Name: genome editing and directed differentiation of hpscs for interrogating lineage determinants in human pancreatic development
Uploaded: 2017-03-05T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development at JoVE.com

Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH / NIDDK (R01DK096239) und New York State Stem Cell Science (NYSTEM C029156) gefördert. ZZ wurde von der NYSTEM Postdoc-Stipendium aus dem Zentrum für Stammzellbiologie des Sloan Kettering Institute unterstützt.

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li><li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells.">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li><li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells.">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11 (7), 514-518 (2001).</li><li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases.">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li><li>Gonz&#225;lez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iCRISPR+Platform+for+Rapid,+Multiplexable,+and+Inducible+Genome+Editing+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 215-226 (2014).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells.">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5 (5), 389-392 (2008).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+of+Lineage+Determinants+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Reveals+Mechanisms+of+Pancreatic+Development+and+Diabetes.">Genome Editing of Lineage Determinants in Human Pluripotent Stem Cells Reveals Mechanisms of Pancreatic Development and Diabetes.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 755-768 (2016).</li><li>Kotini, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+chromosomal+deletion+associated+with+myelodysplastic+syndromes+using+isogenic+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).</li><li>Carlson-Stevermer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Analysis+of+CRISPR-Cas9+Gene-Edited+Human+Embryonic+Stem+Cells.">High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 109-120 (2016).</li><li>Zhu, Z., Verma, N., Gonzalez, F., Shi, Z. D., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas-Mediated+Selection-free+Knockin+Strategy+in+Human+Embryonic+Stem+Cells.">A CRISPR/Cas-Mediated Selection-free Knockin Strategy in Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1103-1111 (2015).</li><li>Mandegar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+Interference+Efficiently+Induces+Specific+and+Reversible+Gene+Silencing+in+Human+iPSCs.">CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+functional+glucagon-secreting+alpha-cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells.</a> Diabetes. 60 (1), 239-247 (2011).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+that+directs+differentiation+of+human+ESCs+into+the+pancreatic+lineage.">A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage.</a> Nat Chem Biol. 5 (4), 258-265 (2009).</li><li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+NKX6-1++pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li><li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro.">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO J. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li><li>Zhu, Z., Gonzalez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods Enzymol. 546, 215-250 (2014).</li><li>Soh, C. L., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Mediated+Mutagenesis+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+Defined+Xeno-Free+E8+Medium.">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium.</a> Methods in Molecular Biology. 1498, (2017).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li><li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 750-756 (2011).</li><li>Musunuru, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+pluripotent+stem+cells+to+generate+human+cellular+disease+models.">Genome editing of human pluripotent stem cells to generate human cellular disease models.</a> Dis Model Mech. 6 (4), 896-904 (2013).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+alpha1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+genome+editing+using+ssDNA+oligonucleotides+with+zinc-finger+nucleases.">High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases.</a> Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).</li><li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+incidence+of+off-target+mutations+in+individual+CRISPR-Cas9+and+TALEN+targeted+human+stem+cell+clones+detected+by+whole-genome+sequencing.">Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Gene-Corrected+Adult+Beta+Globin+Protein+in+Human+Erythrocytes+Differentiated+from+Patient+iPSCs+After+Genome+Editing+of+the+Sickle+Point+Mutation.">Production of Gene-Corrected Adult Beta Globin Protein in Human Erythrocytes Differentiated from Patient iPSCs After Genome Editing of the Sickle Point Mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Shi, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+hPSCs+Reveals+GATA6+Haploinsufficiency+and+a+Genetic+Interaction+with+GATA4+in+Human+Pancreatic+Development.">Genome Editing in hPSCs Reveals GATA6 Haploinsufficiency and a Genetic Interaction with GATA4 in Human Pancreatic Development.