Name: genome editing and directed differentiation of hpscs for interrogating lineage determinants in human pancreatic development
Uploaded: 2017-03-05T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development at JoVE.com

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי NIH / NIDDK (R01DK096239) ומדע תאי גזע מדינת ניו יורק (NYSTEM C029156). ZZ נתמכה על ידי מלגת פוסט דוקטורט NYSTEM מהמרכז לביולוגיה תא גזע של המכון קטרינג סלואן.

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li><li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells.">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li><li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells.">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11 (7), 514-518 (2001).</li><li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases.">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li><li>Gonz&#225;lez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iCRISPR+Platform+for+Rapid,+Multiplexable,+and+Inducible+Genome+Editing+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 215-226 (2014).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells.">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5 (5), 389-392 (2008).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+of+Lineage+Determinants+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Reveals+Mechanisms+of+Pancreatic+Development+and+Diabetes.">Genome Editing of Lineage Determinants in Human Pluripotent Stem Cells Reveals Mechanisms of Pancreatic Development and Diabetes.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 755-768 (2016).</li><li>Kotini, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+chromosomal+deletion+associated+with+myelodysplastic+syndromes+using+isogenic+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).</li><li>Carlson-Stevermer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Analysis+of+CRISPR-Cas9+Gene-Edited+Human+Embryonic+Stem+Cells.">High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 109-120 (2016).</li><li>Zhu, Z., Verma, N., Gonzalez, F., Shi, Z. D., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas-Mediated+Selection-free+Knockin+Strategy+in+Human+Embryonic+Stem+Cells.">A CRISPR/Cas-Mediated Selection-free Knockin Strategy in Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1103-1111 (2015).</li><li>Mandegar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+Interference+Efficiently+Induces+Specific+and+Reversible+Gene+Silencing+in+Human+iPSCs.">CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+functional+glucagon-secreting+alpha-cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells.</a> Diabetes. 60 (1), 239-247 (2011).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+that+directs+differentiation+of+human+ESCs+into+the+pancreatic+lineage.">A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage.</a> Nat Chem Biol. 5 (4), 258-265 (2009).</li><li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+NKX6-1++pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li><li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro.">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO J. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li><li>Zhu, Z., Gonzalez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods Enzymol. 