Name: genome editing and directed differentiation of hpscs for interrogating lineage determinants in human pancreatic development
Uploaded: 2017-03-05T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة / NIDDK (R01DK096239) وولاية نيويورك للعلوم الخلايا الجذعية (NYSTEM C029156). وأيد ZZ من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه NYSTEM من مركز علم الأحياء الخلايا الجذعية من معهد سلون كيترينج.

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li><li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells.">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li><li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells.">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11 (7), 514-518 (2001).</li><li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases.">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li><li>Gonz&#225;lez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iCRISPR+Platform+for+Rapid,+Multiplexable,+and+Inducible+Genome+Editing+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 215-226 (2014).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells.">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5 (5), 389-392 (2008).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+of+Lineage+Determinants+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Reveals+Mechanisms+of+Pancreatic+Development+and+Diabetes.">Genome Editing of Lineage Determinants in Human Pluripotent Stem Cells Reveals Mechanisms of Pancreatic Development and Diabetes.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 755-768 (2016).</li><li>Kotini, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+chromosomal+deletion+associated+with+myelodysplastic+syndromes+using+isogenic+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).</li><li>Carlson-Stevermer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Analysis+of+CRISPR-Cas9+Gene-Edited+Human+Embryonic+Stem+Cells.">High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 109-120 (2016).</li><li>Zhu, Z., Verma, N., Gonzalez, F., Shi, Z. D., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas-Mediated+Selection-free+Knockin+Strategy+in+Human+Embryonic+Stem+Cells.">A CRISPR/Cas-Mediated Selection-free Knockin Strategy in Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1103-1111 (2015).</li><li>Mandegar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+Interference+Efficiently+Induces+Specific+and+Reversible+Gene+Silencing+in+Human+iPSCs.">CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+functional+glucagon-secreting+alpha-cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells.</a> Diabetes. 60 (1), 239-247 (2011).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+that+directs+differentiation+of+human+ESCs+into+the+pancreatic+lineage.">A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage.</a> Nat Chem Biol. 5 (4), 258-265 (2009).</li><li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+NKX6-1++pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li><li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro.">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO J. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li><li>Zhu, Z., Gonzalez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods Enzymol. 546, 215-250 (2014).</li><li>Soh, C. L., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Mediated+Mutagenesis+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+Defined+Xeno-Free+E8+Medium.">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium.</a> Methods in Molecular Biology. 1498, (2017).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li><li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 750-756 (2011).</li><li>Musunuru, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+pluripotent+stem+cells+to+generate+human+cellular+disease+models.">Genome editing of human pluripotent stem cells to generate human cellular disease models.</a> Dis Model Mech. 6 (4), 896-904 (2013).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+alpha1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+genome+editing+using+ssDNA+oligonucleotides+with+zinc-finger+nucleases.">High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases.</a> Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).</li><li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+incidence+of+off-target+mutations+in+individual+CRISPR-Cas9+and+TALEN+targeted+human+stem+cell+clones+detected+by+whole-genome+sequencing.">Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Gene-Corrected+Adult+Beta+Globin+Protein+in+Human+Erythrocytes+Differentiated+from+Patient+iPSCs+After+Genome+Editing+of+the+Sickle+Point+Mutation.">Production of Gene-Corrected Adult Beta Globin Protein in Human Erythrocytes Differentiated from Patient iPSCs After Genome Editing of the Sickle Point Mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Shi, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+hPSCs+Reveals+GATA6+Haploinsufficiency+and+a+Genetic+Interaction+with+GATA4+in+Human+Pancreatic+Development.">Genome Editing in hPSCs Reveals GATA6 Haploinsufficiency and a Genetic Interaction with GATA4 in Human Pancreatic Development.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