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Zeit Überlegungen zur Erzeugung von Mutantenlinien Obwohl die jüngsten Ansätze auf Basis von CRISPR / Cas-Systeme für die Genom Bearbeitung zur erfolgreichen Ausrichtung geführt haben, ein wirksamer und universelle Plattform würde für größere Analysen von Genfunktionen vorzuziehen. Die iCRISPR Plattform bietet eine schnelle und effiziente Methode Mutationen zu jedem Gen von Interesse 5, 9 einzuführen. Erstens erlaubt die PCR-basierte gRNA Syntheseverfahren die Herstellung von Hunderten von gRNAs in Array-Format an einem Tag ohne die zeitraubende Klonierungsschritte. Zweitens mit Doxycyclin-induzierbaren Expression in Cas9 iCas9 hPSCs erfordert der Schritt, der eine gRNA Transfektion nur eine minimale Menge an Arbeit, und somit können mehrere gRNA Targeting-Experimente gleichzeitig durchgeführt werden. Drittens, aufgrund der hohen Wirkungsgrade erreichbar Targeting mit unserem System die Analyse von ~ 24 bis 48 Kolonien pro gRNA sollte transfiziert ausr seiniziente mehrere monoallelic und biallelic Mutantenlinien für ein einzelnes Gen zu schaffen, obwohl die Effizienz auf dem Zielort variieren. Da es mechanisch für eine ausgebildete Person möglich ist, zu 384 Kolonien Pick (4 x 96-Well-Platten) in einer Sitzung, die sollte nehmen ~ 4 h unter einem Binokular kann eine ausgebildete Person zu erwarten Mutantenlinien zu erzeugen, innerhalb beeinflussen 12 Gene 12 Monate. Die schlanke Generation von HPSC Mutanten in kurzer Zeit ermöglicht die systematische Analyse einer Reihe von Transkriptionsfaktoren und / oder Signalwegs - Komponenten , die miteinander in Wechselwirkung treten, den Entwicklungsprozess regulieren 9. Zusätzlich öffnet effiziente Multiplex-Gen-Targeting auch die Tür genetischen Interaktionen zugrunde liegenden komplexen menschlichen Eigenschaften zu untersuchen. Die Erzeugung von Precise Genveränderungen Die Ableitung von patientenspezifischen iPS-Zellen aus leicht zugänglichen somatischen Zelltyp<html> s und die Differenzierung in krankheitsrelevanten Zelltypen bieten eine große Chance für die funktionale Validierung von krankheitsassoziierten Mutationen. Aufgrund der beträchtlichen Variabilität der genetischen Hintergrund zwischen Individuen, direkte Vergleiche zwischen iPSCs von Patienten und von gesunden Spendern kann nicht zulassen, dass eine Krankheit Phänotypen von Hintergrundeffekten zu unterscheiden. Daher ist es notwendig , durch eine Korrektur der Krankheitsmutation zurück in die Wildtyp - Sequenz isogenen Kontrolle iPSCs zu erzeugen oder die Patienten-spezifischen Mutationen in einem Wildtyp HPSC Hintergrund vorstellen, wie 26 andere 25, vorgeschlagen. Neben loss-of-function (null) Mutationen, kann man nun genauer Krankheitsmechanismen durch die Einführung eines Patienten-spezifischen Sequenzveränderungen in den endogenen Lokus in hPSCs einschließlich hypermorphic, hypomorphen, neomorphe oder dominant-negative Patienten sezieren Mutationen. ntent &quot;&gt; Precise genetische Modifikation HDR beschäftigt für DSB-Reparatur in Gegenwart eines Reparaturschablone. Da es viel weniger effizient als NHEJ-vermittelter DNA-Reparatur ist ein Donorplasmid die patientenspezifische Mutation, eine Arzneimittelselektionskassette, und Homologiearme enthalten, zuvor wurde als Reparaturschablone 2 verwendet. nach der Medikamentenauswahl und Überprüfung der patientenspezifischen Mutation in einem zweiten Schritt wird im allgemeinen benötigt , um die Arzneimittelselektionskassette zu entfernen. Während das am häufigsten verwendete Cre-loxP und FLP-FRT - Systeme hinterlassen Restsequenz in den endogenen Lokus, die Verwendung von piggyBac Transposon wurde zur nahtlosen Entfernung der Arzneimittelselektionskassette erlaubt 27. in neuerer Zeit haben kurze ssDNA templates auch effizient HDR zu unterstützen mit technisch DNA - Endonukleasen 28 gezeigt. im Vergleich zu einem Donorplasmid können ssDNA direkt synthetisiert werden und umgeht so die zeitraub Klonierungsschritt. Hier hat es sein,dass de gezeigt durch Cotransfektion gRNA und eine ssDNA Vorlage Homologie gerichtete Reparatur zu induzieren, können iCRISPR verwendet werden, um spezifische Nukleotidmodifikationen mit hoher Effizienz einzuführen. Dies ist wichtig, nicht nur für die Rolle der essentiellen Nukleotide innerhalb Protein funktionellen Domänen sezieren, aber auch menschliche Krankheit Mutationen zur Modellierung und möglicherweise diese krankheitsassoziierten Mutationen für die therapeutische Intervention zu korrigieren. Aufgrund der großen Anzahl von Suszeptibilitätsloci, die jeweils mit mehreren Sequenzvarianten sind, komplex und multigene Krankheiten wie Diabetes Modellierung ist eine Herausforderung für Genetiker gewesen. Da die iCRISPR Plattform für die schnelle Erzeugung einer allelischen Serie oder für Gen-Targeting multiplex permissive ist, kann es die Untersuchung mehrerer krankheitsassoziierter loci erleichtern entweder einzeln oder in Kombination mit isogenen Hintergründen. Targeting Effizienzen und Off-Target-Effekte Wir haben<html> eine gute Korrelation zwischen dem T7E1 und RFLP Untersuchungsergebnisse und der Anzahl der Mutantenlinien gefunden durch Sequenzierung identifiziert. Dies unterstreicht die Bedeutung dieser Tests parallel mit der Einrichtung von klonalen Linien durchführen. Während die Zielwirkungsgrade in Abhängigkeit von der genomischen Loci variieren kann erreicht werden , in den meisten Ein-Gen-Targeting - Experimente, 20-60% der Klone mit beide Allele mutiert gefunden wurden (einschließlich in-frame und Rasterverschiebungsmutationen) 