546, 215-250 (2014).</li><li>Soh, C. L., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Mediated+Mutagenesis+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+Defined+Xeno-Free+E8+Medium.">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium.</a> Methods in Molecular Biology. 1498, (2017).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li><li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 750-756 (2011).</li><li>Musunuru, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+pluripotent+stem+cells+to+generate+human+cellular+disease+models.">Genome editing of human pluripotent stem cells to generate human cellular disease models.</a> Dis Model Mech. 6 (4), 896-904 (2013).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+alpha1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+genome+editing+using+ssDNA+oligonucleotides+with+zinc-finger+nucleases.">High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases.</a> Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).</li><li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+incidence+of+off-target+mutations+in+individual+CRISPR-Cas9+and+TALEN+targeted+human+stem+cell+clones+detected+by+whole-genome+sequencing.">Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Gene-Corrected+Adult+Beta+Globin+Protein+in+Human+Erythrocytes+Differentiated+from+Patient+iPSCs+After+Genome+Editing+of+the+Sickle+Point+Mutation.">Production of Gene-Corrected Adult Beta Globin Protein in Human Erythrocytes Differentiated from Patient iPSCs After Genome Editing of the Sickle Point Mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Shi, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+hPSCs+Reveals+GATA6+Haploinsufficiency+and+a+Genetic+Interaction+with+GATA4+in+Human+Pancreatic+Development.">Genome Editing in hPSCs Reveals GATA6 Haploinsufficiency and a Genetic Interaction with GATA4 in Human Pancreatic Development.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

שיקולי זמן עבור קווי יצירת Mutant למרות הגישות אחרונות מבוססות על מערכות CRISPR / קאש לעריכה הגנום הובילו מיקוד מוצלח, פלטפורמה יעילה ואוניברסלית יותר תהיה עדיפה בקנה מידה גדולה יותר מנתח של תפקוד גן. פלטפורמת iCRISPR מציעה שיטה מהירה ויעילה להציג מוטציות לכל גן של עניין 5, 9. ראשית, שיטת סינתזת gRNA המבוססת PCR מאפשרת הייצור של מאה gRNAs בפורמט ערוך ביום אחד ללא מדרגות השיבוט גוזל הזמן. שנית, עם ביטוי דוקסיציקלין-מושרה Cas9 ב iCas9 hPSCs, הצעד מעורבים transfection gRNA דורש כמות מינימלית בלבד של עבודה, ולכן מספר gRNA ניסויים מיקוד יכול להתנהל במקביל. שלישית, בשל המיקוד הגבוה יעילות השגה עם המערכת שלנו, הניתוח של ~ 24 - 48 מושבות בכל gRNA transfected צריכות להיות sufficient להקים monoallelic מרובים קווים מוטנטים biallelic עבור גן יחיד, אם כי יעילות משתנות בהתאם מוקד היעד. מאז הוא ריאלי עבור אדם מאומן לקטוף מכאני 384 מושבות (4 x 96-גם צלחות) בבת אחת, אשר אמור לקחת ~ 4 שעות תחת מיקרוסקופ לנתח, אדם מאומן יכול להיות צפוי ליצור קווים מוטנטים המשפיעים 12 גנים בתוך 12 חודשים. הדור היעיל של מוטציות hPSC תוך זמן קצר מאפשר ניתוח השיטתי של מערך של גורמי שעתוק ו / או מרכיבים שונים של מסלול איתות כי אינטראקציה זה עם זה, המסדיר את התהליך התפתחותי 9. כמו כן, כוונת גן מרובב יעילה גם פותחת את הדלת כדי לחקור אינטראקציות גנטיות תכונות אנושיות מורכבות בסיסיות. דור של מדויק גנטי שינויים על גזרה של iPSCs