Name: genome editing and directed differentiation of hpscs for interrogating lineage determinants in human pancreatic development
Uploaded: 2017-03-05T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret delvist af NIH / NIDDK (R01DK096239) og New York State Stem Cell Science (NYSTEM C029156). ZZ blev støttet af NYSTEM postdoc stipendium fra Center for Stamcelleforskning Biology af Sloan Kettering Institute.

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li><li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells.">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li><li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells.">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11 (7), 514-518 (2001).</li><li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases.">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li><li>Gonz&#225;lez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iCRISPR+Platform+for+Rapid,+Multiplexable,+and+Inducible+Genome+Editing+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 215-226 (2014).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells.">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5 (5), 389-392 (2008).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+of+Lineage+Determinants+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Reveals+Mechanisms+of+Pancreatic+Development+and+Diabetes.">Genome Editing of Lineage Determinants in Human Pluripotent Stem Cells Reveals Mechanisms of Pancreatic Development and Diabetes.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 755-768 (2016).</li><li>Kotini, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+chromosomal+deletion+associated+with+myelodysplastic+syndromes+using+isogenic+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).</li><li>Carlson-Stevermer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Analysis+of+CRISPR-Cas9+Gene-Edited+Human+Embryonic+Stem+Cells.">High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 109-120 (2016).</li><li>Zhu, Z., Verma, N., Gonzalez, F., Shi, Z. D., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas-Mediated+Selection-free+Knockin+Strategy+in+Human+Embryonic+Stem+Cells.">A CRISPR/Cas-Mediated Selection-free Knockin Strategy in Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1103-1111 (2015).</li><li>Mandegar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+Interference+Efficiently+Induces+Specific+and+Reversible+Gene+Silencing+in+Human+iPSCs.">CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+functional+glucagon-secreting+alpha-cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells.</a> Diabetes. 60 (1), 239-247 (2011).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+that+directs+differentiation+of+human+ESCs+into+the+pancreatic+lineage.">A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage.</a> Nat Chem Biol. 5 (4), 258-265 (2009).</li><li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+NKX6-1++pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li><li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro.">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO J. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li><li>Zhu, Z., Gonzalez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods Enzymol. 546, 215-250 (2014).</li><li>Soh, C. L., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Mediated+Mutagenesis+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+Defined+Xeno-Free+E8+Medium.">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium.</a> Methods in Molecular Biology. 1498, (2017).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li><li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 750-756 (2011).</li><li>Musunuru, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+pluripotent+stem+cells+to+generate+human+cellular+disease+models.">Genome editing of human pluripotent stem cells to generate human cellular disease models.</a> Dis Model Mech. 6 (4), 896-904 (2013).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+alpha1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+genome+editing+using+ssDNA+oligonucleotides+with+zinc-finger+nucleases.">High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases.</a> Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).</li><li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+incidence+of+off-target+mutations+in+individual+CRISPR-Cas9+and+TALEN+targeted+human+stem+cell+clones+detected+by+whole-genome+sequencing.">Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Gene-Corrected+Adult+Beta+Globin+Protein+in+Human+Erythrocytes+Differentiated+from+Patient+iPSCs+After+Genome+Editing+of+the+Sickle+Point+Mutation.">Production of Gene-Corrected Adult Beta Globin Protein in Human Erythrocytes Differentiated from Patient iPSCs After Genome Editing of the Sickle Point Mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Shi, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+hPSCs+Reveals+GATA6+Haploinsufficiency+and+a+Genetic+Interaction+with+GATA4+in+Human+Pancreatic+Development.">Genome Editing in hPSCs Reveals GATA6 Haploinsufficiency and a Genetic Interaction with GATA4 in Human Pancreatic Development.