Name: isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements
Uploaded: 2017-03-08T14:00:00
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This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant 32003B_127619).

大腿四頭筋生検は、ミトコンドリアを分画遠心分離によって分離されて、そこから麻酔したブタから採取されます。豚は別の実験のために後で使用されます。研究は、実験動物の管理と使用のためにとベルン、スイスの動物ケア委員会の承認を得て国立衛生研究所のガイドラインに従って行われます。 1.骨格筋の均質化とミトコンドリアの単離<ol><li> 消費税麻酔?...

<ol>
	<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues.+I.+Isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).</li><li>Sims, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+brain+and+subregions+using+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation.</a> J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).</li><li>Hartwig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+comparison+between+two+classical+and+a+kit-based+method+for+mitochondria+isolation.">A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation.</a> Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li><li>Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+permeabilization+for+the+high-throughput+measurement+of+compartmented+enzyme+activities+in+mammalian+cells.">Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells.</a> Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).</li><li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers,+tissues+and+cells.">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li><li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle:+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology.">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li><li>Vuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+catecholamines+on+hepatic+and+skeletal+muscle+mitochondrial+respiration+after+prolonged+exposure+to+faecal+peritonitis+in+pigs.">Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs.</a> Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).</li><li>Corr&#234;a, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+in+septic+shock:+effects+on+tissue+perfusion,+organ+function,+and+mitochondrial+respiration+in+a+porcine+model+of+fecal+peritonitis.">Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis.</a> Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).</li><li>Jeger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose+response+of+endotoxin+on+hepatocyte+and+muscle+mitochondrial+respiration+in+vitro.">Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro.</a> Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics. 3, (2002).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation.">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Gnaiger, E., M&#233;ndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia.">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functional+impairment+with+aging+is+exaggerated+in+isolated+mitochondria+compared+to+permeabilized+myofibers.">Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers.</a> Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).</li><li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+crude+mitochondrial+fraction+by+density-gradient+centrifugation.">Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation.</a> Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).</li><li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads.">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).</li><li>Pecinov&#225;, A., Drahota, Z., N&#367;skov&#225;, H., Pecina, P., Hou&#353;t&#283;k, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates.">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li><li>Lombardi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+muscle+mitochondria+subpopulations+in+pig:+a+study+using+top-down+elasticity+analysis.">Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis.</a> FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).</li></ol>

本研究において、我々は、無傷でしっかりこのような高解像度の呼吸計測等の機能的研究のために使用することができる差動遠心分離によって骨格筋のミトコンドリアを結合、高品質を単離するためのプロトコルを説明します。 無傷と密結合ミトコンドリアを単離するために、本プロトコル内で考慮すべきいくつかの重要なポイントがあります。骨格組織を採取した後?...