המטופל הספציפי מסוג תאים סומטיים ונגיש<html> ים ואת הבידול לתוך תאים מסוגים רלוונטי מחלות לספק הזדמנות מצוינת עבור האימות הפונקציונלית של מוטציות הקשורות למחלה. עם זאת, בשל ההשתנות הניכרת רקע גנטי בין פרטים, השוואה ישירה בין iPSCs מחול מתורמים בריאים לא יכולה לאפשר אחד כדי להבחין פנוטיפים מחלה מתופעות ברקע. לכן, יש צורך ליצור iPSCs מלא isogenic ידי תיקון מוטצית המחלה חזרתי את רצף wild-type או להציג מוטציות המטופל ספציפי לרקע hPSC wild-type, כפי שהוצע על ידי אחרים 25, 26. בנוסף לאובדן של פונקציה (null) מוטציות, אפשר עכשיו ליתר דיוק לנתח מנגנוני המחלה באמצעות הקדמה של שינויים ברצף המטופל הספציפי לתוך מוקד אנדוגני hPSCs, כולל hypermorphic, hypomorphic, neomorphic, או דומיננטי שלילי החולה מוטציות. ntent &quot;&gt; הנדסה גנטית מדויקת מעסיק HDR לתיקון DSB בנוכחות תבנית תיקון. מאז הוא הרבה פחות יעיל מאשר תיקון DNA בתיווך NHEJ, פלסמיד תורם המכיל את המוטציה החולה ספציפית, קלטת מבחר סמים, נשק הומולוגיה נעשה בה שימוש בעבר כמו תיקון התבנית 2. לאחר בחירת תרופה ואימות של המוטציה החולה ספציפית, בשלב שני יש צורך בדרך כלל להסיר את קלטת מבחר תרופה. בעוד המערכות הנפוצות ביותר Cre-loxP ו FLP-FRT להשאיר מאחור רצף שייר לוקוס אנדוגני, שימוש transposon piggyBac אפשר להסרת החלקה של הקלטת סמי בחירת 27. לאחרונה, תבניות ssDNA קצרות יש גם הוכחו לתמוך HDR היעילה עם endonucleases DNA המהונדס 28. לעומת פלסמיד התורם יכול להיות מסונתז, ssDNA ישירות ובכך עוקף את הצעד שיבוט זמן רב. הנה, יש לו להיותen הראה כי, על ידי שיתוף transfecting gRNA ואת תבנית ssDNA להשרות תיקון מכוון הומולוגיה, ניתן להשתמש iCRISPR להציג שינויים נוקלאוטיד ספציפיים עם יעילות גבוהה. זה קריטי לא רק לנתח את התפקיד של נוקלאוטידים חיוניים בתוך תחומי חלבון פונקציונליים, אלא גם ביצירת דגמי מוטציות מחל אנושיות ואפשרות לתקן מוטציות מחלה הקשורים אלה להתערבות טיפולית. בשל המספר הגדול של לוקוסים רגישים, שבכל אחד מהם קשורים גרסות רצף נפוצות, דוגמנות היא מחלה מורכבת, multigenic כגון סוכרת כבר אתגר עבור גנטיקאים. כפלטפורמת iCRISPR היא מתירני עבור הדור המהיר של סדרת אללים או מיקוד גן multiplexable, זה יכול להקל על החקירה של הלוקוסים מרובים הקשורים למחלות, בנפרד או בשילוב עם רקע isogenic. מיקוד ויעילות השפעות חוץ-יעד יש לנו<html> מצאו קורלציה טובה בין T7E1 ותוצאות assay RFLP ומספר קווי מוטציה מזוהה על ידי רצף. זה מדגיש את החשיבות של ביצוע מבחנים אלה במקביל להקמת קווי משובטים. בעוד יעילות מיקוד השיגו עשוי להשתנות תלוי לוקוסים הגנומי, ברוב הניסויים חד-גנים מיקוד, 20 - 60% של שיבוטים נמצאו בשתי אללים מוטציה (כולל בתוך מסגרת ומוטציות frameshift) 9. במקרים בם מיקוד גן מרובב בוצע, שיבוטי מוטצית biallelic משולשים עם 5-10 יעילות% התקבלו 5. ssDNA בתיווך HDR של מספר גנים בוצעו גם להשיג שינויים גנטיים מדויקים, עם יעילות של קבלת הומוזיגוטים עקום שיבוטים הנעים בין 1 - 10% 5. עבודה עם CRISPR / קאש ב hPSCs, מוטציות כל באתרים מחוץ היעד פוטנציאליים שאינו חולק רצף היעד אותו gRNA הם עדיין לא זוהתהילדה = &quot;Xref&quot;&gt; 5, 9, 12. רצף Whole-הגנום שבוצע במחקר שנערך לאחרונה גם נכשל לזהות מוטציות מחוץ יעד משמעותיות בקווי hPSC משובטים שנוצר באמצעות CRISPR / קאש 29. אף על פי כן, כדי למזער את השפעה פוטנציאלית של פנוטיפים בלבול הציגו ידי מוטציות באתרי השפעה מחוץ יעד, הוא הציע ליצור קווים מוטנטים עצמאיים באמצעות לפחות שני gRNAs העצמאי מיקוד רצפים שונים בתוך אותו הגן. פנוטיפים דומה נצפה מספר שורות שנוצר באמצעות gRNAs השונה יכול לשלול בעיקר את האפשרות כי הפנוטיפ מגיע השפעה מחוץ היעד. מזין תלוי לעומת תרבות עצמאית ומיקוד שיטות מסורתיות תרבות