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Tid Overvejelser til generering Mutant Lines Selv om de seneste metoder baseret på CRISPR / Cas-systemer til genom-redigering har ført til vellykket målretning, vil en mere effektiv og universel platform være at foretrække for større skala analyser af gen-funktion. Den iCRISPR platformen tilbyder en hurtig og effektiv metode til at introducere mutationer ethvert gen af interesse 5, 9. For det første PCR-baserede gRNA syntese metode tillader produktionen af ​​hundredvis af gRNAs i klædt format på én dag uden tidskrævende kloningstrin. Sekund, med doxycyclin-inducerbar Cas9 ekspression i iCas9 hPSCs, det trin, der involverer gRNA transfektion kræver kun en minimal mængde arbejde og således kan udføres flere gRNA eksperimenter rettet mod samtidigt. Tredje, på grund af den høje målretning effektiviteter opnåelige med vores system, analysen af ​​~ 24 - 48 kolonier pr gRNA transficeret bør være sufficient at etablere flere monoallelisk og biallele mutante linjer for et enkelt gen, selvom effektivitet varierer afhængigt af mållocuset. Da det er muligt for en uddannet person til mekanisk at gå 384 kolonier (4 x 96-brønds plader) i et møde, som bør tage ~ 4 timer under et dissektionsmikroskop, kan en uddannet person forventes at generere mutante linjer påvirkede 12 gener i 12 måneder. Den strømlinede generation af hPSC mutanter på kort tid giver mulighed for systematisk analyse af et array af transkriptionsfaktorer og / eller signalvejen komponenter, der interagerer med hinanden, regulering udviklingsprocessen 9. Derudover effektiv multiplex gen targeting åbner også døren for at undersøge genetiske interaktioner underliggende komplekse menneskelige træk. Generation af præcise genetiske modifikationer Udledningen af ​​patient-specifikke iPSCs fra let tilgængelige somatiske celletype<html> s og differentiering i sygdoms-relevant celletyper giver en stor mulighed for den funktionelle validering af sygdom-associerede mutationer. Men på grund af den betydelige variation i genetisk baggrund mellem individer, direkte sammenligninger mellem iPSCs fra patienter og fra raske donorer kan ikke tillader en at skelne sygdomsfænotyper fra baggrundseffekter. Derfor er det nødvendigt at generere isogene kontrol iPSCs ved at korrigere sygdomsmutationen tilbage til vildtypesekvensen eller at indføre de patientspecifikke mutationer i en vildtype hPSC baggrund, som foreslået af andre 25, 26. Ud over tab af funktion (null) mutationer, kan man nu mere præcist dissekere sygdomsmekanismer ved indførelse af en patient-specifikke sekvensændringer i det endogene locus i hPSCs, herunder hypermorphic, hypomorphic, neomorphic eller dominant-negative patient mutationer. ntent &quot;&gt; Præcis genetisk modifikation anvender HDR for DSB-reparation i nærværelse af en reparation skabelon. Da det er meget mindre effektiv end NHEJ-medieret DNA-reparation, en donor plasmid indeholdende patient-specifik mutation, et udvalg medikamentkassetten, og homologiarme tidligere har været anvendt som reparationen template to. Efter udvælgelse narkotika og kontrol af patienten-specifik mutation, er et andet trin generelt nødvendig for at fjerne markeringen narkotika kassette. Mens de mest udbredte Cre-loxP og FLP-FRT-systemer efterlade resterende sekvens i det endogene locus har anvendelsen af piggyBac transposon tilladt for den sømløse fjernelse af lægemiddel-selektion kassetten 27. for nylig korte ssDNA-skabeloner har også vist sig at understøtte effektiv HDR med konstruerede DNA-endonukleaser 28. Sammenlignet med en donorplasmid , ssDNA direkte kan syntetiseres og omgår således tidskrævende kloningstrin. Her har det væreOr vist, at ved co-transfektion af gRNA og en ssDNA template til at inducere homologi-dirigeret reparation, kan iCRISPR anvendes til at indføre specifikke nucleotid modifikationer med høj effektivitet. Dette er kritisk for ikke kun dissecting rolle essentielle nukleotider inden protein- funktionelle domæner, men også til modellering humane sygdomstilstande mutationer og potentielt korrigere disse sygdomsassocierede mutationer for terapeutisk intervention. På grund af det store antal modtagelighed loci, der hver er forbundet med flere sekvensvarianter, modellering komplekse og multigenic sygdomme som diabetes har været en udfordring for genetikere. Da iCRISPR platformen er eftergivende for en hurtig generering af en allel serie eller for multiplexable gen targeting, kan det lette efterforskningen af ​​multiple sygdom-associeret loci, enten individuelt eller i kombination med isogene baggrunde. Målretning effektivitet og Off-target effekter Vi har<html> fundet en god sammenhæng mellem T7E1 og RFLP analyseresultater og antallet af mutant linjer identificeret ved sekventering. Dette understreger vigtigheden af ​​at udføre disse assays parallelt med etableringen af ​​klonale linjer. Mens målretning effektiviteter opnås, kan variere afhængigt af den genomiske loci, i de fleste single-gen-targeting eksperimenter, 20 - blev 60% af klonerne fundet med begge alleler muteret (herunder i ramme og læserammeforskydningsmutationer) 9. I tilfælde, hvor multiplex gen targeting blev udført, blev tredobbelt biallele mutant kloner med 5-10% effektivitet opnået fem. ssDNA-medieret HDR af flere gener blev også udført for at opnå præcise genetiske ændringer, med effektivitetsgevinster for at opnå homozygot knock-i kloner fra 1 - 10% 5. Arbejde med CRISPR / Cas i hPSCs eventuelle mutationer i potentielle off-target sites, der ikke deler den samme gRNA target sekvens endnu ikke opdagetlass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 9, 12. Whole-genom sekventering udført i en nylig undersøgelse har også undladt at identificere væsentlige off-target-mutationer i klonede hPSC linier genereres ved hjælp af CRISPR / Cas 29. Ikke desto mindre, at minimere enhver potentiel effekt af confounding fænotyper indført ved mutationer ved off-target effekt sites, foreslås det at generere uafhængige mutant linjer ved hjælp af mindst to uafhængige gRNAs målrettet forskellige sekvenser inden for samme gen. Lignende fænotyper observeret i flere linjer frembragt ved anvendelse af forskellige gRNAs kunne hovedsagelig udelukke muligheden for, at fænotypen kommer fra en off-target