اعتبارات الوقت لتوليد خطوط المسخ على الرغم من أن النهج الحديثة على أساس كريسبر / نظم كاس لتحرير الجينوم أدت إلى الاستهداف الناجح، فإن منصة أكثر كفاءة وعالمية يكون من الأفضل لنطاق أوسع تحليل وظيفة الجين. وتقدم منصة iCRISPR طريقة سريعة وفعالة لتقديم الطفرات إلى أي الجينات في المصالح 5، 9. أولا، طريقة تركيب gRNA PCR القائم يسمح للإنتاج مئات gRNAs في شكل المحتشدة في يوم واحد دون خطوات الاستنساخ تستغرق وقتا طويلا. ثانيا، مع الدوكسيسيكلين محرض Cas9 التعبير في iCas9 hPSCs، فإن الخطوة تنطوي على gRNA ترنسفكأيشن يتطلب سوى الحد الأدنى من العمل، وبالتالي، والتجارب التي تستهدف متعددة gRNA يمكن أن تتم بشكل متزامن. الثالثة، وذلك بسبب استهداف عالية الكفاءة للتحقيق مع نظامنا، وتحليل ~ 24-48 المستعمرات في gRNA transfected يجب أن يكون الإكتفاءicient لإنشاء monoallelic متعددة وخطوط متحولة biallelic لجين واحد، على الرغم من أن الكفاءة تختلف تبعا للمكان المستهدف. وبما أنه من الممكن للفرد مدربين لاختيار ميكانيكيا 384 المستعمرات (لوحات 4 × 96 أيضا) في جلسة واحدة، والتي ينبغي أن تأخذ ~ 4 ساعات تحت المجهر تشريح، من المتوقع أن تولد خطوط متحولة تؤثر على 12 الجينات داخل الفرد تدريب 12 شهر. الجيل مبسطة من المسوخ hPSC في وقت قصير يسمح للتحليل منهجي من مجموعة من عوامل النسخ و / أو مكونات مسار الإشارات التي تتفاعل مع بعضها البعض، وتنظيم العملية التنموية 9. بالإضافة إلى ذلك، كفاءة استهداف الجينات المضاعفة أيضا يفتح الباب للتحقيق في التفاعلات الوراثية الكامنة الصفات البشرية المعقدة. جيل من التعديلات الوراثية دقيقة اشتقاق iPSCs المريض محددة من الوصول إليها بسهولة نوع من الخلايا الجسدية<html> الصورة والتمايز إلى أنواع الخلايا من الأمراض ذات الصلة توفر فرصة كبيرة لإثبات صحة وظيفية من الطفرات المرتبطة المرض. ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى تفاوت كبير في الخلفية الوراثية بين الأفراد، مقارنات مباشرة بين iPSCs من المرضى ومن المتبرعين الأصحاء قد لا تسمح واحد للتمييز الظواهر المرض من تأثيرات الخلفية. وبالتالي، فمن الضروري لتوليد iPSCs السيطرة إسوي عن طريق تصحيح الطفرات المرض إلى تسلسل من النوع البري أو إدخال الطفرات المريض محددة في البرية من نوع الخلفية hPSC، كما اقترح آخرون 25 و 26. بالإضافة إلى (خالية) الطفرات الخسارة من وظيفة، يمكن للمرء الآن تشريح أكثر دقة آليات المرض من خلال إدخال المريض محددة تسلسل التعديلات في موضع الذاتية في hPSCs، بما في ذلك المريض hypermorphic، hypomorphic، neomorphic، أو المهيمنة سلبية الطفرات. ntent &quot;&gt; التعديل الوراثي دقيقة توظف تقرير التنمية البشرية لإصلاح جهاز تسوية المنازعات في وجود قالب إصلاح. وبما أنه أقل كفاءة بكثير من إصلاح الحمض النووي بوساطة NHEJ، البلازميد المانحة التي تحتوي على طفرة المريض محددة، شريط كاسيت اختيار المخدرات، والأسلحة تناظر تم استخدامها سابقا كقالب إصلاح 2 بعد اختيار الدواء والتحقق من الطفرة المريض محددة، هناك حاجة إلى الخطوة الثانية عموما لإزالة كاسيت اختيار الدواء. في حين أن أنظمة لجنة المساواة العرقية، loxP وFLP-FRT الأكثر استخداما على نطاق واسع تترك وراءها تسلسل المتبقية في موضع الذاتية، وقد سمح