Name: genome editing and directed differentiation of hpscs for interrogating lineage determinants in human pancreatic development
Uploaded: 2017-03-05T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development at JoVE.com

Dit werk werd deels gefinancierd door de NIH / NIDDK (R01DK096239) en New York State Stem Cell Science (NYSTEM C029156). ZZ werd gesteund door de NYSTEM postdoctorale beurs van het Center for Stem Cell Biology van het Sloan Kettering Institute.

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li><li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells.">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li><li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells.">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11 (7), 514-518 (2001).</li><li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases.">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li><li>Gonz&#225;lez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iCRISPR+Platform+for+Rapid,+Multiplexable,+and+Inducible+Genome+Editing+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 215-226 (2014).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells.">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5 (5), 389-392 (2008).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+of+Lineage+Determinants+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Reveals+Mechanisms+of+Pancreatic+Development+and+Diabetes.">Genome Editing of Lineage Determinants in Human Pluripotent Stem Cells Reveals Mechanisms of Pancreatic Development and Diabetes.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 755-768 (2016).</li><li>Kotini, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+chromosomal+deletion+associated+with+myelodysplastic+syndromes+using+isogenic+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).</li><li>Carlson-Stevermer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Analysis+of+CRISPR-Cas9+Gene-Edited+Human+Embryonic+Stem+Cells.">High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 109-120 (2016).</li><li>Zhu, Z., Verma, N., Gonzalez, F., Shi, Z. D., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas-Mediated+Selection-free+Knockin+Strategy+in+Human+Embryonic+Stem+Cells.">A CRISPR/Cas-Mediated Selection-free Knockin Strategy in Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1103-1111 (2015).</li><li>Mandegar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+Interference+Efficiently+Induces+Specific+and+Reversible+Gene+Silencing+in+Human+iPSCs.">CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+functional+glucagon-secreting+alpha-cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells.</a> Diabetes. 60 (1), 239-247 (2011).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+that+directs+differentiation+of+human+ESCs+into+the+pancreatic+lineage.">A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage.</a> Nat Chem Biol. 5 (4), 258-265 (2009).</li><li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+NKX6-1++pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li><li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro.">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO J. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li><li>Zhu, Z., Gonzalez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods Enzymol. 546, 215-250 (2014).</li><li>Soh, C. L., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Mediated+Mutagenesis+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+Defined+Xeno-Free+E8+Medium.">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium.</a> Methods in Molecular Biology. 1498, (2017).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li><li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 750-756 (2011).</li><li>Musunuru, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+pluripotent+stem+cells+to+generate+human+cellular+disease+models.">Genome editing of human pluripotent stem cells to generate human cellular disease models.</a> Dis Model Mech. 6 (4), 896-904 (2013).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+alpha1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+genome+editing+using+ssDNA+oligonucleotides+with+zinc-finger+nucleases.">High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases.</a> Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).</li><li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+incidence+of+off-target+mutations+in+individual+CRISPR-Cas9+and+TALEN+targeted+human+stem+cell+clones+detected+by+whole-genome+sequencing.">Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Gene-Corrected+Adult+Beta+Globin+Protein+in+Human+Erythrocytes+Differentiated+from+Patient+iPSCs+After+Genome+Editing+of+the+Sickle+Point+Mutation.">Production of Gene-Corrected Adult Beta Globin Protein in Human Erythrocytes Differentiated from Patient iPSCs After Genome Editing of the Sickle Point Mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Shi, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+hPSCs+Reveals+GATA6+Haploinsufficiency+and+a+Genetic+Interaction+with+GATA4+in+Human+Pancreatic+Development.">Genome Editing in hPSCs Reveals GATA6 Haploinsufficiency and a Genetic Interaction with GATA4 in Human Pancreatic Development.