ミトコンドリア生体エネルギーと呼吸容量は透過性細胞または繊維ではなく、また、単離されたミトコンドリアだけでなく研究することができます。本研究では、高解像度の呼吸計測測定のために分画遠心法を用いて、無傷の骨格筋のミトコンドリアを単離するためのプロトコルを説明します。 呼吸計測のための完全なミトコンドリアを単離するために、組織が均質化され、ミトコンドリアは、従来の分画遠心法により単離されます。遠心分離法は、組織ホモジネートの連続遠心分離（増速の直列）に基づいて差は最初、ほぼ70年前に1 Palladeおよび共同研究者によって導入されました。組織は、最初にハサミを使って細かく刻み、ゆったり乳棒でガラスホモジナイザーで機械的に均質化されます。その後、ホモジネートを低速と切れ目のない組織が含まれている得られたペレットを、携帯で遠心分離され、破片および核は破棄されます。その後、上清を高速で数回遠心分離し、ミトコンドリア富化画分が回収されます。ミトコンドリアを単離するための差動遠心分離法の利点は、ということです：ⅰ）メソッドは高速であり、ミトコンドリアは（呼吸実験は可能な限り迅速として行われるべきである）1〜1.5時間以内に単離することができます。 ⅱ）それは安価です。そしてiii）それは非常に効率的であり、微分遠心分離によって得られたミトコンドリアは、呼吸計測分析のために十分に純粋です。ミトコンドリアを単離するための差動遠心分離法の欠点は、ⅰ）ミトコンドリアが均質化中に損傷し、非結合を受ける可能性があることです。 ⅱ）他の細胞成分とミトコンドリアの汚染は（）、さらに追加の遠心分離工程でミトコンドリアのペレットを洗浄することにより解決することができます。 ⅲ）差動遠心分離工程の間に、異なるミトコンドリア亜集団、 例えばを選択する可能性を、MIT下の密なとochondriaは7除外することができます。およびiv）ミトコンドリアの細胞周囲の不足しているとだけ理論的な最大の呼吸を測定することができます。呼吸計測分析のためにミトコンドリアを単離するための別の方法は、密度勾配遠心分離2です。この技術では、組織抽出物（遠心管の底部でのより高い密度を有する）スクロース溶液またはPercoll勾配の上に積層され、一定の速度で遠心分離し、ミトコンドリアが、それらに応じて、他の細胞成分から分離することを引き起こします密度。この方法は、多くの場合、シナプトソームから非常に低い汚染に脳ミトコンドリアを単離するために使用されます。しかしながら、密度勾配遠心分離によって単離されたラット肝ミトコンドリアは非常に他の細胞小器官3で汚染されています。この方法の制限の一つは、遠心分離管に存在するショ糖勾配がそう破裂かもしれないということです私ミトコンドリア（浸透圧ショック）。 組織の種類に応じ。差動遠心分離による無傷ミトコンドリアの単離のために考慮すべきいくつかの重要な要因があります。最初の必要性は穏やかな方法で組織を均質化することです。例えば、腎臓、脳や肝臓などの軟組織は、均質化の間に適用される穏やかな機械的な力を必要とします。これは、はるかに強い機械的な力を必要とし、心臓および骨格筋などの硬組織とは対照的です。細分化した組織は、通常、組織を柔らかくするために均質化前にプロテアーゼで処理されます。均質化および遠心分離の間に使用されるすべての緩衝液は、冷たい氷であると細胞質ゾル4、5と互換性のイオン性及び浸透強度と生理的に適切なpHを有していなければなりません。 分離されたミトコンドリアの生体エネルギーを研究する利点の一つは、細胞形質膜はpermeabiである必要はないということですこのようなミトコンドリア外膜の完全性を損なう可能性がありますジギトニンまたはサポニン4、6、などの界面活性剤とlized。単離ミトコンドリアの別の利点は、酸素消費量としてミトコンドリアの機能の分析を妨害し得る他のサイトゾル因子の欠如です。単離されたミトコンドリアを用いての欠点は、単離されたミトコンドリア7,8の良好な収率を得るために遠心分離工程中のあるミトコンドリアの集団の可能な選択、均質化の間にミトコンドリアの損傷、および生物学的サンプルの大量の要求です。 分離手順の後、ミトコンドリア複合体I、II-IV及び依存（状態2,3および4）の呼吸速度は、高解像度の呼吸計測を使用して決定されます。複合体I-駆動呼吸のために、グルタミン酸リンゴ酸は、アデノシン二リン酸（ADP）を加え、続いています。複合体II駆動型の呼吸のために、コハク酸は、ADPを添加し、続いています。複雑なIV-駆動呼吸については、アスコルビン酸及びtetramethylphenylendiamine（TMPD）はADP 9、10、11、12、続いて添加されます。状態2は、単独で、基質の存在下での酸素消費量を指します。状態3は、基板と、ADPの存在下での酸素消費量を指します。状態4は、ADPの枯渇後の酸素消費量を指します。呼吸調節比（RCR）は、酸素消費量のATP生産の結合の指標であり、状態3及び状態4 13、15との間の比として計算されます。 要約すると、我々は、差動遠心分離により、機能と無傷の骨格筋のミトコンドリアを単離し、これらの単離されたmitochonを使用するプロトコルを記述しますこのような高解像度の呼吸計測などの機能や生体エネルギー研究のためdria。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 4386</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 8674</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00127</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 7699</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 6003</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>fluka</td>
			<td>3779</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma,</td>
			<td>G 1626</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H 7523</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-lactobionate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L 2398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 9272</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06129</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Core: Oxygraph-2k&#160;</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>High-resolution respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase, bacterial</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 8038</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 8875</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S 2378</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser&#160;</td>
			<td>schuett-biotec GmbH</td>
			<td>3.201 011</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 8691</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 3134</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

複合体I-依存呼吸 単離されたミトコンドリア複合体I依存呼吸数（状態2、図3、図4）は、高解像度の呼吸計測（ 図1、代表的な図）を用いて決定されます。ミトコンドリア複合体I基板、グルタミン酸とリンゴ酸は、ADPを加え、続いています。状態2は、単独で、基質の存在下での酸素消費量を指し?...

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Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Research

JoVE Journal

Biology

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大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

骨格筋からのミトコンドリア単離

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無傷骨格筋線維内のカルシウムスパークスの評価

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Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

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エピジェネティックリプログラミングによるヒトES細胞からMyospheresの生成

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組織解離と差動濾過により移植のためにミトコンドリアの迅速な単離および精製

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High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

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High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

天然化合物の存在下でそのまま β 細胞のミトコンドリア機能を測定するための高解像度の呼吸

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