باستخدام piggyBac ينقول لإزالة السلس للاختيار المخدرات كاسيت (27). وفي الآونة الأخيرة، وقد ثبت أيضا قوالب ssDNA قصيرة لدعم HDR كفاءة مع نوكلياز داخلي الحمض النووي المهندسة 28. وبالمقارنة مع البلازميد المانحة ، ssDNA يمكن توليفها بشكل مباشر، وبالتالي تلتف على خطوة استنساخ تستغرق وقتا طويلا. هنا، فقد يكونأون يظهر أنه بحلول gRNA وقالب ssDNA للحث على إصلاح الموجه تناظر transfecting المشارك، iCRISPR يمكن أن تستخدم لإدخال تعديلات النوكليوتيدات محددة بكفاءة عالية. هذا أمر بالغ الأهمية ليس فقط لتشريح دور النيوكليوتيدات الأساسية في مجالات وظيفية البروتين، ولكن أيضا لنمذجة الطفرات الأمراض البشرية، وربما تصحيح هذه الطفرات الأمراض المرتبطة للتدخل العلاجي. وقد يرجع ذلك إلى عدد كبير من مواضع قابلية أن ترتبط كل منها عدة متغيرات تسلسل، والنمذجة الأمراض المعقدة وmultigenic مثل مرض السكري يشكل تحديا للعلماء الوراثة. كمنصة iCRISPR هي متساهلة للجيل السريع لسلسلة أليلية أو لاستهداف الجين multiplexable، فإنه يمكن تسهيل التحقيق في مواضع الأمراض المرتبطة متعددة، سواء بصورة فردية أو بالاشتراك مع الخلفيات إسوي. استهداف الكفاءات وتأثيرات خارج الهدف لدينا<html> العثور على علاقة جيدة بين T7E1 ونتائج الفحص RFLP وعدد من خطوط متحولة التي حددها التسلسل. وهذا يؤكد على أهمية تنفيذ هذه المقايسات بالتوازي مع إنشاء خطوط نسيلي. في حين أن الكفاءة التي تستهدف تحقيقها قد تختلف اعتمادا على مواضع الجيني، في معظم التجارب استهداف الجينات واحدة، 20 - عثر على 60٪ من الحيوانات المستنسخة مع كل من الأليلات تحور (بما في ذلك في إطار وطفرات انزياح الإطار) 9. في الحالات التي تم إجراء استهداف الجينات المضاعفة، تم الحصول على ثلاثية استنساخ متحولة biallelic مع 5-10٪ الكفاءات 5. أجريت بوساطة ssDNA تقرير التنمية البشرية للعديد من الجينات أيضا للحصول تغيرات جينية دقيقة، مع الكفاءة للحصول على متماثل تدق في استنساخ تتراوح 1-10٪ 5. العمل مع كريسبر / كاس في hPSCs، أي طفرات في المحتملة المواقع بعيدا عن الهدف التي لا تشترك في نفس تسلسل الهدف gRNA لم يتم بعد الكشف عنمعشوقة = &quot;XREF&quot;&gt; 5، 9، 12. وقد فشل كامل الجينوم التسلسل تؤدى في دراسة حديثة أيضا لتحديد الطفرات الكبيرة بعيدا عن الهدف في خطوط hPSC نسيلي تم إنشاؤها باستخدام كريسبر / كاس 29. ومع ذلك، لتقليل أي تأثير محتمل للالتباس الظواهر التي أدخلها الطفرات في المواقع تأثير بعيدا عن الهدف، ويقترح لتوليد خطوط متحولة مستقلة باستخدام اثنين على الأقل gRNAs مستقلة تستهدف سلاسل مختلفة داخل نفس الجين. الظواهر المماثلة الملحوظة في عدة أسطر الموضوعة باستخدام gRNAs مختلفة يمكن أن يحكم أساسا من احتمال أن يكون النمط الظاهري يأتي من تأثير بعيدا عن الهدف. مقابل الثقافة المستقلة واستهداف تعتمد التغذية، الأساليب التقليدية للثقافة hPSC تنطوي على صيانتها والتوسع في الخلايا المغذية في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل أو استبدال المصل الذي يتضمن همز الحيوانتصدير منتجاتها، مثل ألبومين المصل البقري. الخلايا المغذية، مصل، واستبدال الدم، والألبومين كل تحتوي على مكونات غير محددة معقدة وتظهر التباين دفعة كبيرة. التكيف مع حالة خالية من تغذية ومحددة