Name: mitoception: transferring isolated human msc mitochondria to glioblastoma stem cells
Uploaded: 2017-02-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells at JoVE.com

Agradecemos a Andrea Parmeggiani (L2C y DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier), así como los miembros del laboratorio útil para los debates, Christophe Duperray para ayudar con el análisis FACS, la instalación de imágenes RIO Montpellier (MRI) para proporcionar el medio ambiente adecuado para FACS y microscopía confocal. BNM fue apoyado por una beca de postgrado de la LABEX Numev (convención ANR-10-LabX-20). AB fue apoyado por una beca de estudiante de la Universidad de Varsovia y la Unión Europea (n ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV es un miembro del personal científico del Centro Nacional de Investigación Científica (CNRS).

Día 1 1. El etiquetado de la célula madre mesenquimales (MSC) Las mitocondrias (Opcional) <ol><li> Dos días antes de la preparación mitocondrias, semilla de MSC humanas en una placa de cultivo de 100 mm, en 10 ml aMEM / FBS 10%, a fin de tener 4 x 10 5 MSCs en cultivo en el Día 1. </li><li> Enjuagar las MSC con PBS (4 ml) y añadir 4 ml aMEM / FBS al 1% (precalentado a 37 ° C). </li><li> Añadir la cantidad requerida de las mitocondrias colorante vital e incubar las células ...

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	<li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+signaling+organelles.">Mitochondria as signaling organelles.</a> BMC Biol. 12 (1), 34 (2014).</li><li>Schulze, A., Harris, A. 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K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+Sanger+strategy+for+human+mitochondrial+genome+sequencing.">A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing.</a> BMC Genomics. 14, 881 (2013).</li></ol>

Un creciente número de estudios muestran que las células pueden intercambiar las mitocondrias y que estas mitocondrias tener profundos efectos en el metabolismo y las funciones de la célula diana. Por lo tanto, es esencial para dominar las herramientas para transferir cuantitativamente la mitocondria de las células del donante a estas células diana para permitir un estudio preciso de sus efectos biológicos. El protocolo descrito aquí fue originalmente funcionó para transferir las mit...

Las mitocondrias son orgánulos que se encuentran en las células eucariotas en los que juegan un papel central en la absorción de nutrientes, así como en la producción de energía y metabolitos. Estos orgánulos contienen ADN mitocondrial circular (mtDNA), 16,6 kb de largo, que codifica las proteínas de los complejos de la cadena de transporte de electrones, tRNAs y rRNAs 1. La funcionalidad de estos orgánulos es crítica para la homeostasis celular y varias patologías se han asociado con disfunción mitocondrias 1, 2, 3. El estado de las mitocondrias, por ejemplo, ha sido relacionado con la inflamación, las enfermedades infecciosas y el cáncer, en este último caso con consecuencias para la metástasis y la resistencia a la terapia de 4, 5, 6, 7. Las mitocondrias muestran la notable capacidad de las<html> siendo transferido entre las células &quot;diana&quot; &quot;donante&quot; y. Esto conduce a cambios en el metabolismo energético de las células diana, así como en otras modificaciones funcionales, tales como la reparación de tejidos y la resistencia a los agentes quimioterapéuticos, como demostrado recientemente por diferentes laboratorios 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. Las células madre mesenquimales humanas (MSCs) muestran esta capacidad de transferencia de las mitocondrias a una amplia variedad de células diana, incluyendo cardiomiocitos, células endoteliales, células epiteliales alveolares pulmonares, células tubulares renales y las células cancerosas, lo que lleva a las modificaciones de las propiedades funcionales de estas células 8,&gt; 9, 10, 12, 17, 18. Las mitocondrias de cambio aparece ahora como un mecanismo ampliamente utilizado que permite que un número de diferentes tipos de células para comunicarse unos con otros y modificar sus propiedades biológicas. Este intercambio mitocondria puede ocurrir a través de la formación de los nanotubos de efecto túnel (TNT), con la participación de conexina 43 que contienen uniones gap 8 o M-Sec / TNFaip2 y la exocyst complejas 19. Alternativamente, la transferencia de las mitocondrias también ha demostrado ser mediada por arrestina microvesículas proteína que contiene el dominio 1 (mediadas por ARMMs) 20. Curiosamente, la eficacia de la transferencia de las mitocondrias estaba vinculada a la tasa de expresión de la Rho GTPasa 1 miro1 21, un factor clave para explicar las diferencias en las eficacias de transferencia entre las mitocondrias iPSC-MSC y adultos BM-MSC 22. A pesar de esta gran cantidad de datos relativos a las mitocondrias de cambio de célula a célula, se sabe relativamente poco sobre el metabolismo y la evolución biológica de esta transferencia de las mitocondrias. Por lo tanto, completamente de acuerdo con la configuración de las herramientas apropiadas para evaluar plenamente los efectos biológicos de esta transferencia. A través de los años, varios enfoques técnicos para la transferencia de las mitocondrias de donante a las células aceptoras se han propuesto. Esto incluye la inyección directa de las mitocondrias en oocitos de 23, 24, 25, la fusión celular para generar cíbridos transmitochondrial 26, 27 y, más recientemente, la transferencia de mitocondrias aisladas utilizando fototérmica nanoblades 28. Nosotros y otros previamente demostrada la capacidad de mitochond aisladoria para ser internalizado por las células vivas, como se observa tanto in vitro como in vivo 29, 30, 31, a través de los mecanismos propuestos para involucrar a macropinocitosis 32. Hemos desarrollado además un método, llamado MitoCeption, para transferir cuantitativamente mitocondrias aisladas (de MSCs) a las células diana, como se ejemplifica con el (adherente) MDA-MB-231 línea celular de cáncer de mama 31. Este protocolo fue adaptado aquí para la transferencia de las mitocondrias aisladas MSC humanos a las células madre de glioblastoma (GSCS). Glioblastoma son tumores malignos agresivos del cerebro que rápidamente se vuelven resistentes al tratamiento, debido principalmente a las células madre glioblastoma (GSC) presentes dentro del tumor 33. Estos GSCs crecen como neuroesferas en vitro y generan tumores en modelos de xenoinjerto. Las células cancerosas dentro de glioblastoma tienen lacapacidad para hacer conexiones de célula a célula, como se muestra recientemente para células tumorales cerebrales astrocíticos que se interconectan a través de microtubos extendidos, a través del cual las mitocondrias (así como núcleos de calcio y de células) pueden migrar, lo que resulta en las redes de astrocitoma de radioterapia resistente 34. Glioblastoma puede reclutar muchas células diferentes dentro del microambiente del tumor, incluyendo MSCs 35, 36. Nos mostró que las MSC puede realizar conexiones entre células con GSCS en co-cultivo y transferir sus mitocondrias (datos no mostrados), que se espera para modificar las propiedades funcionales de la SGC. El presente protocolo describe cómo la técnica MitoCeption se puede utilizar para transferir las mitocondrias, de antemano aislada de MSC humanas, a GSCs humanos con el propósito de determinar su resultado biológico funcional. El multipotentes y altamente tumorigénico línea Gb4 GSC 37 se utilizó en este estudio.