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Tijd Overwegingen voor het genereren Mutant Lines Hoewel de recente benaderingen gebaseerd op CRISPR / Cas systemen voor het genoom bewerking hebben geleid tot succesvolle targeting, zou een meer effectieve en universeel platform voorkeur voor grootschaliger analyses van gen-functie zijn. De iCRISPR platform biedt een snelle en efficiënte methode om mutaties te introduceren aan een gen van belang 5, 9. Ten eerste, de PCR-gebaseerde gRNA synthesewerkwijze maakt de productie van honderden gRNAs in array vorm in een dag zonder tijdrovende kloneringstappen. Ten tweede, met doxycycline-induceerbare expressie in Cas9 iCas9 hPSCs de stap waarbij gRNA transfectie vereist slechts een minimale hoeveelheid werk en dus kan veelvoudige gRNA targeting experimenten gelijktijdig worden uitgevoerd. Ten derde, door de hoge efficiënties targeting haalbaar is met ons systeem de analyse van ~ 24-48 kolonies per gRNA getransfecteerd moeten worden Sufficient meerdere monoallelische en biallele mutantlijnen leggen voor een enkel gen, hoewel efficiëntie variëren afhankelijk van de doelwitlocus. Omdat het mogelijk is voor een geschoold persoon voor het mechanisch ophalen 384 kolonies (4 x 96-well platen) in een vergadering, waarin rekening ~ 4 uur onder een dissectie microscoop kan een getrainde persoon verwachting mutantlijnen invloed 12 genen in genereren 12 maanden. De gestroomlijnde HPSC generatie mutanten in korte tijd maakt de systematische analyse van een array van transcriptiefactoren en / of signaling pathway componenten die met elkaar, het reguleren ontwikkelingsproces 9. Bovendien, efficiënte multiplex gen targeting opent ook de deur naar het onderzoek naar genetische interacties onderliggende ingewikkelde menselijke kenmerken. Generatie van Precise genetische modificaties De afleiding van patiënt-specifieke iPSCs van gemakkelijk toegankelijke somatische celtype<html> s en de differentiatie naar de ziekte-relevante celtypen bieden een geweldige kans voor de validatie van ziekte-geassocieerde mutaties. Vanwege de grote variatie in genetische achtergrond tussen individuen, directe vergelijkingen tussen iPSCs van patiënten en van gezonde donoren niet mogelijk maken om ziekte fenotypes te onderscheiden van achtergrondeffecten. Daarom is het noodzakelijk om isogene controle iPSCs genereren op door de ziektemutatie terug naar de wild-type sequentie of de patiënt-specifieke mutaties te introduceren in een wildtype achtergrond HPSC, zoals voorgesteld door anderen 25, 26. Naast het verlies van functie (null) mutaties, kan men nu nauwkeuriger ziektemechanismen ontleden door de invoering van een patiënt-specifieke sequentie veranderingen in de endogene locus in hPSCs, waaronder hypermorphic, hypomorfe, neomorphic of dominant-negatieve patiënten mutaties. ntent &quot;&gt; Exacte genetische modificatie telt HDR voor DSB-reparatie in aanwezigheid van een reparatie sjabloon. Omdat het veel minder efficiënt dan NHEJ-gemedieerde DNA herstel, een donor plasmide dat het patiënt-specifieke mutatie, een geneesmiddel selectiecassette en homologie-armen is eerder gebruikt als reparatie sjabloon 2. Na geneesmiddel selectie en controle van de patiënt-specifieke mutatie, wordt een tweede stap het algemeen nodig geneesmiddelselectie cassette te verwijderen. Terwijl de meest gebruikte Cre-loxP en FLP-FRT systemen achterlaten overblijvende sequentie van de endogene locus, het gebruik van piggyBac transposon is toegestaan voor de naadloze verwijdering van het geneesmiddel selectiecassette 27. recentelijk korte ssDNA sjablonen ook aangetoond dat efficiënte HDR drager met gemanipuleerde DNA endonucleasen 28. Vergeleken met een donorplasmide , ssDNA kunnen direct worden gesynthetiseerd en dus omzeilt de tijdrovende kloneringsstap. Hier heeft zijnen aangetoond dat door co-transfectie gRNA en een ssDNA-template om homologie gerichte reparatie induceren, kan iCRISPR worden gebruikt om specifieke nucleotide modificaties met hoge efficiëntie introduceren. Dit is essentieel voor niet alleen onderzoek naar de rol van essentiële nucleotiden binnen eiwit functionele domeinen, maar ook voor het modelleren van menselijke ziekte mutaties en mogelijk corrigeren van deze ziekte geassocieerde mutaties voor therapeutische interventie. Vanwege het grote aantal gevoeligheid loci die elk zijn gekoppeld aan meerdere sequentievarianten, het modelleren van complexe en multigenic ziekten zoals diabetes een uitdaging voor genetici geweest. Als het platform iCRISPR tolerant voor de snelle vorming van een allelische reeks of multiplexable gentargeting, kan het onderzoek van meerdere ziektegeassocieerde loci vergemakkelijken, afzonderlijk of in combinatie met isogene achtergronden. Gericht op efficiëntie en Off-target effecten We hebben<html> vond een goede correlatie tussen de T7E1 en RFLP analyseresultaten en het aantal mutante lijnen geïdentificeerd door sequentiebepaling. Dit benadrukt het belang van het uitvoeren van deze testen in parallel met de oprichting van klonale lijnen. Terwijl de richtende efficiëntie verkregen kan variëren naargelang de genomische loci in de meeste enkele-gerichte mutagenese experimenten, 20-60% van de klonen werden gevonden met beide allelen gemuteerd (inclusief in-frame en frameshift mutaties) 9. Wanneer multiplexed gentargeting werd uitgevoerd, drie biallelische mutante klonen met 5-10% rendement verkregen 5. ssDNA-gemedieerde HDR van verschillende genen werden ook uitgevoerd om precieze genetische veranderingen te verkrijgen, de efficiëntie van het verkrijgen van homozygote knock-in klonen variërend van 1 - 10% 5. Werken met CRISPR / Cas in hPSCs eventuele mutaties in potentiële off-target sites die niet dezelfde gRNA doelsequentie niet delen moeten nog worden ontdektlass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 9, 12. Hele genoom sequencing uitgevoerd in een recente studie heeft ook geen substantiële off-target mutaties te identificeren in klonale HPSC lijnen gegenereerd met behulp van CRISPR / Cas 29. Niettemin, om eventuele effect van het verwarren fenotypes geïntroduceerd door mutaties op off-target effect locaties te minimaliseren, wordt voorgesteld om onafhankelijke mutant lijnen met behulp van ten minste twee onafhankelijke gRNAs gericht is op verschillende sequenties in hetzelfde gen te genereren. Vergelijkbare fenotypes waargenomen in meerdere regels gegenereerd met behulp van verschillende gRNAs kon voornamelijk uit te sluiten dat het fenotype afkomstig is van een