9. In Fällen , in denen Multiplex - Gen - Targeting durchgeführt wurde, Dreier- biallelic mutierten Klone mit 5-10% Wirkungsgrad wurden 5 erhalten. ssDNA-vermittelte HDR mehrerer Gene wurden auch genaue genetische Veränderungen durchgeführt zu erhalten, mit der Effizienz des Erhaltens homozygote Knock-in - Klone im Bereich von 1 5 - 10%. Arbeiten mit CRISPR / Cas in hPSCs, alle Mutationen in potenziellen Off-Target-Sites, die sind noch nicht die gleiche gRNA Zielsequenz teilen zu erfasselass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 9, 12. Whole-Genom - Sequenzierung in einer kürzlich durchgeführte Studie hat es versäumt , auch erhebliche Off-Target - Mutationen in klonalen HPSC Linien zu identifizieren , erzeugt unter Verwendung von CRISPR / Cas 29. Trotzdem jede mögliche Wirkung von Verwechselung Phänotypen durch Mutationen an Off-Target-Effekt Stellen eingeführt zu minimieren, wird vorgeschlagen, mindestens zwei unabhängige gRNAs Targeting verschiedenen Sequenzen innerhalb des gleichen Gens unter Verwendung unabhängiger Mutantenlinien zu erzeugen. Ähnlich wie in mehreren Linien beobachteten Phänotypen erzeugt unterschiedliche gRNAs mit könnte die Möglichkeit ausschließen, vor allem, dass der Phänotyp von einem Off-Target-Effekt kommt. Feeder-abhängige gegen unabhängige Kultur und Targeting Herkömmliche Methoden zur HPSC Kultur beinhalten ihre Wartung und Erweiterung auf Feeder-Zellen in Medien, die Serum oder Serumersatz, der tierische prod enthältdukten, wie Rinderserumalbumin. Feeder-Zellen, Serum, Serum-Ersatz, und alle Albumin enthalten komplexe, nicht definierten Komponenten und zeigen erhebliche Chargenvariabilität. Die Anpassung an die Feederfrei und chemisch definierten Zustand erheblich reduziert den Aufwand für die HPSC Wartung und, was noch wichtiger ist, die Konsistenz der Differenzierungsexperimente erhöht. Derzeit gibt es nur sehr wenige Studien , die Genombearbeitungsverfahren auf hPSCs kultiviert in vollständig definierten Kulturbedingungen 30 beschreiben. Wir haben höhere CRISPR gefunden Effizienzen bei gRNA Transfektion und klonalen Ablagerung Targeting in Feeder freien Bedingungen durchgeführt wurden, im Vergleich zu Feeder-abhängige Kulturbedingungen. Wir glauben, dass dies zu einem erhöhten Überleben der Zelle nach der Transfektion durch und Einzelzellaussaat für die Koloniebildung. Außerdem haben Nährzellen zuvor gezeigt worden, Transfektionsreagenzien zu maskieren, wodurch die Transfektionseffizienz zu senken. VereinigungGenome Editing mit gerichteten Differenzierung Vorherige Differenzierungs Protokolle nur einen geringen Anteil an Insulin-positive Zellen ergab, von denen die meisten waren polyhormonal und ähnelten fötalen endokrinen Zellen 23. Die jüngsten Fortschritte hat die Differenzierung von hPSCs in reiferen auf Glucose reagierenden Beta-ähnlichen Zellen erlaubt 16, 17, 19, 20. Wir können routinemäßig mindestens 75% endgültige Entodermzellen, 40% PDX1 + NKX6.1 + Pankreas - Vorläufern, und rund 20% NKX6.1 + CPEP + Glukose-responsive Beta-ähnliche Zellen erhalten 9 HUES8 hPSCs verwenden. Wenn es mit dem iCRISPR Genom Editing-System kombiniert, das robustere Differenzierung Protokoll hat die Analyse von Transkriptionsfaktoren erleichtert, die auf die Differenzierung Pankreas-Vorläufer und endokrine Stadien der Pankreas entscheidend sind. Dadurch wirdes möglich, in zukünftigen Studien, eine große Anzahl von Kandidatenkrankheitsgene für die funktionelle Überprüfung und Untersuchung der Mechanismen zu untersuchen , die 9 - Diabetes zu Grunde liegen. Zukünftige Anwendungen oder Wegbeschreibungen Unser iCRISPR System die Erzeugung komplexer genomischer Veränderungen, wie zum Beispiel die Schaffung von Reporter - Allele durch HDR-vermittelte Gen - Targeting mit langen Spender - DNA - Matrizen - Codierung Protein - Tags oder fluoreszierenden Reporter können erleichtern 12. Wir haben gezeigt, dass aufgrund des hohen Wirkungsgrade erreicht CRISPR im System Targeting kann dieser Prozess in hPSCs durchgeführt werden, ohne die Notwendigkeit für weitere Wirkstoffselektion 12. Weiterhin kann Targeting gemultiplexten Gen verwendet werden , um genetische Wechselwirkungen zugrunde liegenden komplexen menschlichen Erkrankung zu untersuchen, wie in unserer Studie gezeigt, die wir 31 ist das erste Beispiel für eine solche Arbeit glauben. iCRISPR kann auch durch die Schaffung von Löschungen regulatorischen Kontrolle zu verstehen Gen verwendet werden, entweder in nicht-kodierenden RNAs oder in der Gen-regulatorische Regionen wie Promotoren und Enhancer. Um effizient zu erzeugen regulatorische Mutanten unter Verwendung iCRISPR kann gRNAs werden entwickelt, um die Bindungsstelle eines DNA-bindenden Proteins zu stören, einschließlich, aber nicht auf die basale Transkriptionsmaschinerie oder eines gewebespezifischen Transkriptionsfaktor beschränkt. ssDNA template-vermittelte HDR kann auch zu mutieren spezifische Protein-Bindungsstellen verwendet werden. Schließlich sehen wir , dass eine weitere Optimierung der Nutzung der iCRISPR Plattform in hPSCs für höheren Durchsatz genetische Analysen von Pluripotenz Phänotypen oder Krankheitsphänotypen ermöglichen würde , wenn sie mit einem in vitro Differenzierung Protokoll kombiniert. Diese iCRISPR-vermittelte Studien können für die schnellere Identifizierung von Kandidatenkrankheitsassoziierten Genen und Studien über ihre funktionelle Bedeutung ermöglichen.

Humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) haben die Fähigkeit, sowohl selbst erneuern und verursachen alle Derivate der drei embryonalen Keimlinien. Sie bieten eine wertvolle Ressource für die Zell-Ersatz-Therapie und Krankheitsmodelle, indem sie als einzigartige Plattform dient, zelluläre Prozesse in einem menschlichen Entwicklungskontext zu rekapitulieren. Sie sind auch eine Quelle von Versuchszellen für skalierbare, Hochdurchsatz-Analyse. Jedoch wurden Fortschritte aufgrund von zwei wesentlichen Herausforderungen beschränkt: den Mangel an effizienten genetischen Modifikation Werkzeuge und die Schwierigkeit, in die komplexen embryonalen Entwicklungsschritte in einer Kulturschale zu rekapitulieren. Genetische Veränderung ist ein unverzichtbares Werkzeug Genfunktion in der normalen Entwicklung und Krankheit zu untersuchen. Während jedoch die klassische Gen Ansätze durch homologe Rekombination gezielt bewährt haben ein mächtiges Werkzeug zu sezieren Genfunktion in embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) 1, dieser Ansatz zu seinwar äußerst ineffizient , wenn 3 bis hPSCs 2, angewendet. Die jüngste flotten Beitritt von programmierbaren, ortsspezifische Nukleasen von der Natur zu den Laboreinsatz, einschließlich Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs), Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens) und den Cluster regelmäßig kurze Palindrom Wiederholungen (CRISPR) voneinander beabstandete / CRISPR-assoziierten (Cas) -Systeme 4, bedeutet , dass Genomtechnik eine viel einfachere Aufgabe , in einem breiten Spektrum von Organismen und Zelllinien geworden ist, einschließlich in hPSCs. Diese Gen-Editing-Tools nutzen die Tatsache, dass chimären Nukleasen wie die Cas9 Endonuklease eine ganze Reihe von genetischen Veränderungen durch Induktion Doppelstrangbrüche (DSBs) an genauen Stellen erlauben kann, die Auslösung der endogenen DNA-Reparatur-Maschinen zu aktivieren entweder nicht-homologe Ende Beitritt (NHEJ) oder Homologie gerichtete Reparatur (HDR). Beide Mechanismen können durch Induzieren eith zur genetischen Manipulation ausnutzener zufällige Insertion und Deletionsmutationen (indels; über NHEJ), Frameshift - Mutationen zu erzeugen , die Gen - Allele zunichte machen, oder präzise Nukleotidsubstitutionen (via HDR), Patienten Mutationen für die menschliche Krankheitsmodelle zu rekapitulieren oder eine krankheitsverursachende Mutation für die Gentherapie zu korrigieren . CRISPR / Cas-vermittelte Genomtechnik erfordert zwei Komponenten: die Konstante RNA-gesteuerte Cas9 Endonuklease, die für DNA-Spaltung und einer variablen CRISPR RNA (crRNA) und trans-Aktivierung (tracrRNA) Duplex-DNA, die Zielerkennung angibt. Die crRNA / tracrRNA Duplex kann mit einem einzigen chimären Führung RNA (gRNA) ersetzt werden, die gefunden wurden , effizienter 5, 6, 7 zu arbeiten. Während die CRISPR / Cas9 System hat zu den meisten experimentellen Organismen und Zelllinien angepasst worden ist, ändert sich die Lieferung und die Expression von Cas9 und gRNA signifikant und werden muss, weiter zu Achi optimiertVorabend effiziente Genom Bearbeitung in vielen Systemen, einschließlich hPSCs 8. Eine effiziente Genom-Editing - Plattform, iCRISPR wurde 5 in hPSCs etabliert. In diesem System wird ein TALEN-vermittelte Ansatz verwendet wurde , in trans, ein Allel mit einem Reverse - Tetracyclin-kontrollierten Transaktivator (M2rtTA) und die andere mit einem Tetracyclin - Response - Element beide Allele des &quot;Transgen sicheren Hafen locus&quot; AAVS1 Ziel (TRE ) in den hPSCs die Expression von Cas9 (iCas9) fahren. In etablierten Klonlinien (iCas9 hPSCs) wird Cas9 hoch mit Doxycyclin Behandlung ausgedrückt. Inzwischen aufgrund seiner geringen Größe (100 nt), können einzelne oder mehrere gRNAs leicht in iCas9 hPSCs mit hohem Wirkungsgrad geliefert werden und Cas9 für die ortsspezifische Spaltung anweisen kann, eine effiziente NHEJ-vermittelten Gen-Unterbrechung sowie HDR-vermittelte genaue Nucleotid Modifikationen in Gegenwart von kurzen einsträngigen DNA (ssDNA) Donator-Vorlagen. Das iCRISPR System kannverwendet , um erfolgreich erzeugen eine Gruppe von krankheits nachahmt HPSC Linien mit biallelic (homozygot oder heterozygot) oder heterozygot loss-of-function Mutationen in wichtigen Entwicklungsgene 5, 9. Während eine Anzahl von Gruppen effiziente Gen Bearbeitung unter Verwendung CRISPR / Cas in hPSCs berichtet haben, bleibt der Erfolg auf eine kleine Anzahl von technologisch Adept Laboratorien beschränkt. Die iCRISPR Plattform bietet eine effiziente und dennoch einfache Lösung für Routine - Gen Bearbeitung von Forschern unterschiedlicher Schwierigkeitsstufen, und es wurde bereits in einer Reihe von veröffentlichten Studien von unserer Gruppe und andere 9, 10, 11, 12 verwendet. Dieser Ansatz wurde auch erweitert weiter induzierbaren silencing basierend auf der Expression von dCas9-KRAB 13. Zusammen mit dem Fortschritt in der Genombearbeitung Technologie, haben erhebliche Verbesserungen auch in HPSC Wartung und gerichtet Differenzierung erreicht. Die Kulturbedingungen für hPSCs haben aus bestrahlten embryonalen Maus - Fibroblasten (Imef) Feeder abhängig Feeder freien Bedingungen auf definierte extrazellulären Matrixkomponenten entwickelt und von komplexen Medien Formulierungen chemisch Medium Bedingungen 14 definiert. Derartige Verbesserungen haben die Variabilität in hPSCs aufgrund von Charge zu Charge unterschiedliche Imef Vorbereitung und knockout Serumersatzkomponenten reduziert und somit eine reproduzierbare Umgebung für HPSC Differenzierung bereitzustellen. Inzwischen verbesserte Kenntnis der Signalwege menschlichen embryonalen Entwicklung , die Errichtung sowie Entdeckungen von Hochdurchsatz - Wirkstoffscreenings, haben dazu geführt , zu einer verbesserten Differenzierung Protokolle 15, 16, 17, 18. Diese Protokolle mehr imitieren eng in vivo Entwicklungsschritte und Zelltypen zu erzeugen , die eng ihre in - vivo - Pendants rekapitulieren. Für HPSC Differenzierung in den Pankreas Abstammung, anfängliche Protokolle nachgeahmt frühen