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		<tr>
			<td>Mitochondria Isolation Kit for Tissue&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10579663</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11520536</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement W/O VIT A (50X)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11500446</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>H4385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly Heme&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P3932</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aMEM w/o glutamine</td>
			<td>Ozyme</td>
			<td>BE12-169F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 without glutamine,&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11540566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>G7021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insuline&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I 1882&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Human&#160;bFGF&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF&#160;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>AF-100-15&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>2382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine Inhibitor&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T9003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>10104159001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine 0.25% /EDTA 1 mM</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>25200056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15090-046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors EDTA free</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4693159001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17850-5G-F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungine&#160;</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-fn-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone&#160;</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15290018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0410</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MitoTracker Green FM</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>M7514</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;MitoTracker Red CMXRos</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>&#160;M7512</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Deep Red FM</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>&#160;M22426&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;CellTracker Green CMFDA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C7025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;CellTracker Blue CMF2HC</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C12881</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-24948</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Sterile Culture Dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>2,523,749</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS apparatus</td>
			<td>Gallios&#160;</td>
			<td>&#160;3L 10C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC FAST START DNA MASTER PLUS&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3515885001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitoception: transferring isolated human msc mitochondria to glioblastoma stem cells

Las mitocondrias juegan un papel central para el metabolismo celular, la producción de energía y el control de la apoptosis. la función mitocondrial inadecuada ha sido encontrado responsable de muy diversas enfermedades, que van desde patologías neurológicas al cáncer. Curiosamente, las mitocondrias recientemente se ha demostrado para mostrar la capacidad de ser transferido entre los tipos de células, en particular a partir de células madre mesenquimatosas humanas (MSC) a las células cancerosas en condiciones de cocultivo, con metabólicos y funcionales consecuencias para las células mitocondrias receptores, mejorando aún más el interés actual para las propiedades biológicas de estos orgánulos. La evaluación de los efectos de la mitocondria MSC transferido en las células diana es de primordial importancia para entender el resultado biológico de tales interacciones célula-célula. El protocolo MitoCeption descrito aquí permite la transferencia de las mitocondrias aisladas de antemano a partir de las células del donante a las células diana, usando MSC mitocondriasy células madre de glioblastoma (GSC) como un sistema modelo. Este protocolo se ha utilizado anteriormente para transferir las mitocondrias, aislado de MSCs, a adherente células cancerosas MDA-MB-231. Este protocolo de transferencia de las mitocondrias está adaptado aquí para GSCS que presentan la particularidad específica de crecer como neuroesferas in vitro. La transferencia de las mitocondrias aisladas puede ir seguida de células activadas por fluorescencia (FACS) y la imagen confocal utilizando mitocondrias colorantes vitales. El uso de células donantes y de destino mitocondrias con haplotipos distintos (SNP) también permite la detección de la mitocondria transferidos sobre la base de la concentración de su ADN mitocondrial circular (ADNmt) en las células diana. Una vez que el protocolo ha sido validado con estos criterios, las células que albergan la mitocondria transferidos se pueden analizar adicionalmente para determinar los efectos de las mitocondrias exógenos en las propiedades biológicas, tales como el metabolismo celular, la plasticidad, la proliferación y respuesta al tratamiento.

Los pasos de procedimiento que describen el aislamiento de las mitocondrias de las células madre mesenquimales (MSC) y su transferencia a las células madre glioblastoma dirigidos (GSC) por MitoCeption se muestran en la Figura 1. GSCS son las células madre cancerosas cultivadas como neuroesferas para preservar sus propiedades de células madre. Para el protocolo, GSCS se siembran como células individuales de un par de horas antes de la transferencia de las mitocondria...

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MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Aquí, un protocolo (MitoCeption) se presenta para transferir las mitocondrias, aislado a partir de células madre mesenquimatosas humanas (MSC), a las células madre glioblastoma (GSC), con el objetivo de estudiar sus efectos biológicos sobre el metabolismo y funciones GSC. Un protocolo similar se puede adaptar para transferir mitocondrias entre otros tipos de células.

MitoCeption: Transferencia hermoso humano MSC mitocondrias de las células madre de glioblastoma

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...

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