كيميائيا يخفف كثيرا من الجهود من أجل صيانة hPSC، والأهم من ذلك، يزيد من تماسك التجارب التمايز. في الوقت الحاضر، هناك عدد قليل جدا من الدراسات التي تصف إجراءات تحرير الجينوم على hPSCs مثقف في ظروف ثقافة محددة تماما 30. لقد وجدنا أعلى كريسبر استهداف الكفاءات عندما أجريت gRNA ترنسفكأيشن وترسب نسيلي في ظروف خالية المغذية مقارنة مع الظروف والثقافة التي تعتمد على التغذية. ونحن نعتقد أن هذا يرجع إلى زيادة بقاء الخلية بعد ترنسفكأيشن والبذر وحيدة الخلية لتشكيل مستعمرة. وعلاوة على ذلك، وقد ثبت أن الخلايا المغذية سابقا لعزل الكواشف ترنسفكأيشن، وبالتالي خفض كفاءة ترنسفكأيشن. الجمعتحرير الجينوم مع إخراج التمايز وقد أثمرت البروتوكولات التمايز السابقة سوى جزء صغير من الخلايا الأنسولين الإيجابي، كانت الغالبية منها polyhormonal وتشبه خلايا الغدد الصماء الجنين 23. وقد سمح التقدم الزوار تمايز hPSCs في مثل بيتا الخلايا الجلوكوز استجابة أكثر نضجا 16، 17، 19، 20. يمكننا الحصول على روتيني لا يقل عن 75٪ خلايا الأديم نهائية، و 40٪ PDX1 + NKX6.1 + الأسلاف البنكرياس، وحوالي 20٪ NKX6.1 + CPEP + خلايا تشبه بيتا الجلوكوز استجابة باستخدام HUES8 hPSCs 9. عندما جنبا إلى جنب مع نظام تحرير الجينوم iCRISPR، وقد سهل هذا البروتوكول التمايز أكثر قوة تحليل عوامل النسخ التي تعتبر حاسمة بالنسبة إلى السلف والغدد الصماء مراحل البنكرياس التمايز البنكرياس. وهذا سيجعلمن الممكن، في الدراسات المستقبلية، لدراسة عدد كبير من الجينات المرض مرشح للتحقق من صحة وظيفية والتحقيق في الآليات التي تكمن وراء مرض السكري 9. التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات نظامنا iCRISPR قد تسهل جيل من التعديلات الجينوم أكثر تعقيدا، مثل إنشاء أليل مراسل من خلال استهداف الجينات باستخدام المانحة طويلة قوالب الحمض النووي ترميز علامات البروتين أو صحفيين الفلورسنت 12 HDR-توسط. لقد أظهرنا أنه نظرا إلى كريسبر عالية تستهدف الكفاءات التي تحققت في النظام، وهذه العملية لا يمكن أن يؤديها في hPSCs، دون الحاجة لاختيار المزيد من المخدرات (12). وعلاوة على ذلك، الجينات المضاعفة التي تستهدف يمكن استخدامها لتحقيق التفاعلات الوراثية الكامنة وراء المرض البشري المعقد، كما هو مبين في دراستنا الأخيرة، والتي نعتقد أنها أول مثال على هذا العمل 31. مجلس النوابويمكن أيضا ISPR استخدامها لفهم الرقابة التنظيمية الجين من خلال خلق الحذف إما في الرنا غير المرمزة noncoding الموجودة أو في الجينات المناطق التنظيمية، مثل المروجين ومحسنات. لتوليد بكفاءة المسوخ التنظيمية باستخدام iCRISPR، gRNAs يمكن أن تكون مصممة لتعطيل موقع ملزم للبروتين ملزمة الحمض النووي، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على الآلات النسخي القاعدية أو عامل النسخ الأنسجة محددة. ويمكن أيضا ssDNA HDR-بوساطة قالب استخدامها ليتحور مواقع محددة ملزمة البروتين. وأخيرا، فإننا نتوقع أن مزيد من التحسين سيمكن استخدام منصة iCRISPR في hPSCs للتحاليل وراثية ارتفاع الناتج من الظواهر تعدد القدرات أو الظواهر المرض عندما يقترن في المختبر بروتوكول التمايز. هذه الدراسات بوساطة iCRISPR قد تسمح لتحديد أسرع من الجينات والدراسات ذات الصلة الوظيفية الأمراض المرتبطة مرشح.

الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) لديها القدرة على حد سواء تجديد الذات وتؤدي لجميع المشتقات من ثلاث سلالات الجرثومية الجنينية. أنها توفر مصدرا قيما لاستبدال خلية العلاج والنمذجة المرض بمثابة منصة فريدة من نوعها لتلخيص العمليات الخلوية في سياق تنموي البشري. كما أنها تشكل مصدرا للخلايا التجريبية للتحجيم، تحليلات عالية الإنتاجية. غير أن التقدم كان محدودا بسبب تحديين رئيسيين: عدم وجود كفاءة أدوات التعديل الوراثي وصعوبة تلخص الخطوات التنموية الجنينية المعقدة في صحن الثقافة. التعديل الوراثي هو أداة لا غنى عنها لدراسة وظيفة الجينات في التطور الطبيعي والمرض. ومع ذلك، في حين أن الجينات الكلاسيكية التي تستهدف النهج عبر إعادة التركيب مثلي أثبتت أن يكون أداة قوية لتشريح وظيفة الجين في الماوس الجذعية الجنينية خلايا (mESCs) 1، وهذا النهجوقد غير فعالة للغاية عندما تطبق على hPSCs 2 و 3. انضمام السريع مؤخرا، nucleases برمجة مواقع محددة من الطبيعة لاستخدامات المختبرية، بما في ذلك نيوكلييز اصبع الزنك (ZFNs)، النسخ الشبيهة المنشط nucleases المستجيب (TALENs)، وتتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) / كريسبر المصاحب (CAS) نظم 4، يعني أن هندسة الجينوم أصبحت مهمة أسهل بكثير في مجموعة واسعة من الكائنات الحية وخطوط الخلايا، بما في ذلك في hPSCs. هذه الأدوات التحرير الجين الاستفادة من حقيقة أن nucleases خيالية مثل نوكلياز داخلية Cas9 يمكن أن تسمح مجموعة كاملة من التعديلات الجينية عن طريق حفز فواصل المزدوج تقطعت بهم السبل (DSBs) في أماكن محددة، مما اثار الذاتية الآلات إصلاح الحمض النووي لتفعيل إما غير مثلي إنهاء الانضمام (NHEJ) أو إصلاح الموجه التماثل (HDR). يمكن استغلالها سواء آليات التلاعب الجيني عن طريق حفز إييثإيه الإدراج عشوائي وطفرات الحذف (indels، عبر NHEJ)، لخلق طفرات انزياح الإطار التي تلغي الأليلات الجينات، أو استبدال النوكليوتيدات دقيقة (عبر تقرير التنمية البشرية)، أن ألخص الطفرات المريض لنمذجة الأمراض التي تصيب البشر أو لتصحيح طفرة مسببة للمرض للعلاج بالجينات . كريسبر / بوساطة كاس هندسة الجينوم يتطلب عنصرين هما: موجهة RNA المستمر Cas9 نوكلياز داخلية ضرورية لانقسام الحمض النووي والحمض النووي الريبي كريسبر متغير (crRNA) و (tracrRNA) الازدواج تفعيل العابرة التي تحدد الاعتراف الهدف الحمض النووي. يمكن استبدال دوبلكس crRNA / tracrRNA مع واحد دليل الحمض النووي الريبي خيالية (gRNA)، الذي تم العثور على العمل بشكل أكثر كفاءة 5 و 6 و 7. في حين تم تكييف نظام / Cas9 كريسبر إلى أكثر الكائنات التجريبية وخطوط الخلايا، وتسليم والتعبير عن Cas9 وgRNA يختلف اختلافا كبيرا ويحتاج إلى مزيد من الأمثل لعشيعشية تحرير الجينوم كفاءة في كثير من النظم، بما في ذلك hPSCs 8. على منصة تحرير الجينوم كفاءة، iCRISPR، وقد تم تأسيسها في عام hPSCs 5. في هذا النظام، وقد استخدم نهج بوساطة TALEN لاستهداف كل من الأليلات من AAVS1 &quot;التحوير الملاذ الآمن موضع&quot; في المتحولة، أليل واحد مع transactivator العكسية التي تسيطر عليها التتراسيكلين (M2rtTA) والآخر مع وجود عنصر استجابة التتراسيكلين (TRE ) القيادة التعبير عن Cas9 (iCas9) في hPSCs. في خطوط نسيلي تأسيس (iCas9 hPSCs)، وأعرب عن Cas9 للغاية مع العلاج الدوكسيسيكلين. وفي الوقت نفسه، نظرا لصغر حجمها (100 الإقليم الشمالي)، gRNAs مفردة أو متعددة يمكن أن يتم تسليم بسهولة إلى iCas9 hPSCs مع كفاءة عالية، ويمكن توجيه Cas9 للانشقاق في مواقع محددة، مما يتيح كفاءة اختلال الجينات بوساطة NHEJ، فضلا عن تقرير التنمية البشرية بوساطة التعديلات النوكليوتيدات دقيقة في حضور قصيرة الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل (ssDNA) قوالب المانحة. النظام iCRISPR يمكن أن يكونيستخدم لتوليد بنجاح فريق من خطوط hPSC محاكية للمرض مع biallelic (متماثل أو مركب متخالف) أو متخالف الطفرات الخسارة من وظيفة في الجينات التنموية الهامة 5، 9. في حين أن عددا من الجماعات قد ذكرت التحرير الجين الفعال باستخدام كريسبر / كاس في hPSCs، يبقى نجاحا محدودا لعدد قليل من المختبرات الخبرات التكنولوجية. منصة iCRISPR تقدم حل فعال وإن كان بسيطا لتحرير الجين روتيني من قبل الباحثين من مختلف مستويات المهارة، وسبق استخدامها في عدد من الدراسات التي نشرت من قبل مجموعتنا وغيرها 9، 10، 11، 12. كما تم تمديد هذا النهج أيضا على إسكات محرض على أساس التعبير عن dCas9-KRAB 13. جنبا إلى جنب مع التقدم في التقنية الجينوم التحريروقد تحققت بليد الحركة، وإدخال تحسينات كبيرة أيضا في صيانة hPSC والتمايز الموجهة. شروط الثقافة لhPSCs قد تطورت من الظروف المتوسطة الماوس المشع الليفية الجنينية (iMEF) لظروف خالية من التغذية على مكونات المصفوفة خارج الخلية المحددة، ومن الصياغات وسائل الإعلام المعقدة التي تعتمد على التغذية لتعريف كيميائيا 14. وقد خفضت هذه التحسينات التغير في hPSCs بسبب الخلافات دفعة إلى دفعة في المكونات استبدال إعداد والمصل خروج المغلوب iMEF، وبالتالي توفير بيئة أكثر استنساخه لhPSC التمايز. وفي الوقت نفسه، وتحسين معرفة مسارات الإشارات التي تحكم التطور الجنيني الإنسان، وكذلك الاكتشافات من الإنتاجية العالية عروض المخدرات، أدت إلى تحسين بروتوكولات التمايز 15، 16، 17، 18. هذه البروتوكولات تحاكي بشكل وثيق في فيفس الخطوات التنموية وتولد أنواع الخلايا التي تلخص بشكل وثيق في الجسم الحي نظرائهم. لhPSC التمايز في النسب البنكرياس، تحاكي بروتوكولات الأولية تطوير البنكرياس في وقت مبكر بشكل جيد ولكن في نهاية المطاف نسبيا ولدت خلايا β polyhormonal التي كانت من الظواهر الجنين غير ناضجة وردت ضعيفة لتحفيز الجلوكوز. التطورات الأخيرة 16، 17، 19، 20 سمحت للجيل من الخلايا مثل β البنكرياس الجلوكوز استجابة، والتي سوف تمكننا من تحقيق أحداث لاحقة، مثل تكوين ونضوج للخلايا β monohormonal. هنا، ونحن بالتفصيل تطبيق خطوط تعديل الجينوم لدراسة تطوير البنكرياس عن طريق الجمع بين نظام iCRISPR مع المختبر في منصة التمايز القائم hPSC تجاه pancr الجلوكوز استجابةمثل β خلايا eatic. هذا الاقتران من أدوات التحرير الجينوم قوية مع تحسن بروتوكول التمايز hPSC ليس فقط يوفر سرعة وحجم اللازمة لتلبية الطلب المتزايد على التحقق من صحة العلاقة السببية المرض، ولكن أيضا يمكن التلاعب الجيني متطورة لاجراء مزيد من التحقيقات الآلية إلى سيطرة النسخي الكامنة وراء التطور الطبيعي والمرض 9 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="847">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:368px;">Chemically defined medium (E8)</td>