effekt. Feeder-afhængige versus Uafhængig Kultur og målretning Traditionelle metoder til hPSC kultur involverer deres vedligeholdelse og ekspansion på feeder-celler i medier, der indeholder serum eller serum udskiftning, der omfatter dyr proddukter, såsom bovint serumalbumin. Feeder celler, serum, serum udskiftning, og albumin alle indeholder komplekse, udefinerede komponenter og viser betydelig batch variation. Tilpasning til feeder-fri og kemisk definerede tilstand reducerer indsatsen for hPSC vedligeholdelse og, endnu vigtigere, øger konsistensen af ​​differentiering eksperimenter. På nuværende tidspunkt er der meget få undersøgelser, der beskriver genom redigering procedurer på hPSCs dyrket i fuldt definerede dyrkningsbetingelser 30. Vi har fundet højere CRISPR målretning effektiviteter når gRNA transfektion og klonal aflejring blev udført i fødefri betingelser sammenlignet med feeder-afhængig dyrkningsbetingelser. Vi mener, at dette skyldes øget overlevelse celle efter transfektion og enkeltstrenget cellepodning for kolonidannelse. Desuden har fødeceller tidligere vist sig at sekvestrere transfektionsreagenser, derved sænke transfektionseffektiviteten. KombinationGenome Redigering med Directed Differentiering Tidligere differentiering protokoller har givet kun en lille brøkdel af insulin-positive celler, hvoraf størstedelen var polyhormonal og lignede føtale endokrine celler 23. Nylige fremskridt har muliggjort differentiering af hPSCs til mere modne glucose-responsive beta-lignende celler 16, 17, 19, 20. Vi kan rutinemæssigt opnå mindst 75% endelige endoderm celler, 40% Pdx1 + NKX6.1 + pancreas stamceller og omkring 20% NKX6.1 + CPEP + glucose-responsive beta-lignende celler under anvendelse HUES8 hPSCs 9. Når det kombineres med den iCRISPR genom redigering system, har det mere robust differentiering protokol lettet analysen af ​​transkriptionsfaktorer, der er afgørende for de pancreasstamfaderceller og endokrine stadier af bugspytkirtlen differentiering. Dette vil gøredet muligt, i fremtidige studier, for at undersøge et stort antal kandidat sygdomsgener for funktionelle validering og undersøgelse af de mekanismer, der ligger til grund for diabetes 9. Fremtidige Programmer eller vejvisning Vores iCRISPR systemet kan lette dannelsen af mere komplekse genomiske modifikationer, såsom skabelse af reporter alleler gennem HDR-medieret gen-targeting under anvendelse lange donor-DNA skabeloner indkoder protein tags eller fluorescerende reportere 12. Vi har vist, at på grund af den høje CRISPR målretning virkningsgrader opnået i systemet, kan denne proces udføres i hPSCs, uden behov for yderligere lægemiddelselektion 12. Endvidere kan multipleksede gen-targeting anvendes til at undersøge genetisk samspil underliggende kompleks menneskelig sygdom som vist i vores nyere undersøgelse, som vi mener er det første eksempel på et sådant arbejde 31. ICRISPR kan også anvendes til at forstå genregulatorisk Ved at oprette deletioner enten i ikke-kodende RNA&#39;er eller i gen-regulatoriske regioner, såsom promotorer og enhancere. Til effektivt at generere regulatoriske mutanter under anvendelse iCRISPR, kan gRNAs designes til at forstyrre bindingsstedet af et DNA-bindende protein, herunder, men ikke begrænset til det basale transkriptionelle maskineri eller en vævsspecifik transskriptionsfaktor. ssDNA template-medieret HDR kan også anvendes til at mutere specifikke proteinbindingssteder. Endelig har vi forestiller at yderligere optimering ville muliggøre brugen af iCRISPR platform i hPSCs for højere gennemløb genetiske analyser af pluripotens fænotyper eller sygdomstilstande fænotyper, når de kombineres med en in vitro differentiering protokol. Disse iCRISPR-medierede undersøgelser kan give mulighed for en hurtigere identifikation af kandidat sygdom-associerede gener og undersøgelser af deres funktionelle relevans.

Humane pluripotente stamceller (hPSCs) har evnen til både selv-forny og giver anledning til alle derivater af de tre embryonale kim slægter. De giver en værdifuld ressource for celleerstatningsterapi og sygdom modellering ved at fungere som en unik platform til at rekapitulere cellulære processer i et menneske udviklingsmæssig sammenhæng. De er også en kilde til eksperimentelle celler til skalerbare, high-throughput analyser. Imidlertid har fremskridtene været begrænset på grund af to hovedudfordringer: manglen på effektive genetisk modificering værktøjer og vanskeligheden ved den gentog de komplekse embryonale udviklingsmæssige trin i en kultur fad. Gensplejsning er et uundværligt redskab til at studere genfunktion i normal udvikling og sygdom. Men mens klassisk gen målretningsmetoder via homolog rekombination har vist sig at være et effektivt redskab til at dissekere genfunktion i muse embryonale stamceller (mESCs) 1, denne tilganghar været yderst ineffektiv, når den anvendes til hPSCs 2, 3. Den nylige rask tiltrædelse af programmerbare, stedspecifikke nukleaser fra naturen til laboratoriebrug, herunder zink finger nukleaser (ZFNs), transskription aktivator-lignende effektor nukleaser (Talens), og de grupperede regelmæssigt spatierede korte palindrome gentagelser (CRISPR) / CRISPR-associerede (Cas) systemer 4, betyder, at genom engineering er blevet en meget lettere opgave i en bred vifte af organismer og cellelinjer, herunder hPSCs. Disse gen redigeringsværktøjer drage fordel af den kendsgerning, at kimære nucleaser såsom Cas9 endonuklease kan tillade en hel række genetiske modifikationer ved at inducere dobbeltstrengede pauser (DSBs) på præcise placeringer, udløser det endogene DNA-reparation maskiner til at aktivere enten ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) eller homologi-dirigeret reparation (HDR). Begge mekanismer kan udnyttes til genetisk manipulation ved at inducere eithis tilfældig isætning og deletionsmutationer (indels; via NHEJ), for at skabe rammeskift mutationer, ophæve gen alleler, eller præcise nukleotidsubstitutioner (via HDR), at rekapitulere patient mutationer til human sygdom modellering eller at korrigere en sygdomsfremkaldende mutation til genterapi . CRISPR / Cas-medieret genom engineering kræver to komponenter: den konstante RNA-guidede Cas9 endonuklease nødvendig for DNA spaltning og en variabel CRISPR RNA (crRNA) og trans-aktiverende (tracrRNA) dupleks, der angiver DNA-mål anerkendelse. Den crRNA / tracrRNA duplex kan erstattes med et enkelt kimært guide RNA (gRNA), som har vist sig at arbejde mere effektivt 5, 6, 7. Mens CRISPR / Cas9 system er blevet tilpasset til de fleste eksperimentelle organismer og cellelinjer, levering og ekspressionen af ​​Cas9 og gRNA varierer betydeligt og skal yderligere optimeres til Achieve effektiv genom redigering i mange systemer, herunder hPSCs 8. Et effektivt genom-redigering platform, iCRISPR, er blevet etableret i hPSCs 5. I dette system har en Talen-medieret fremgangsmåde blevet anvendt til at målrette begge alleler af &quot;transgen safe harbor locus&quot; AAVS1 i trans, én allel med en omvendt tetracyclin-reguleret transaktivator (M2rtTA) og den anden med en tetracyclin-responselement (TRE ) driver ekspressionen af ​​Cas9 (iCas9) i hPSCs. I etablerede klonale linjer (iCas9 hPSCs), er Cas9 kraftigt udtrykt med doxycyclin behandling. I mellemtiden, på grund af sin lille størrelse (100 nt), enkelte eller multiple gRNAs let kan leveres ind iCas9 hPSCs med høj effektivitet og kan direkte Cas9 for site-specifik spaltning, hvilket muliggør effektiv NHEJ-medieret gen forstyrrelser, samt HDR-medieret præcise nucleotid modifikationer i nærværelse af korte enkeltstrenget DNA (ssDNA) donor skabeloner. Den iCRISPR system kan væreanvendes med succes generere et panel af sygdomsfremkaldende efterligne hPSC linjer med biallel (homozygot eller heterozygot forbindelse) eller heterozygote tab-af-funktion-mutationer i vigtige udviklingsmæssige gener 5, 9. Mens en række grupper har rapporteret effektiv gen redigering ved hjælp CRISPR / Cas i hPSCs, succesen fortsat begrænset til et lille antal af teknologisk dygtige laboratorier. Den iCRISPR platformen tilbyder en effektiv endnu enkel løsning til rutinemæssig gen redigering af forskere fra forskellige faglige niveauer, og det er allerede blevet anvendt i en række offentliggjorte undersøgelser af vores gruppe og andre 9, 10, 11, 12. Denne tilgang er også blevet yderligere udvidet til inducerbare lyddæmpning baseret på ekspressionen af dCas9-KRAB 13. Sammen med udviklingen i genom-redigering technoer også blevet opnået logy, betydelige forbedringer i hPSC vedligeholdelse og instrueret differentiering. Dyrkningsbetingelser for hPSCs har udviklet sig fra bestrålede mus embryonale fibroblast (iMEF) feeder-afhængige til feeder-fri betingelser på definerede ekstracellulære matrix komponenter, og fra komplekse medier formuleringer til kemisk definerede medium vilkår 14. Sådanne forbedringer har reduceret variabilitet i hPSCs grundet batch-til-batch forskelle i iMEF forberedelse og knockout serum udskiftning komponenter, og dermed give en mere reproducerbar miljø for hPSC differentiering. I mellemtiden, forbedret kendskab til signalveje for humane embryonale udvikling, samt fund fra high-throughput narkotika screeninger, har ført til forbedrede differentiering protokoller 15, 16, 17, 18. Disse protokoller mere nøje efterligner i vivo udviklingsmæssige trin og generere celletyper, der nøje rekapitule- deres in vivo modstykker. For hPSC differentiering i bugspytkirtlen afstamning, indledende protokoller efterlignede tidlige pancreas udvikling relativt godt, men til sidst genererede polyhormonal p-celler, der var af umodne føtale fænotyper og responderet dårligt til glukose stimulation. Nylige fremskridt 16, 17, 19, 20 har tilladt til generering af glucose-responsive pankreatiske p-lignende celler, der vil sætte os i stand til at undersøge senere begivenheder, såsom dannelsen og den videre modning af monohormonal p-celler. Her har vi detaljeret anvendelsen af genom-modificerede linjer for studiet af pancreas udvikling ved at kombinere iCRISPR systemet med hPSC-baserede in vitro differentiering platform mod glucose-responsive pancreatic p-lignende celler. Denne kobling af kraftfulde genom redigeringsværktøjer med en forbedret hPSC differentiering protokol tilbyder ikke kun den hastighed og omfang er nødvendige for at imødekomme den stigende efterspørgsel efter validering sygdom kausalitet, men også muliggør avancerede genetiske manipulationer for yderligere mekanistiske undersøgelser transkriptionel kontrol underliggende normal udvikling og sygdom 9 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="847">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:368px;">Chemically defined medium (E8)</td>
			<td style="width:261px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">A1517001</td>
			<td style="width:87px;">Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Truncated recombinant human form of vitronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563029</td>
			<td>1X, animal origin free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418 Sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10131035</td>