Pankreasentwicklung relativ gut, aber schließlich polyhormonal β-Zellen erzeugt, die von unreifen fetalen Phänotypen waren und reagiert schlecht auf die Glukose-Stimulation. Jüngsten Fortschritte 16, 17, 19, 20 sind für die Erzeugung von Glukose-responsive pankreatischen β-ähnlichen Zellen erlaubt, die es uns ermöglichen, spätere Ereignisse zu untersuchen, wie die Bildung und die weitere Reifung von monohormonal β - Zellen. Hier stellen wir detailliert die Anwendung von Genom-modifizierten Zeilen für die Untersuchung der Pankreasentwicklung durch die iCRISPR System kombiniert mit der HPSC basierten in vitro Differenzierung in Richtung Plattform Glukose-responsive pancreatic β-ähnliche Zellen. Diese Kopplung von leistungsfähigen Genom - Editing - Tools mit einer verbesserten HPSC Differenzierung Protokoll bietet nicht nur die Geschwindigkeit und das Ausmaß notwendig , um die wachsende Nachfrage nach Validierung Krankheit Kausalität gerecht zu werden, sondern ermöglicht auch anspruchsvolle genetische Manipulationen für weitere mechanistische Untersuchungen zur Transkriptionskontrolle zugrunde liegenden normalen Entwicklung und Krankheit 9 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="847">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:368px;">Chemically defined medium (E8)</td>
			<td style="width:261px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">A1517001</td>
			<td style="width:87px;">Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Truncated recombinant human form of vitronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563029</td>
			<td>1X, animal origin free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418 Sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10131035</td>
			<td>Geneticin Selective Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td>Puromycin Selective Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA Polymerase (Herculase II Fusion)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600679</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEGAshortscript T7 Transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Reduced Serum Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69504</td>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BLAR medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine supplement (GlutaMAX)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaHCO3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>LAMPIRE Biological Laboratories</td>
			<td>7500855</td>
			<td>Fatty acid free</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GDF8</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CHIR-99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>GSK-3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SANT1</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1974</td>
			<td>Hedgehog inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LDN</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0019</td>
			<td>BMP inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IWP-2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3533</td>
			<td>Wnt antagonist&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ITS-X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TPB</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565740-1MG</td>
			<td>PKC activator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3,3&#8217;,5-Triiodo-L-thyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ALK5i II</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-445</td>
			<td>ALK5 inhibitor II</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZnSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GSiXX</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565789</td>
			<td>Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-Cys (N-acetyl cysteine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trolox</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>648471</td>
			<td>Vitamin E analogue</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">R428</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2841</td>
			<td>AXL receptor tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24mm Transwell with insert</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gene Pulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.4 cm Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-TALEN-L</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-TALEN-R</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-Neo-M2rtTA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-Puro-iCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>58409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0302L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer 2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7002S</td>
			<td>NEBuffer 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Long oligonucleotide</td>
			<td>Eton Bioscience or IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOX17 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1924</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FOXA2 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CXCR4-APC antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170A</td>
			<td>1: 25</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NKX6.1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F55A12</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NKX2.2 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NEUROD1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-1084</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0564</td>
			<td>1: 2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C-peptide antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>GN-ID4-c</td>
			<td>1: 2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucagon antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2654</td>
			<td>1: 1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing and directed differentiation of hpscs for interrogating lineage determinants in human pancreatic development