			<td style="width:261px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">A1517001</td>
			<td style="width:87px;">Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Truncated recombinant human form of vitronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563029</td>
			<td>1X, animal origin free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418 Sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10131035</td>
			<td>Geneticin Selective Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td>Puromycin Selective Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA Polymerase (Herculase II Fusion)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600679</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEGAshortscript T7 Transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Reduced Serum Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69504</td>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BLAR medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine supplement (GlutaMAX)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaHCO3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>LAMPIRE Biological Laboratories</td>
			<td>7500855</td>
			<td>Fatty acid free</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GDF8</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CHIR-99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>GSK-3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SANT1</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1974</td>
			<td>Hedgehog inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LDN</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0019</td>
			<td>BMP inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IWP-2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3533</td>
			<td>Wnt antagonist&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ITS-X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TPB</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565740-1MG</td>
			<td>PKC activator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3,3&#8217;,5-Triiodo-L-thyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ALK5i II</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-445</td>
			<td>ALK5 inhibitor II</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZnSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GSiXX</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565789</td>
			<td>Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-Cys (N-acetyl cysteine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trolox</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>648471</td>
			<td>Vitamin E analogue</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">R428</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2841</td>
			<td>AXL receptor tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24mm Transwell with insert</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gene Pulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.4 cm Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-TALEN-L</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-TALEN-R</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-Neo-M2rtTA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-Puro-iCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>58409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0302L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer 2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7002S</td>
			<td>NEBuffer 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Long oligonucleotide</td>
			<td>Eton Bioscience or IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOX17 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1924</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FOXA2 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CXCR4-APC antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170A</td>
			<td>1: 25</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NKX6.1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F55A12</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NKX2.2 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NEUROD1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-1084</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0564</td>
			<td>1: 2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C-peptide antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>GN-ID4-c</td>
			<td>1: 2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucagon antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2654</td>
			<td>1: 1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing and directed differentiation of hpscs for interrogating lineage determinants in human pancreatic development