off-target effect. Feeder-afhankelijke versus Independent Culture en Targeting Traditionele methoden voor het HPSC cultuur te betrekken hun onderhoud en uitbreiding op de feeder cellen in media die serum of serum vervanger die dierlijke prod omvatducten, zoals runderserumalbumine. Feeder cellen, serum, serum vervanging, en albumine bevatten allemaal complexe, ongedefinieerde componenten en vertonen grote batch variabiliteit. Aanpassing aan de feeder-vrij en chemisch gedefinieerde toestand vermindert de inspanningen voor HPSC onderhoud en, nog belangrijker, vergroot de samenhang van differentiatie experimenten. Op dit moment zijn er zeer weinig studies die het genoom bewerken procedures op hPSCs gekweekt in volledig gedefinieerde kweekomstandigheden 30 te beschrijven. We hebben hogere CRISPR richten op efficiëntie bij gRNA transfectie en klonen afzetting werden uitgevoerd in feeder-vrije omstandigheden in vergelijking met feeder-afhankelijke kweekomstandigheden gevonden. Wij geloven dat dit als gevolg van verhoogde celoverleving na transfectie en eencellige zaaien voor kolonievorming. Bovendien hebben voedingscellen Eerder is aangetoond dat transfectie reagentia sekwestreren, waardoor de transfectie-efficiëntie verlagen. De combinatie vanGenoom bewerken met Directed Differentiatie Previous differentiatie protocollen leverde slechts een kleine fractie van insuline-positieve cellen, waarvan de meeste waren polyhormonal en leken foetale endocrine cellen 23. Recente ontwikkelingen hebben de differentiatie van hPSCs toegelaten tot meer gerijpte glucose reagerende beta-achtige cellen 16, 17, 19, 20. We kunnen gewoonlijk minstens 75% definitieve endoderm cellen, 40% Pdx1 + + Nkx6.1 alvleesklier progenitoren en ongeveer 20% Nkx6.1 CPEP + + glucose reagerende beta-achtige cellen te verkrijgen middels HUES8 hPSCs 9. In combinatie met de iCRISPR genoom bewerkingssysteem is deze robuuster differentiatie protocol van de analyse van transcriptiefactoren die cruciaal zijn voor de pancreatische voorlopercellen en endocriene pancreas stadia van differentiatie vergemakkelijkt. Dit maaktZo kunnen met toekomstige studies, een groot aantal kandidaat ziektegenen voor validatie en onderzoek naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan diabetes 9 onderzoeken. Toekomstige toepassingen of richtingen Onze iCRISPR systeem het genereren van meer complexe genomische modificaties, zoals het creëren van reporter allelen door middel vergemakkelijken HDR-gemedieerde gerichte mutagenese met behulp van lange donor DNA-matrijzen coderend eiwit labels of fluorescente reporters 12. We hebben aangetoond dat, vanwege de hoge efficiëntie bereikt CRISPR gericht in het systeem, kan deze werkwijze worden uitgevoerd in hPSCs, zonder de noodzaak van verdere geneesmiddelselectie 12. Verder kan gemultiplexte gene targeting worden gebruikt om genetische interacties te onderzoeken onderliggende complexe menselijke ziekte, zoals in onze recente studie, waarvan wij geloven dat het eerste voorbeeld van deze werkzaamheden 31. iCRISPR kan ook worden gebruikt om genregulerend controle begrijpen door het creëren van deleties hetzij niet-coderende RNA of gen-regulerende gebieden, zoals promoters en enhancers. Efficiënt genereren regulerende mutanten gebruikt iCRISPR kan gRNAs zijn ontworpen dat de bindingsplaats van een DNA-bindend eiwit te verstoren, inclusief maar niet beperkt tot de basale transcriptieapparaat of weefsel-specifieke transcriptiefactor. ssDNA-template gemedieerde HDR kan ook worden gebruikt om specifieke eiwitbindende plaatsen muteren. Tenslotte, voorzien wij dat verdere optimalisering van het gebruik van de iCRISPR platform hPSCs staat stelt hogere throughput genetische analyse van pluripotentie fenotypen of ziekte fenotypes in combinatie met een in vitro differentiatie protocol. Deze-iCRISPR gemedieerde studies kunnen zorgen voor een snellere identificatie van kandidaat-ziekte geassocieerde genen en studies van hun functionele relevantie.

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) de mogelijkheid om zowel zichzelf te vernieuwen en aanleiding geven tot alle derivaten van de drie embryonale kiem lijnen. Zij bieden een waardevolle bron voor cel vervangende therapie en de ziekte modelleren door te dienen als een uniek platform om cellulaire processen te herhalen in een menselijke ontwikkelings-context. Ze zijn ook een bron van experimentele cellen voor schaalbare, high-throughput analyse. Toch is de vooruitgang beperkt gebleven als gevolg van twee belangrijke uitdagingen: het gebrek aan efficiënte genetische modificatie gereedschappen en de moeilijkheid in indient het complex embryonale ontwikkelingsstoornis stappen in een cultuur schotel. Genetische modificatie is een onmisbaar instrument voor bestudering van genfunctie in normale ontwikkeling en ziekte. Hoewel klassieke gene targeting benaderingen via homologe recombinatie hebben bewezen een krachtig instrument om genfunctie te ontleden in muis embryonale stamcellen (mESCs) 1, deze aanpakis zeer inefficiënt bij toepassing op hPSCs 2, 3. De recente stevige toetreding van programmeerbare, site-specific nucleasen uit de natuur tot gebruik in het laboratorium, met inbegrip van zinkvinger nucleasen (ZFNs), transcriptie-activator-achtige effector nucleasen (Talens), en de geclusterde regelmatig afstand van elkaar korte palindroom herhalingen (CRISPR) / CRISPR-geassocieerde (Cas) systemen 4 betekent dat genoom techniek een veel eenvoudiger taak uiteenlopende organismen en cellijnen is geworden, ook in hPSCs. Deze genproducten bewerkingsgereedschappen profiteren van het feit dat chimère nucleasen zoals Cas9 endonuclease een hele reeks genetische modificaties kunnen toestaan ​​door het induceren van dubbelstrengs breuken (DSB&#39;s) op precieze locaties, triggering het endogene DNA repair machines ofwel niet-homologe activeren end verbinding (NHEJ) of