Abfrage Genfunktion in sich selbst erneuernden oder humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) Differenzierung bietet eine wertvolle Plattform in Richtung der menschlichen Entwicklung zu verstehen und Mechanismen Krankheit in einer Schale zu sezieren. Um dieses Potenzial Anwendung nutzen erfordert effiziente Genom-Editing - Tools HPSC Mutanten in krankheitsassoziierten Genen, sowie in - vitro - HPSC Differenzierung Protokolle krankheitsrelevanten Zelltypen produzieren , die eng rekapitulieren ihre in - vivo - Pendants zu erzeugen. Eine effiziente Genom-Editing - Plattform für hPSCs namens iCRISPR wurde durch die TALEN-vermittelte Targeting einer Cas9 Expressionskassette im AAVS1 Locus entwickelt. Hierbei sind die Protokolle für die Erzeugung von induzierbaren Cas9 HPSC Linien Zellen kultiviert in einem chemisch definierten Medium und einem Zubringer freien Zustand verwenden beschrieben. Detaillierte Verfahren für die Verwendung des iCRISPR System für Gen-Knockout oder präzise genetische Veränderungen in hPSCs, entweder durch nauf homologe Ende (NHEJ) oder über präzise Nukleotidveränderungen Verbinden einer Homologie gerichteten Reparatur (HDR) Vorlage jeweils enthalten sind. Diese technischen Verfahren sind Beschreibungen der Konstruktion, Produktion, und die Transfektion von CRISPR Führung RNAs (gRNAs); die Messung der Geschwindigkeit CRISPR Mutation durch T7E1 oder RFLP-Tests; und die Etablierung und Validierung von klonalen Mutantenlinien. Schließlich haben wir Chronik Verfahren zur HPSC Differenzierung in Glukose-responsive Pankreas - β-ähnliche Zellen durch in - vivo - Pankreas - Embryonalentwicklung nachahmt. iCRISPR Technologie mit gerichtetem HPSC Differenzierung Kombination ermöglicht die systematische Untersuchung von Genfunktionen unser Verständnis von Pankreas-Entwicklung und Diabetes Krankheitsmechanismen zu fördern.