			<td>Geneticin Selective Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td>Puromycin Selective Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA Polymerase (Herculase II Fusion)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600679</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEGAshortscript T7 Transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Reduced Serum Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69504</td>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BLAR medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine supplement (GlutaMAX)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaHCO3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>LAMPIRE Biological Laboratories</td>
			<td>7500855</td>
			<td>Fatty acid free</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GDF8</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CHIR-99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>GSK-3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SANT1</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1974</td>
			<td>Hedgehog inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LDN</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0019</td>
			<td>BMP inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IWP-2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3533</td>
			<td>Wnt antagonist&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ITS-X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TPB</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565740-1MG</td>
			<td>PKC activator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3,3&#8217;,5-Triiodo-L-thyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ALK5i II</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-445</td>
			<td>ALK5 inhibitor II</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZnSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GSiXX</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565789</td>
			<td>Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-Cys (N-acetyl cysteine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trolox</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>648471</td>
			<td>Vitamin E analogue</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">R428</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2841</td>
			<td>AXL receptor tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24mm Transwell with insert</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gene Pulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.4 cm Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-TALEN-L</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-TALEN-R</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-Neo-M2rtTA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-Puro-iCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>58409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0302L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer 2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7002S</td>
			<td>NEBuffer 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Long oligonucleotide</td>
			<td>Eton Bioscience or IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOX17 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1924</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FOXA2 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CXCR4-APC antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170A</td>
			<td>1: 25</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NKX6.1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F55A12</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NKX2.2 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NEUROD1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-1084</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0564</td>
			<td>1: 2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C-peptide antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>GN-ID4-c</td>
			<td>1: 2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucagon antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2654</td>
			<td>1: 1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing and directed differentiation of hpscs for interrogating lineage determinants in human pancreatic development

Afhøre genfunktion i selvfornyende eller differentiere menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) tilbyder en værdifuld platform til at forstå den menneskelige udvikling og dissekere sygdomsmekanismer i et fad. For at udnytte dette potentiale applikation kræver effektive genom-redigeringsværktøjer til at generere hPSC mutanter i sygdoms-associerede gener, samt in vitro hPSC differentiering protokoller til at producere sygdomsrelaterede relevant celletyper, der nøje rekapitule- deres in vivo modstykker. Et effektivt genom-redigering platform for hPSCs opkaldt iCRISPR er udviklet gennem Talen-medieret målretning af en Cas9 ekspressionskassette i AAVS1 locus. Her er de protokoller for generering af inducerbare Cas9 hPSC linjer ved hjælp celler dyrket i et kemisk defineret medium, og en feeder-fri tilstand beskrevet. Detaljerede procedurer for brug af iCRISPR systemet til gen-knockout eller præcise genetiske ændringer i hPSCs, enten gennem non-homolog ende sammenføjning (NHEJ) eller via præcise nukleotidændringer bruger homologi-dirigeret reparation (HDR) skabelon henholdsvis er inkluderet. Disse tekniske procedurer omfatter beskrivelser af design, produktion og transfektion af CRISPR guide RNA (gRNAs); målingen af ​​CRISPR mutation renten med T7E1 eller RFLP analyser; og etablering og validering af klonede mutant linjer. Endelig har vi krønike procedurer for hPSC differentiering til glucose-responsive pankreatiske p-lignende celler ved at efterligne in vivo bugspytkirtlen fosterudvikling. Kombinere iCRISPR teknologi med instrueret hPSC differentiering muliggør systematisk undersøgelse af gen-funktion til at fremme vores forståelse af pancreas udvikling og diabetes sygdomsmekanismer.