homologie gerichte reparatie (HDR). Beide mechanismen kunnen worden benut voor genetische manipulatie door het induceren either willekeurige insertie en deletie mutaties (indels; via NHEJ), om frameshift mutaties die gen allelen, of precieze nucleotidesubstituties (via HDR) ongedaan te maken, om de patiënt mutaties voor ziekten bij de mens modelleren herhalen of om een ziekte veroorzaken mutatie voor gentherapie te corrigeren . CRISPR / Cas-gemedieerde genoom techniek vereist twee componenten: de constante-RNA geleide Cas9 endonuclease die nodig zijn voor DNA-splitsing en een variabel CRISPR RNA (crRNA) en trans-activerende (tracrRNA) duplex dat DNA doelwit herkenning aangeeft. De crRNA / tracrRNA duplex kan worden vervangen door een enkele guide chimeer RNA (gRNA), die zijn gevonden om efficiënter 5, 6, 7 werken. Terwijl de CRISPR / Cas9 systeem is aangepast aan de meest experimentele organismen en cellijnen, de levering en expressie van Cas9 en gRNA varieert aanzienlijk en moet verder worden geoptimaliseerd om Achivooravond efficiënte genoom bewerken in tal van systemen zoals hPSCs 8. Een efficiënte-genoom bewerken platform, iCRISPR, is opgericht in hPSCs 5. In dit systeem heeft een TALEN gemedieerde benadering gebruikt om beide allelen van het &quot;transgen veilige haven locus&quot; AAVS1 in trans, één allel met een omgekeerde tetracycline gecontroleerde transactivator (M2rtTA) en de andere met een tetracycline responselement targeten (TRE ) het aansturen van de expressie van Cas9 (iCas9) in de hPSCs. In gevestigde klonale lijnen (iCas9 hPSCs), wordt Cas9 sterk tot expressie gebracht met doxycycline behandeling. Ondertussen, vanwege de kleine afmetingen (100 nt), enkelvoudige of meervoudige gRNAs gemakkelijk worden afgeleverd in iCas9 hPSCs met hoge efficiency en kan direct Cas9 voor plaatsspecifieke splitsing, waardoor een efficiënte NHEJ gemedieerde gendisruptie, en HDR-gemedieerde exacte nucleotide modificaties in de aanwezigheid van korte enkelstrengs DNA (ssDNA) donor templates. Het systeem kan iCRISPRgebruikt om een panel van ziekte nabootsen HPSC lijnen met biallele (homozygoot of heterozygoot verbinding) of heterozygote verlies-van-functie mutaties succesvol genereren belangrijke ontwikkelingsgenen 5, 9. Terwijl een aantal groepen efficiënte gen bewerken met behulp van CRISPR / Cas in hPSCs hebben gemeld, het succes blijft beperkt tot een klein aantal technologisch adept laboratoria. De iCRISPR platform biedt een efficiënte en toch eenvoudige oplossing voor routine-gen uitgeven door onderzoekers van verschillende niveaus, en het is al gebruikt in een aantal gepubliceerde studies door onze groep en anderen 9, 10, 11, 12. Deze benadering werd ook verder uitgebreid induceerbare silencing basis van de expressie van dCas9-KRAB-13. Samen met de vooruitgang in genoom-editing technologie, zijn belangrijke verbeteringen gerealiseerd in HPSC onderhoud en geregisseerd differentiatie. Cultuur voorwaarden voor hPSCs zijn geëvolueerd van bestraalde muis embryonale fibroblast (iMEF) feeder-afhankelijke aan feeder-vrije omstandigheden op toegezegd extracellulaire matrix componenten, en uit complexe media formuleringen op chemisch gedefinieerde medium omstandigheden 14. Dergelijke verbeteringen zijn de variabiliteit in hPSCs als gevolg van batch-to-batch verschillen in iMEF voorbereiding en knock-out serum vervanging van onderdelen verminderd, en dus zorgen voor een meer reproduceerbare omgeving voor HPSC differentiatie. Anderzijds verbeterde kennis van signaaltransductiewegen betreffende menselijke embryonale ontwikkeling, alsook ontdekkingen van high-throughput drug screenings, hebben geleid tot verbeterde differentiatie protocollen 15, 16, 17, 18. Deze protocollen nauwer na te bootsen in vivo ontwikkelingsstoornissen stappen en het genereren van celtypen dat hun in vivo tegenhangers nauw recapituleren. Voor HPSC differentiatie in de pancreas geslacht, aanvankelijk protocollen nagebootst vroege ontwikkeling van de alvleesklier relatief goed, maar uiteindelijk gegenereerd polyhormonal β cellen die waren onvolwassen foetale fenotypes en reageerde slecht op glucose stimulatie. Recente ontwikkelingen 16, 17, 19, 20 hebben geleid tot de vorming van glucose reagerende pancreas β-achtige cellen, die ons in staat stelt latere gebeurtenissen, zoals de vorming en de verdere rijping van monohormonal β-cellen te onderzoeken. Hier hebben we detail de toepassing van genoom-gemodificeerde lijnen voor de studie van ontwikkeling van de alvleesklier door het combineren van het iCRISPR systeem met de HPSC-gebaseerde in vitro differentiatie platform richting glucose reagerende pancreatic β-achtige cellen. Deze koppeling van krachtige genoom editing tools met een verbeterde HPSC differentiatie protocol biedt niet alleen de snelheid en de omvang die nodig zijn om de groeiende vraag naar het valideren van de ziekte van causaliteit te ontmoeten, maar ook in staat stelt geavanceerde genetische manipulaties voor verdere mechanistische onderzoek naar transcriptie controle ten grondslag liggen aan de normale ontwikkeling en de ziekte van 9 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="847">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:368px;">Chemically defined medium (E8)</td>
			<td style="width:261px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">A1517001</td>
			<td style="width:87px;">Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Truncated recombinant human form of vitronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563029</td>
			<td>1X, animal origin free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418 Sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10131035</td>