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development at JoVE.com

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Protokolle HPSC Mutantenlinien mit der iCRISPR Plattform und zu differenzieren hPSCs in Glukose-responsive β-ähnlichen Zellen beschrieben zu erzeugen. Genom Bearbeitungstechnologie mit HPSC gerichtete Differenzierung Die Kombination bietet eine leistungsfähige Plattform für die systematische Analyse der Rolle von Lineage Determinanten in der menschlichen Entwicklung und Progression der Erkrankung.

Genome Editing und gerichteten Differenzierung von hPSCs zur Abfrage Lineage Bestimmungsfaktoren im Bereich Human Pancreatic Entwicklung

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Research

JoVE Journal

Genetics

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Forschung

Genetik

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Mikroinjektion CRISPR/Cas9 Protein in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus, Embryonen für Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Bestimmung genomweite Transkript Verfall Tarife im wuchernden und ruhenden menschlichen Fibroblasten

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation und Bioinformatik-Pipeline, um genetische Determinanten der konstitutionelle Krankheit zu bewerten

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-vermittelten Genom-Bearbeitung von menschlichen pilzliche Erreger Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genom-Bearbeitung in Säugetieren Zelllinien mit CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, GenomEditing und Phenotypisierung der Stickstoff-fixierenden tropischen Cannabaceae Baum Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Charakterisierung der In-Vitro-Differenzierung menschlicher Primärkeratinozyten durch RNA-Seq-Analyse

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...