<html> hPSC kemisk definerede og Feeder-fri kultur Tilpasning og vedligeholdelse hPSCs dyrket på iMEF foderautomater hurtigt kan tilpasses til VTN-coatede plader i feeder-fri kultur tilstand. Den samme opdeling forhold som normal iMEF feeder kultur kan anvendes under tilpasning. Figur 1A viser typiske morfologier af hPSCs på iMEF foderautomater i KSR-baserede medium og på en VTN-overflade i feeder-frit medium. Figur 1B viser en typisk morfologisk forandring og vækst af hPSC kolonier i løbet af første passage af tilpasningsstrategier (4 dage). Cellerne kan yderligere dyrket i flere passager eller fryses til fremtidige eksperimenter. Udføre 2 - 3 passager af tilpasning kultur, før du starter differentiering eksperimenter. Karyotyping anbefales også efter tilpasning, selv om vi ikke har observeret karyotype abnormiteter under tilpasning fase. &quot;Fo: holde-together.within-side =&quot; 1 &quot;&gt; Generation of iCas9 hPSC Lines gennem Talen-medieret AAVS1 Målretning Som tidligere vist, blev hPSCs elektroporeret med et par AAVS1 Talen plasmider og Cas9 og M2rtTA plasmider 5. Figur 2A og B viser detaljeret donorvektor målretning design og hele proceduren for at generere iCas9 hPSC klonale linjer. Efter antibiotisk udvælgelse, encellede-afledte kloner, der udviser tilstrækkelig størrelse og typiske hPSC morfologi var klar til at blive plukket (10 - 12 dage efter elektroporering, figur 2C). Normalt ~ 50% af klonerne er korrekt målrettet uden tilfældige integrationer, som verificeret ved Southern blotting (figur 2D) 5. Vilkårlig integration kan forårsage utætte ekspression af Cas9 i fravær af doxycyclin behandling. Effektiv Genetisk MNDRING i hPSCs Brug af iCRISPR Platform I etablerede iCas9 hPSCs er Cas9 udtrykkes med doxycyclin behandling og guidet til sit mål locus af de transfekterede gRNAs, hvor det genererer DSBs. I mangel af en reparation skabelon, DNA-reparation via NHEJ genererer indels, som ofte resulterer i gen afbrydelse eller knockout. I nærvær af en reparation skabelon (fx et ssDNA donor), kan HDR anvendes til præcise genetiske ændringer, såsom generering af en patient-specifik mutation i en vildtype hPSC baggrund eller korrigere en sygdom-associeret genetisk variant i patient- afledte iPSCs (figur 3A). Det tager ~ 1 måned til frembringelse klonale mutante linjer ved hjælp af iCRISPR systemet. Efter iCas9 induktion og gRNA transfektion, T7EI og / eller RFLP-assays blev anvendt til at vurdere Cas9 skæreeffektivitet, og de transficerede celler blev senere podet som enkelte celler i 10 cm skåle ved lav densitet (-500 - 2, 000celler / 10-cm skål). 10 - 12 dage senere blev enkelt-celle-afledte kloner anbragt i brøndene på en 96-brønds plade til ekspansion og yderligere karakterisering (dvs. genotypebestemmelse og Western blotting) (figur 3B). Da iCRISPR-medieret gen-knockout er højeffektive, er ingen udvælgelsesproces involveret, og normalt på 20 - 50% biallele mutanter kan let opnås (figur 3C) 5. For effektive og præcise genetiske ændringer, er gRNAs co-transficeret med et ssDNA donor bærer den specifikke sekvens ændring (for en lille, men bestemt ændring af genomsekvens). Ofte, at forhindre en ny skæring i modificerede alleler, anbefales det at indbefatte en tavs mutation i umiddelbar nærhed af eller i PAM-sekvensen (figur 3D). Med dette system ~ 10% af kloner, der bærer den ønskede HDR-medieret genom modificering uden yderligere ændringer i begge alleler opnås (figur 3E). Den hurtige og precise modifikation af hPSC genom ved hjælp af iCRISPR platform giver os mulighed for hurtigt og effektivt at gøre hPSC linjer, der tjener som modeller for forskning i menneskers udvikling og sygdom. Effektiv Differentiering af hPSCs mod Glukose-responsive p-lignende celler Nylige fremskridt i hPSC pancreas differentiering har muliggjort udviklingen af ​​protokoller, der nøje rekapitule- bugspytkirtlen fosterudvikling. Udifferentierede hPSCs første differentieret til den endelige endoderm, derefter ind PDX1 + tidlige pancreas progenitorer (PP1) og PDX1 + NKX6.1 + senere pancreasstamfaderceller (PP2), og endelig til glucose-responsive β-lignende celler 16, 17, 19, 20 , 23, 24. Disse protocoler blev yderligere optimeret til pålideligt generere PDX1 + NKX6.1 + pancreas progenitorer og glucose-responsive p-lignende celler 9. Figur 4A viser de detaljerede kemiske kosttilskud anvendes på hvert trin af differentiering. Normalt ~ 80% sammenflydning 2 dage efter den indledende celleudpladning er ideelle til at starte differentieringen af HUES8 hPSCs (figur 4B). Test flere forskellige seeding tætheder anbefales stærkt at opdage den optimerede betingelse for hver specifik cellelinje. Sædvanligvis mindst 75% FOXA2 + SOX17 kan opnås + -celler på de Stage og 40% PDX1 + NKX6.1 + celler på PP2 stadium (figur 4C). På S5 stadium, tilstedeværelsen af en aura-lignende form omkring celleaggregatet er en indikator for den gode cellernes overlevelse, hvilket er vigtigt for yderligere differentiering til NKX6.1 + CPEP + glucose-responsive p-lignende celler (figur 4D ). Denne protokol er nyttig til at studere menneskets bugspytkirtel d<html> dvikling og sygdom i en skål. <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig1.jpg" /> Figur 1. hPSC kemisk definerede og Feeder-fri vedligeholdelse og Kultur Tilpasning fra iMEF Feeders. (A) Repræsentative billeder af hPSCs dyrket på iMEF arkføder eller på VTN på dag 4, klar til at blive delt. (B) Typisk morfologi hPSCs under den første passage af tilpasning i feeder-fri kultur fra en iMEF arkføder. Dag 4 hPSCs dyrket på iMEF foderautomater blev splittet og udsået på VTN-overtrukne plader i kemisk defineret medium med ROCK-hæmmer. Opdelingen forholdet var den samme som den sædvanlige opdeling ratio for dyrkning i iMEF feeder betingelser. Mediet blev skiftet hver dag uden ROCK inhibitor. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <html> ve_content &quot;fo: holde-together.within-side =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig2.jpg" /> Figur 2. generation af iCas9 hPSC Lines. (A) Målretning strategi til generering af iCas9 hPSC linjer. Puro-Cas9 donor og Neo-M2rtTA donor var rettet i den menneskelige AAVS1 locus af et par AAVS1 Talens. (B) Skematisk af hele targeting processen, herunder elektroporation, antibiotisk udvælgelse, koloni plukning og ekspansion, og cellelinie karakterisering. (C) repræsentant single-celleklon klar til at blive plukket på omkring 10 - 12 dage efter elektroporering. (D) Southern blot eksempler til identifikation korrekt målrettede kloner uden yderligere integration af to donorplasmider. Korrekte kloner er markeret med rødt. (A) og (D) blev tilpasset fra reference 5, med tilladelse.ig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig3.jpg" /> Figur 3. Effektiv genetiske modifikation i hPSCs Brug af iCRISPR System. (A) Skematisk til generering af gen-knockout mutanter eller præcise genetiske modifikation under anvendelse af iCRISPR systemet. (B) målretning procedure og klonal linje etablering. (C) Gene knockout effektivitet gennem NHEJ i hPSCs 9. (D) Design af et ssDNA bærer en specifik nukleotid modifikation. P, i rødt: patient-specifik mutation; X, i grøn: tavs mutation. (E) Effektivitet af HDR-medierede præcis nukleotid modifikation. En præcis R456C mutation (forårsaget af en bestemt nukleotid C&gt; T mutation) i GATA6 locus blev indført ved hjælp af iCRISPR systemet.(Se Referencer 5 for mere detaljerede oplysninger). (C) og (E) blev tilpasset fra reference 9 og reference 5, henholdsvis med tilladelser. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig4.jpg" /> Figur 4. Directed hPSC Differentiering til glucose-responsive pankreatiske p-lignende celler. (A) Skematisk af den detaljerede differentiering protokol, med kemikalier suppleres på hvert trin af differentiering. Signalveje, der aktiveres eller hæmmede under differentiering er markeret med grønt eller rødt, hhv. CHIR: GSK3 inhibitor; GDF8: vækst differentiering faktor 8 eller myostatin, en TGF-beta protein familiemedlem; HH: Pindsvin; DE: Definitive endoderm; PP1:PDX1 + tidlig pancreasstamfadercelle; PP2: PDX1 + NKX6.1 + senere pancreasstamfadercelle. (B) Typisk sammenflydning (70 - med 80%) af hPSCs 48 timer efter såning når de er klar til differentiering indvielse. (C) Repræsentative immunfluorescensfarvning billeder, der viser den vellykkede differentiering i den endelige endoderm (DE) fase (FOXA2 og SOX17 co-farvning), pancreas progenitor etape (PP2: PDX1 og NKX6.1 co-farvning), og glucose-responsive β- lignende celle stadiet (NKX6.1 og C-peptid co-farvning). Generelt, for at opnå mere end 10% NKX6.1 + CPEP + -celler ved β-lignende celle stadiet, mindst 75% FOXA2 + SOX17 + de celler og 40% PDX1 + NKX6.1 + PP2 celler afkræves ved de tilsvarende faser. (D) Typisk morfologi af en celle samlet efter S5 fase på en insert filtermembran i air-væske-grænsefladen kultur. De overlevende celler har migreret til midten af ​​aggregatet (i mørke) og efterladt en aura-lignende struktur på kanten. (A </strong&gt;) og (D) blev tilpasset fra reference 9 med tilladelser. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Plasmid </td><td> Beløb </td></tr><tr><td> AAVS1-Talen-L </td><td> 5 ug </td></tr><tr><td> AAVS1-Talen-R </td><td> 5 ug </td></tr><tr><td> AAVS1-Puro-iCas9 </td><td> 40 ug </td></tr><tr><td> AAVS1-Neo-M2rtTA </td><td> 40 ug </td></tr></tbody></table> tabel 1 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Primer </td><td> sekvens </td></tr><tr><td>T7F </td><td> TAATACGACTCACTATAGGG </td></tr><tr><td> TracrR </td><td> AAAAGCACCGACTCGGTGCC </td></tr></tbody></table> tabel 2 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Komponent </td><td> Beløb </td></tr><tr><td> Hedeselskabet 2 O </td><td> 35,5 uL </td></tr><tr><td> 5x PCR reaktion buffer </td><td> 10 pi </td></tr><tr><td> dNTP-blanding (25 mM) </td><td> 0,5 uL </td></tr><tr><td> T7F (10 uM) </td><td> 1,25 uL </td></tr><tr><td> TracrR (10 uM) </td><td> 1,25 uL </td></tr><tr><td> T7-gRNA IVT skabelon (250 nM) </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> DNA-polymerase </td><td> 0,5 uL </td></tr><tr><td> Total PCR-reaktionsblandingen </td><td> 50 pi </td></tr></tbody&gt; </table> tabel 3 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4"> PCR cykelforhold </td></tr><tr><td> cyklusnummer </td><td> denaturere </td><td> anneal </td><td> Forlænge </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 94 ºC, 2 min </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-31 </td><td> 94 ºC, 20 s </td><td> 60 ºC, 20 s </td><td> 72 ºC, 1 min </td></tr><tr><td> 32 </td><td></td><td></td><td> 72 ºC, 2 min </td></tr></tbody></table> tabel 4 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Komponent </td><td><strong&gt; Beløb </td></tr><tr><td> T7 ATP </td><td> 2 uL </td></tr><tr><td> T7 CTP </td><td> 2 uL </td></tr><tr><td> T7 GTP </td><td> 2 uL </td></tr><tr><td> T7 UTP </td><td> 2 uL </td></tr><tr><td> T7 10x buffer </td><td> 2 uL </td></tr><tr><td> T7 enzymblanding </td><td> 2 uL </td></tr><tr><td> PCR amplificeret skabelon </td><td> 8 pi </td></tr><tr><td> Total in vitro gRNA transkription mix </td><td> 20 pi </td></tr><tr><td> Der inkuberes ved 37 ºC i 6 timer til natten over </td><td></td></tr></tbody></table> tabel 5 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Komponent </td><td> Mængde (pi) </td></tr><tr><td> Uoprenset PCR-produkt </td><td> 8 </td></tr&gt; <tr><td> Buffer 2 10x </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Destilleret