			<td>Geneticin Selective Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td>Puromycin Selective Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA Polymerase (Herculase II Fusion)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600679</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEGAshortscript T7 Transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Reduced Serum Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69504</td>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BLAR medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine supplement (GlutaMAX)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaHCO3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>LAMPIRE Biological Laboratories</td>
			<td>7500855</td>
			<td>Fatty acid free</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GDF8</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CHIR-99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>GSK-3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SANT1</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1974</td>
			<td>Hedgehog inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LDN</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0019</td>
			<td>BMP inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IWP-2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3533</td>
			<td>Wnt antagonist&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ITS-X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TPB</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565740-1MG</td>
			<td>PKC activator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3,3&#8217;,5-Triiodo-L-thyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ALK5i II</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-445</td>
			<td>ALK5 inhibitor II</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZnSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GSiXX</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565789</td>
			<td>Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-Cys (N-acetyl cysteine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trolox</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>648471</td>
			<td>Vitamin E analogue</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">R428</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2841</td>
			<td>AXL receptor tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24mm Transwell with insert</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gene Pulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.4 cm Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-TALEN-L</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-TALEN-R</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-Neo-M2rtTA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-Puro-iCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>58409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0302L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer 2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7002S</td>
			<td>NEBuffer 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Long oligonucleotide</td>
			<td>Eton Bioscience or IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOX17 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1924</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FOXA2 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CXCR4-APC antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170A</td>
			<td>1: 25</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NKX6.1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F55A12</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NKX2.2 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NEUROD1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-1084</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0564</td>
			<td>1: 2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C-peptide antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>GN-ID4-c</td>
			<td>1: 2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucagon antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2654</td>
			<td>1: 1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing and directed differentiation of hpscs for interrogating lineage determinants in human pancreatic development

Ondervragen gen-functie in zelf-vernieuwing en differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) biedt een waardevol platform naar het begrijpen van de menselijke ontwikkeling en het ontleden van ziektemechanismen in een schotel. Om te profiteren van dit potentieel toepassing vereist efficiënte genoom bewerkingsgereedschappen te HPSC mutanten in geassocieerde genen, alsook in vitro differentiatie HPSC protocollen genereren ziekte-relevante celtypen op hun in vivo tegenhangers nauw recapituleren produceren. Een efficiënte genoom-editing platform voor hPSCs genoemd iCRISPR is ontwikkeld door de TALEN-gemedieerde targeting van een Cas9 expressiecassette in de AAVS1 locus. Hier, de protocollen voor het genereren van induceerbare Cas9 HPSC lijnen gebruik van cellen gekweekt in een chemisch gedefinieerd medium en een feeder-toestand als beschreven. Gedetailleerde procedures voor het gebruik van de iCRISPR voor gen knock-out of precieze genetische veranderingen in hPSCs, hetzij door middel van non-homologe end-joining (NHEJ) of via nauwkeurige nucleotideveranderingen met een homologie-gerichte reparatie (HDR) template respectievelijk opgenomen. Deze technische procedures bevatten beschrijvingen van het ontwerp, de productie en transfectie van CRISPR gids RNA (gRNAs); de meting van de CRISPR mutatie snelheid door T7E1 of RFLP assays; en de oprichting en validatie van klonale mutant lijnen. Tenslotte kroniek procedures voor HPSC differentiatie in glucose reagerende pancreas β-achtige cellen door in vivo nabootsen alvleesklier embryonale ontwikkeling. De combinatie van iCRISPR technologie met gerichte HPSC differentiatie maakt het systematisch onderzoek van gen-functie aan ons begrip van de ontwikkeling van de alvleesklier en diabetes ziektemechanismen bevorderen.