استجواب وظائف الجينات في (hPSCs) أو تمييز الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان تجديد الذات توفر منصة قيمة نحو فهم التنمية البشرية وتشريح آليات المرض في طبق. للاستفادة من هذا التطبيق المحتمل يتطلب كفاءة أدوات الجينوم التحرير لتوليد المسوخ hPSC في الجينات المرتبطة بالمرض، وكذلك في المختبر hPSC بروتوكولات التمايز لإنتاج أنواع الخلايا من الأمراض ذات الصلة أن ألخص بشكل وثيق في الجسم الحي نظرائهم. تم وضع منصة الجينوم تحرير فعالة لhPSCs اسمه iCRISPR من خلال استهداف بوساطة TALEN للتعبير كاسيت Cas9 في موضع AAVS1. هنا، يتم وصف البروتوكولات لتوليد خطوط Cas9 hPSC محرض باستخدام الخلايا المستزرعة في المتوسط ​​محددة الصفات كيميائيا وشرط خالية المغذية. الإجراءات التفصيلية لاستخدام نظام iCRISPR للخروج المغلوب الجينات أو تغيرات جينية دقيقة في hPSCs، إما عن طريق نعلى مثلي نهاية الانضمام (NHEJ) أو عن طريق التعديلات النوكليوتيدات دقيقة باستخدام قالب إصلاح الموجه التماثل (HDR)، على التوالي، وترد. وتشمل هذه الإجراءات التقنية وصفا لتصميم وإنتاج، وترنسفكأيشن من الرنا دليل كريسبر (gRNAs)؛ قياس معدل التحور كريسبر التي كتبها T7E1 أو RFLP المقايسات. وإنشاء والتحقق من خطوط متحولة نسيلي. وأخيرا، فإننا الإجراءات وقائع لhPSC التمايز إلى خلايا تشبه β البنكرياس الجلوكوز تستجيب عن طريق محاكاة في التطور الجنيني البنكرياس الجسم الحي. الجمع بين التكنولوجيا iCRISPR مع توجه التمايز hPSC تمكن من دراسة منهجية وظيفة الجينات إلى زيادة فهمنا للآليات التنمية ومرض السكري البنكرياس.