vand (dH 2 O) </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> tabel 6 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> DNA denaturering og hybridisering cykelforhold </td></tr><tr><td> Temperatur </td><td> Varighed </td><td> thermocycler betingelser </td></tr><tr><td> 95 ° C </td><td> 10 min </td><td></td></tr><tr><td> 85 ° C </td><td> 1 min </td><td> Rampe til 85 ° C ved 2 ° C / s </td></tr><tr><td> 75 ° C </td><td> 1 min </td><td> Rampe til 75 ° C ved 0,3 ° C / s </td></tr><tr><td> 65 ° C </td><td> 1 min </td><td> Rampe til 65 ° C ved 0,3 ° C / s </td></tr><tr><td> 55 ° C &lt;/ Td&gt; <td> 1 min </td><td> Rampe til 55 ° C ved 0,3 ° C / s </td></tr><tr><td> 45 ° C </td><td> 1 min </td><td> Rampe til 45 ° C ved 0,3 ° C / s </td></tr><tr><td> 35 ° C </td><td> 1 min </td><td> Rampe til 35 ° C ved 0,3 ° C / s </td></tr><tr><td> 25 ° C </td><td> 1 min </td><td> Rampe til 25 ° C ved 0,3 ° C / s </td></tr><tr><td> 4 ° C </td><td> Holde </td><td></td></tr></tbody></table> tabel 7 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Scene </td><td> Dag </td><td> Medier </td><td> Supplement </td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"> S1 </td><td> d0 </td><td> S1 </td><td> GDF8 100 ng / ml </td><td> CHIR-99.021 3 uM </td></tr><tr><td> d1 </td><td> S1 </td><td> GDF8 100 ng / ml </td><td> CHIR-99.021 0,3 uM </td></tr><tr><td> d2 </td><td> S1 </td><td> GDF8 100 ng / ml </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> S1 medier: MCDB 131 + 1x L-glutamin supplement + 0,5% BSA + 1,5 g / l NaHCO3 + 10 mM glucose </td></tr></tbody></table> tabel 8 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Scene </td><td> Dag </td><td> Medier </td><td colspan="8"> Supplement </td></tr><tr><td> S2 </td><td> d3-d4 </td><td> S1 </td><td> LAA 0,25 mM </td><td> FGF7 50 ng / ml </td><td> IWP-2 2,5 uM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td&gt; S3 </td><td> d5-d6 </td><td> S3 </td><td> LAA 0,25 mM </td><td> FGF7 50 ng / ml </td><td> SANT-1 0,25 uM </td><td> RA 1 uM </td><td> LDN 100 nM </td><td> TPB 200 nM </td><td> ITS-X 1: 200 </td><td></td></tr><tr><td> S4 </td><td> d7-d9 </td><td> S3 </td><td> LAA 0,25 mM </td><td> FGF7 2 ng / ml </td><td> SANT-1 0,25 uM </td><td> RA 0,1 pm </td><td> LDN 200 nM </td><td> TPB 100 nM </td><td> ITS-X 1: 200 </td><td> IWP-2 2,5 uM </td></tr><tr><td colspan="11"> S3 medier: MCDB 131 + 1x L-glutamin supplement + 2% BSA + 2,5 g / l NaHCO3 + 10 mM glucose </td></tr></tbody></table> tabel 9 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-side = &quot;altid&quot;&gt; <tbody><tr><td> Scene </td><td> Dag </td><td> Medier </td><td colspan="8"> Supplement </td></tr><tr><td> S5 </td><td> d10-d12 </td><td> S5 </td><td> T3 1 uM </td><td> ALK5i II 10 uM </td><td> SANT-1 0,25 uM </td><td> RA 0,05 pm </td><td> LDN 100 nM </td><td> ITS-X 1: 200 </td><td> ZnSO4 10 uM </td><td> Heparin 10 ug / ml </td></tr><tr><td> S6 </td><td> D13-st D19 </td><td> S5 </td><td> T3 1 uM </td><td> ALK5i II 10 uM </td><td> GSiXX 100 nM </td><td></td><td> LDN 100 nM </td><td> ITS-X 1: 200 </td><td> ZnSO4 10 uM </td><td> Heparin 10 ug / ml </td></tr><tr><td> S7 </td><td> d20- D33 </td><td> S5 </td><td> T3 1 uM </td><td> ALK5i II 10 uM </td><td> N-Cys 1 mM </td><td> Trolox 10 uM </td><td> R428 2 uM </td&gt; <td> ITS-X 1: 200 </td><td> ZnSO4 10 uM </td><td> Heparin 10 ug / ml </td></tr><tr><td colspan="11"> S5 medier: Blar + 1x L-glutamin supplement + 2% BSA + 1,5 g / l NaHCO3 + 20 mM glucose </td></tr></tbody></table> tabel 10

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development at JoVE.com

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Protokoller til at generere hPSC mutante linjer ved hjælp af iCRISPR platformen og til at differentiere hPSCs til glucose-responsive p-lignende celler er beskrevet. Kombinere genom redigering teknologi med hPSC-rettet differentiering giver en stærk platform for systematisk analyse af den rolle, slægt determinanter i menneskelig udvikling og sygdomsprogression.

Genome Redigering og Directed Differentiering af hPSCs spørgekriterierne Lineage Determinanter i Human pancreas Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Research

JoVE Journal

Genetics

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetode til at undersøge ejendommen mutagenicitet som en funktion af punkt Mutation reparation katalyseret af CRISPR/Cas9 og SsODN i humane celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Mikroinjektion af CRISPR/Cas9 Protein i kanal havkat, Ictalurus punctatus, embryoner til Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Bestemmelse af Genome-wide udskrift henfald priser i prolifererende og inaktiv humane fibroblaster

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Målrettet næste generation Sequencing og bioinformatik rørledningen for at evaluere genetiske determinanter for forfatningsmæssige sygdom

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Forbedret genom-redigering med Cas9 Ribonucleoprotein i forskellige celler og organismer

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen redigering at gøre betinget mutanter af menneskelige Malaria parasitten, P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-medieret genom-redigering af menneskelige svampe patogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genom-redigering i pattedyr cellelinjer ved hjælp af CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Omdanne, genomredigering og Phenotyping kvælstofbindende tropisk Cannabaceae træ Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Karakterisering af In Vitro Differentiering af humane primære Keratinocytter ved RNA-Seq Analyse

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...