<html> HPSC chemisch welbepaald en Feeder-vrij Cultuur Adaptation and Maintenance hPSCs gekweekt op iMEF feeders kan snel worden aangepast VTN beklede platen in de feeder-vrije cultuur aandoening. Dezelfde splitsing verhouding als normaal iMEF feeder cultuur kan worden gebruikt tijdens de adaptatie. Figuur 1A toont typische morfologie van hPSCs op iMEF feeders in KSR gebaseerde medium en een VTN beklede oppervlak feeder-vrij medium. Figuur 1B toont een typische morfologische veranderingen en de groei van HPSC kolonies tijdens de eerste passage van aanpassing (4 dagen). De cellen kunnen verder passage behandelde of bevroren voor toekomstige experimenten. Verricht 2-3 passages van de aanpassing cultuur voordat differentiatie experimenten. Karyotypering wordt ook aanbevolen na aanpassing, hoewel we niet karyotype afwijkingen zijn waargenomen tijdens de aanpassing fase. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Het genereren van iCas9 HPSC Lines door middel van TALEN-gemedieerde AAVS1 Targeting Zoals eerder aangetoond, werd hPSCs geëlektroporeerd met een paar AAVS1 TALEN plasmiden en Cas9 en M2rtTA plasmiden 5. Figuur 2A en B toont gedetailleerde donor vector richten op het ontwerp en de hele procedure om iCas9 HPSC klonale lijnen te genereren. Na antibiotische selectie, single-cell-afgeleide klonen tonen van voldoende grootte en typische HPSC morfologie waren klaar om te worden opgehaald (10-12 dagen na elektroporatie, figuur 2C). Gewoonlijk ~ 50% van de klonen goed gericht zonder willekeurige integraties, bevestigd door Southern blotting (Figuur 2D) 5. Willekeurige integratie kan lekke uitdrukking van Cas9 in afwezigheid van doxycycline behandeling. Efficiënte Genetische Mijziging in hPSCs Met behulp van de iCRISPR Platform In gevestigde iCas9 hPSCs wordt Cas9 uitgedrukt met doxycycline behandeling en begeleid naar zijn doel locus door de getransfecteerde gRNAs, waar het genereert DSB. Aangezien een reparatie matrijs DNA herstel door middel van NHEJ genereert indels, die vaak leiden tot genverstoring of knockout. In aanwezigheid van een reparatie sjabloon (bijvoorbeeld een ssDNA donor) kan HDR worden voor nauwkeurige genetische veranderingen, zoals het genereren van een patiënt-specifieke mutatie in een wildtype achtergrond HPSC of corrigeren van een ziekte-geassocieerde genetische variant in patiëntspecifieke iPSCs afgeleid (Figuur 3A). Klaar ~ 1 maand tot klonale mutant lijnen met het iCRISPR systeem genereren. Na iCas9 inductie en gRNA transfectie werden T7EI en / of RFLP assays gebruikt om Cas9 scherpe efficiency te beoordelen, en de getransfecteerde cellen werden later gezaaid als enkele cellen in 10-cm schalen bij lage dichtheid (~ 500-2, 000cellen / 10 cm schaal). 10 - 12 dagen later werden afzonderlijke cel afgeleide klonen geplaatst in de putjes van een 96-putjesplaat voor verdere uitbreiding en karakterisering (dwz genotypering en Western blotting) (Figuur 3B). Aangezien de iCRISPR gemedieerde gen knockout is zeer efficiënt, is geen selectieproces betrokken, en meestal 20-50% biallele mutanten kunnen gemakkelijk worden bereikt (figuur 3C) 5. Efficiënte en nauwkeurige genetische veranderingen, gRNAs worden gecotransfecteerd met ssDNA donor die de specifieke sequentieverandering (voor een kleine, maar specifieke change of genoomsequentie). Vaak voorkomen opnieuw snijden in gemodificeerde allelen, is het raadzaam om een stille mutatie in de nabijheid van of in de PAM sequentie (Figuur 3D) omvatten. Met dit systeem, ~ 10% van klonen die het gewenste HDR-gemedieerde genoom modificatie zonder bijkomende veranderingen in beide allelen worden bereikt (figuur 3E). De snelle en precise modificatie van het HPSC genoom met behulp van de iCRISPR platform stelt ons in staat om snel en efficiënt te maken HPSC lijnen die dienen als modellen voor de studie van de menselijke ontwikkeling en ziekte. Efficiënte Differentiatie van hPSCs richting Glucose-responsieve β-achtige cellen Recente vooruitgang in HPSC pancreas differentiatie heeft het mogelijk gemaakt de ontwikkeling van protocollen die nauw recapituleren alvleesklier embryonale ontwikkeling. Ongedifferentieerde hPSCs eerst onderverdeeld in de definitieve endoderm, vervolgens in Pdx1 + vroege pancreatische voorlopercellen (PP1) en Pdx1 + + Nkx6.1 later pancreatische progenitorcellen (PP2) en tenslotte in glucose reagerende β-achtige cellen 16, 17, 19, 20 , 23, 24. deze protocolen werden verder geoptimaliseerd betrouwbaar genereren Pdx1 + + Nkx6.1 alvleesklier progenitoren en glucose reagerende β-achtige cellen 9. Figuur 4A toont de gedetailleerde chemische supplementen gebruikt in elke fase van differentiatie. Meestal, ~ 80% confluentie 2 dagen na de aanvankelijke cel beplating is ideaal voor het starten van de differentiatie van HUES8 hPSCs (figuur 4B). Het testen van verschillende seeding dichtheden wordt sterk aangeraden om de geoptimaliseerde voorwaarde voor elke specifieke cellijn te ontdekken. Gewoonlijk ten minste 75% FOXA2 + Sox17 + cellen op het voorste fase en 40% Pdx1 + Nkx6.1 + cellen op het PP2 stadium kan worden bereikt (figuur 4C). Voor deze S5 stadium, de aanwezigheid van een aura-achtige vorm rond de cel aggregaat is een indicator voor de goede overleving van de cellen, wat belangrijk is voor verdere differentiatie Nkx6.1 CPEP + + glucose reagerende β-achtige cellen (Figuur 4D ). Dit protocol is nuttig voor het bestuderen van humane pancreatische d<html> evelopment en ziekte in een schotel. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig1.jpg" /> Figuur 1. HPSC chemisch gedefinieerde en Feeder-vrij Onderhoud en Cultuur Aanpassing van iMEF Voeders. (A) Representatieve beelden van hPSCs gekweekt op iMEF feeder of op VTN op dag 4, klaar om te worden gesplitst. (B) Typisch morfologie van hPSCs tijdens de eerste passage van de aanpassing in de feeder-vrije cultuur van een iMEF feeder. Dag 4 hPSCs gekweekt op iMEF feeders werden gesplitst en uitgeplaat op VTN-gecoate platen in chemisch gedefinieerd medium met ROCK-remmer. De splitsingsverhouding was hetzelfde als de gebruikelijke splitsverhouding voor het kweken in iMEF feeder omstandigheden. Het medium werd elke dag veranderd zonder ROCK inhibitor. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <html> ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig2.jpg" /> Figuur 2. Genereren van iCas9 HPSC Lines. (A) Targeting strategie voor het genereren van iCas9 HPSC lijnen. Puro-Cas9 donor en Neo-M2rtTA donor waren gericht op de humane locus AAVS1 door een paar AAVS1 talens. (B) Schema&#39;s van het hele proces van targeting, waaronder elektroporatie, antibiotische selectie, kolonie plukken en expansie, en cellijn karakteriseren. (C) Representatieve eencellige kloon klaar om te worden opgehaald bij ongeveer 10 - 12 dagen na elektroporatie. (D) Southern blot voorbeelden voor het identificeren van correct gerichte klonen zonder extra integratie van twee donorplasmiden. Correcte klonen zijn rood gemarkeerd. (A) en (D) zijn overgenomen van referentie 5, met toestemming.ig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig3.jpg" /> Figuur 3. Efficiënte Genetische Modificatie in hPSCs Met behulp van de iCRISPR System. (A) Schema voor het genereren van gen knockout mutanten of nauwkeurigere genmodifcatie met het iCRISPR systeem. (B) Targeting procedure en de klonale lijn vestiging. (C) Gene knockout efficiëntie door NHEJ in hPSCs 9. (D) Het ontwerpen van een ssDNA met een specifieke nucleotide modificatie. P, in het rood: de patiënt-specifieke mutatie; X, in het groen: stille mutatie. (E) Efficiëntie van de HDR-gemedieerde precieze nucleotide modificatie. Een nauwkeurige R456C mutatie (veroorzaakt door een specifieke nucleotide C&gt; T-mutatie) in GATA6 locus werd opgenomen waarbij het iCRISPR systeem.(Zie Referentie 5 voor meer informatie). (C) en (E) zijn overgenomen van respectievelijk Referentie 9 en referentie 5, met machtigingen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig4.jpg" /> Figuur 4. Directed HPSC Differentiatie in glucose-responsief pancreas β-achtige cellen. (A) Schema van de gedetailleerde differentiatie protocol, aangevuld met chemicaliën in elk stadium van differentiatie. Signaalwegen die worden geactiveerd of geremd tijdens differentiatie zijn gemarkeerd in groen of rood, respectievelijk. CHIR: GSK3 remmer; GDF8: groei differentiatie factor 8 of myostatine, een TGF-beta eiwit familielid; HH: Egel; DE: Definitieve endoderm; PP1:Pdx1 + vroege pancreas voorlopercellen; PP2: Pdx1 + Nkx6.1 + later pancreas voorlopercellen. (B) Typisch confluentie (70-80%) van hPSCs 48 uur na het zaaien als je klaar bent voor differentiatie initiatie. (C) Representatieve immunofluorescentiekleuring beelden die de succesvolle differentiatie in de definitieve endoderm (DE) fase (FOXA2 en Sox17 co-kleuring), pancreatische voorlopercellen fase (PP2: Pdx1 en Nkx6.1 co-kleuring) en glucose reagerende β- zoals mobiele fase (Nkx6.1 en C-peptide co-kleuring). In het algemeen meer dan 10% Nkx6.1 + CPEP + cellen bereiken de β-achtige cellig stadium, ten minste 75% FOXA2 + Sox17 DE + cellen en 40% Pdx1 + + Nkx6.1 PP2 cellen moeten op de overeenkomstige fasen. (D) Typisch morfologie van een cel aggregaat in de S5 stadium op een insert filter membraan in de lucht-vloeistof-interface cultuur. De overlevende cellen zijn gemigreerd naar het midden van het aggregaat (donker) en liet een aura structuur aan de rand. (A </strong&gt;) en (D) werden overgenomen van Reference 9 met toestemmingen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> plasmide </td><td> Bedrag </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-L </td><td> 5 ug </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-R </td><td> 5 ug </td></tr><tr><td> AAVS1-Puro-iCas9 </td><td> 40 ug </td></tr><tr><td> AAVS1-Neo-M2rtTA </td><td> 40 ug </td></tr></tbody></table> tafel 1 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> grondverf </td><td> Volgorde </td></tr><tr><td>T7F </td><td> TAATACGACTCACTATAGGG </td></tr><tr><td> TracrR </td><td> AAAAGCACCGACTCGGTGCC </td></tr></tbody></table> tafel 2 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> bestanddeel </td><td> Bedrag </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 35,5 pl </td></tr><tr><td> 5x PCR reactiebuffer </td><td> 10 pi </td></tr><tr><td> dNTP mix (25 mM) </td><td> 0,5 pl </td></tr><tr><td> T7F (10 uM) </td><td> 1,25 pi </td></tr><tr><td> TracrR (10 uM) </td><td> 1,25 pi </td></tr><tr><td> T7-gRNA IVT template (250 nm) </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> DNA polymerase </td><td> 0,5 pl </td></tr><tr><td> Totaal PCR-mix </td><td> 50 ul </td></tr></tbody&gt; </table> tabel 3 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4"> PCR fietsen voorwaarden </td></tr><tr><td> cyclus nummer </td><td> denatureren </td><td> temperen </td><td> Uitbreiden </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 94 ºC, 2 min </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 31/02 </td><td> 94 ºC, 20 s </td><td> 60 ºC, 20 s </td><td> 72 ºC, 1 min </td></tr><tr><td> 32 </td><td></td><td></td><td> 72 ºC, 2 min </td></tr></tbody></table> tabel 4 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> bestanddeel </td><td><strong&gt; Bedrag </td></tr><tr><td> T7 ATP </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> T7 CTP </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> T7 GTP </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> T7 UTP </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> T7 10x buffer </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> T7 enzymmengsel </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> PCR geamplificeerd template </td><td> 8 pi </td></tr><tr><td> Total in vitro