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development at JoVE.com

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

بروتوكولات لتوليد خطوط متحولة hPSC باستخدام منصة iCRISPR وتفرق hPSCs إلى خلايا تشبه β-الجلوكوز استجابة موصوفة. الجمع بين التكنولوجيا التحرير الجينوم مع التمايز الموجهة hPSC-يوفر منصة قوية لتحليل منهجي لدور المحددات النسب في التنمية البشرية وتطور المرض.

الجينوم التحرير وإخراج تمايز hPSCs عن التحقيق مع محددات النسب في تنمية البنكرياس الإنسان

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Research

JoVE Journal

Genetics

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

منهجية موحدة لدراسة المحدثة للطفرات في الموقع كدالة لإصلاح نقطة تحور تحفزها كريسبر/Cas9 وسودن في الخلايا البشرية

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection كريسبر/Cas9 البروتين في أجنة سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus، لتحرير الجينات

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

تحديد معدلات تسوس نسخة على نطاق الجينوم في الخلايا الليفية البشرية المتكاثرة وهادئة

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

استهدفت تسلسل الجيل القادم وأنابيب المعلوماتية الحيوية لتقييم المحددات الوراثية للمرض الدستورية

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

تعزيز الجينوم التحرير مع ريبونوكليوبروتين Cas9 في مختلف الخلايا والكائنات الحية

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

"جعل طفرات مشروطة طفيل الملاريا البشرية" المنجلية "تحرير الجينات" كريسبر/Cas9

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

كريسبر بوساطة "تحرير الجينوم" "البشري مسببات الأمراض الفطرية" المبيضات البيض

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

تحرير الجينوم في "خطوط خلايا الثدييات" استخدام Cas كريسبر

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

تحويل، تحرير الجينوم والفينولات في نتروجين تحديد شجرة كاناباسيا الاستوائية Parasponia أندرسوني

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

توصيف التمايز في المختبر من خلايا الكيراتينوسيات الأولية البشرية بواسطة تحليل الحمض النووي الريبي-SEQ

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...