. Le transfert des mitochondries isolées peut être suivie par les cellules activées par fluorescence (FACS) et la microscopie confocale en utilisant des colorants vitaux mitochondries. L&#39;utilisation de cellules donneuses et cible mitochondries avec des haplotypes distincts (SNP) permet également la détection des mitochondries transférés en fonction de la concentration de l&#39;ADN mitochondrial circulaire (ADNmt) dans les cellules cibles. Une fois que le protocole a été validé avec ces critères, les cellules hébergeant les mitochondries transférées peuvent être analysés plus avant pour déterminer les effets des mitochondries exogènes sur les propriétés biologiques telles que le métabolisme cellulaire, la plasticité, la prolifération et la réponse au traitement.

Les étapes de la procédure décrivant l&#39;isolement des mitochondries à partir de cellules souches mésenchymateuses (MSC) et leur transfert vers les cellules souches de glioblastome ciblées (CGC) par MitoCeption sont représentés sur la figure 1. GSCs sont des cellules souches cancéreuses cultivées en neurosphères pour préserver leurs propriétés de cellules souches. Pour le protocole, les CSS sont ensemencées comme des cellules individuelles d&#39; un coup...

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MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Ici, un protocole (MitoCeption) est présenté pour transférer les mitochondries, isolées à partir de cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC), des cellules souches de glioblastome (CGC), dans le but d&#39;étudier leurs effets biologiques sur le métabolisme et les fonctions CGC. Un protocole similaire peut être adapté pour transférer des mitochondries entre les autres types de cellules.

MitoCeption: Transfert humain isolé MSC mitochondries à glioblastome cellules souches

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...

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