gRNA transcriptie mix </td><td> 20 gl </td></tr><tr><td> Incubeer bij 37 ° C gedurende 6 uur &#39;s nachts </td><td></td></tr></tbody></table> tabel 5 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> bestanddeel </td><td> Bedrag (pl) </td></tr><tr><td> Ongezuiverde PCR Product </td><td> 8 </td></tr&gt; <tr><td> Buffer 2 10x </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Gedestilleerd water (dH 2 O) </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> tabel 6 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> DNA denaturatie en hybridisatie fietsen omstandigheden </td></tr><tr><td> Temperatuur </td><td> Looptijd </td><td> thermocycler omstandigheden </td></tr><tr><td> 95 ° C </td><td> 10 minuten </td><td></td></tr><tr><td> 85 ° C </td><td> 1 minuut </td><td> Geleidelijk naar 85 ° C bij 2 ° C / s </td></tr><tr><td> 75 ° C </td><td> 1 minuut </td><td> Geleidelijk naar 75 ° C bij 0,3 ° C / s </td></tr><tr><td> 65 ° C </td><td> 1 minuut </td><td> Geleidelijk naar 65 ° C bij 0,3 ° C / s </td></tr><tr><td> 55 ° C &lt;/ Td&gt; <td> 1 minuut </td><td> Geleidelijk naar 55 ° C bij 0,3 ° C / s </td></tr><tr><td> 45 ° C </td><td> 1 minuut </td><td> Geleidelijk naar 45 ° C bij 0,3 ° C / s </td></tr><tr><td> 35 ° C </td><td> 1 minuut </td><td> Geleidelijk naar 35 ° C bij 0,3 ° C / s </td></tr><tr><td> 25 ° C </td><td> 1 minuut </td><td> Geleidelijk naar 25 ° C bij 0,3 ° C / s </td></tr><tr><td> 4 ° C </td><td> Houden </td><td></td></tr></tbody></table> tabel 7 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stadium </td><td> Dag </td><td> Media </td><td> Supplement </td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"> S1 </td><td> d0 </td><td> S1 </td><td> GDF8 100 ng / mL </td><td> CHIR-99021 3 uM </td></tr><tr><td> d1 </td><td> S1 </td><td> GDF8 100 ng / mL </td><td> CHIR-99021 0,3 uM </td></tr><tr><td> d2 </td><td> S1 </td><td> GDF8 100 ng / mL </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> S1 media: MCDB 131 + 1x L-glutamine supplement + 0,5% BSA + 1,5 g / l NaHCO3 + 10 mM Glucose </td></tr></tbody></table> tabel 8 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stadium </td><td> Dag </td><td> Media </td><td colspan="8"> Supplement </td></tr><tr><td> S2 </td><td> d3-d4 </td><td> S1 </td><td> LAA 0,25 mM </td><td> FGF7 50 ng / mL </td><td> IWP-2 2,5 uM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td&gt; S3 </td><td> d5-d6 </td><td> S3 </td><td> LAA 0,25 mM </td><td> FGF7 50 ng / mL </td><td> SANT-1 0,25 uM </td><td> RA 1 uM </td><td> LDN 100 nM </td><td> TPB 200 nM </td><td> ITS-X 1: 200 </td><td></td></tr><tr><td> S4 </td><td> d7-d9 </td><td> S3 </td><td> LAA 0,25 mM </td><td> FGF7 2 ng / mL </td><td> SANT-1 0,25 uM </td><td> RA 0,1 uM </td><td> LDN 200 nM </td><td> TPB 100 nM </td><td> ITS-X 1: 200 </td><td> IWP-2 2,5 uM </td></tr><tr><td colspan="11"> S3 media: MCDB 131 + 1x L-glutamine supplement + 2% BSA + 2,5 g / l NaHCO3 + 10 mM Glucose </td></tr></tbody></table> tabel 9 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Stadium </td><td> Dag </td><td> Media </td><td colspan="8"> Supplement </td></tr><tr><td> S5 </td><td> d10-d12 </td><td> S5 </td><td> T3 1 uM </td><td> ALK5i II 10 uM </td><td> SANT-1 0,25 uM </td><td> RA 0,05 uM </td><td> LDN 100 nM </td><td> ITS-X 1: 200 </td><td> ZnSO4 10 uM </td><td> Heparine 10 ug / mL </td></tr><tr><td> S6 </td><td> D13 d19 </td><td> S5 </td><td> T3 1 uM </td><td> ALK5i II 10 uM </td><td> GSiXX 100 nM </td><td></td><td> LDN 100 nM </td><td> ITS-X 1: 200 </td><td> ZnSO4 10 uM </td><td> Heparine 10 ug / mL </td></tr><tr><td> S7 </td><td> d20- d33 </td><td> S5 </td><td> T3 1 uM </td><td> ALK5i II 10 uM </td><td> N-Cys 1mM </td><td> Trolox 10 uM </td><td> R428 2 uM </td&gt; <td> ITS-X 1: 200 </td><td> ZnSO4 10 uM </td><td> Heparine 10 ug / mL </td></tr><tr><td colspan="11"> S5 media: Blar + 1x L-glutamine supplement + 2% BSA + 1,5 g / l NaHCO3 + 20 mM Glucose </td></tr></tbody></table> tabel 10

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development at JoVE.com

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Protocollen bij HPSC mutant lijnen met behulp van de iCRISPR platform te genereren en om hPSCs in glucose-responsief β-achtige cellen te onderscheiden zijn beschreven. De combinatie van genoom editing-technologie met HPSC gerichte differentiatie biedt een krachtig platform voor de systematische analyse van de rol van de lijn determinanten in de menselijke ontwikkeling en de progressie van de ziekte.

Genoom bewerken en Directed Differentiatie van hPSCs voor ondervragen Lineage Determinanten in Human eilandjes Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Research

JoVE Journal

Genetics

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection van CRISPR/Cas9 eiwit in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embryo's voor Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Bepalen van genoom-brede Transcript verval tarieven in delende en zwakke menselijke fibroblasten

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Next-generation Sequencing en Bioinformatics pijpleiding om te evalueren van genetische determinanten van constitutionele ziekte gericht

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene bewerken te maken voorwaardelijke mutanten van menselijke malariaparasiet P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-gemedieerde genoom uitgeven van het menselijke schimmel pathogeen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genoom bewerken in zoogdieren cellijnen met behulp van CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transformeren, genoom bewerking en Fenotyping de stikstoffixatie tropische Cannabaceae boom Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Karakterisering van in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door RNA-Seq Analyse

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...