hPSC דורשות התחזוקה וההרחבה שלהם על תאים מזינים במדיה המכילים סרום או תחליף בסרום הכולל לדרבן בעלי החייםucts, כגון אלבומין בסרום שור. תאים מזינים, סרום, החלפה בסרום, ואלבומין כולם מכילים רכיבים מורכבים, לא מוגדרים ולהראות השתנות יצוו ניכרות. התאמת למצב המזין נטולות הגדרה כימית מפחית באופן משמעותי את המאמצים לצורך תחזוקת hPSC, וחשוב יותר, מעלה את העקביות של ניסויי בידול. נכון לעכשיו, יש מעט מאוד מחקרים המתארים נהלי עריכת הגנום על hPSCs בתרבית בתנאי תרבות המוגדר באופן מלא 30. מצאנו CRISPR גבוה מיקוד יעיל כאשר gRNA transfection בתצהיר משובט בוצעו בתנאים מזינים ללא לעומת תנאי תרבות תלויה מזינות. אנו מאמינים כי הדבר נובע להישרדות התא גדל לאחר transfection וזריעה-תא בודד עבור היווצרות המושבה. יתר על כן, תאי מזין הוכחו בעבר כדי לעקל ריאגנטים transfection, ובכך מפחיתים את יעילות transfection. שילובעריכת הגנום עם בידול בימוי פרוטוקולי בידול קודמים הניבו רק חלק קטן של תאים חיוביים-אינסולין, שרובם היו polyhormonal ודמה 23 תאי האנדוקרינית עובריים. ההתקדמות האחרונה התירה את הבידול של hPSCs לתאי בטא כמו גלוקוז-תגובה בוגר יותר 16, 17, 19, 20. אנחנו יכולים להשיג לפחות 75% מוחלטים endoderm תאים, 40% PDX1 + NKX6.1 + אבות לבלב, וכ -20% NKX6.1 + CPEP + גלוקוז-תגובת בטא דמוית תאים באמצעות HUES8 hPSCs 9 שיגרתי. בשילוב עם מערכת עריכת הגנום iCRISPR, זה פרוטוקול בידול חזק יותר יש להקל את ניתוח גורמי שעתוק כי הם קריטיים בשלבים ובתאים ומערכת האנדוקרינית הלבלב של בידול לבלב. זה יגרוםזה אפשרי, במחקרים עתידיים, כדי לבחון מספר רב של גנים של מחל מועמד האימות והחקירה הפונקציונליות לתוך המנגנונים העומדים בבסיס סוכרת 9. יישומים או כיוונים עתידיים מערכת iCRISPR שלנו עשוי להקל על הדור של שינויים גנומיים מורכבים יותר, כגון יצירת אללים כתב באמצעות HDR בתיווך גן המיקוד באמצעות תגי חלבון קידוד תבניות DNA תורם ארוך או כתבי ניאון 12. הראינו כי, בשל CRISPR גבוהה מיקוד היעילות מושגת במערכת, תהליך זה יכול להתבצע hPSCs, ללא צורך בבחירת חומר נוסף 12. יתר על כן, גן מרובב ניתן להשתמש מיקוד לחקור אינטראקציות גנטיות למחלות אנושיות מורכבות בסיסיות, כפי שמוצג המחקר שנערך לאחרונה שלנו, אשר אנו מאמינים הוא הדוגמא הראשונה של עבודה כזו 31. ICRISPR יכול לשמש גם כדי להבין גן שליטת רגולציה על ידי יצירת מחיקות בין אם RNAs noncoding או בגן אזורים רגולטוריים, כגון יזמים משפרי. כדי ביעילות ליצור מוטציות רגולטוריות באמצעות iCRISPR, gRNAs יכול להיות מתוכנן לשבש את אתר הקישור של חלבון קושר DNA, כולל אך לא מוגבל מכונות תעתיק הבזליים או גורם שעתוק רקמות ספציפיות. תבנית בתיווך HDR ssDNA יכול לשמש גם כדי לעבור מוטציה אתרי חלבון מחייב ספציפית. לבסוף, אנו חוזים כי אופטימיזציה נוספת תאפשר את השימוש של פלטפורמת iCRISPR ב hPSCs עבור אנליזה גנטית תפוקה גבוהה יותר של פנוטיפים pluripotency או פנוטיפים מחלה בשילוב עם פרוטוקול בידול במבחנה. מחקרי iCRISPR בתיווך אלה עשויים לאפשר זיהוי מהיר יותר של גנים של מחלות הקשורות מועמד ומחקרים של הרלוונטיות הפעילות שלהן.

תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) יש את היכולת הוא עצמי לחדש להצמיח כל נגזרות השלוש השושלות הניבטות העובריות. הם מספקים משאב יקר ערך עבור טיפול בתחליפי תא דוגמנות מחלה ידי משמש פלטפורמה ייחודית לשחזר תהליכים תאיים בהקשר התפתחותי אדם. הם גם מקור של תאים הניסיונות עבור ניתוחי מדרגים, תפוקה גבוהה. עם זאת, התקדמות הוגבלה בגלל שני אתגרים מרכזיים: היעדר כלי הנדסה גנטית יעילים הקושי משחזר את הצעדים ההתפתחותיים העובריים המורכבים בצלחת תרבות. הנדסה גנטית היא כלי הכרחי כדי ללמוד לתפקד גנים בפיתוח ומחלות נורמלים. עם זאת, בעוד הגן הקלאסי מיקוד גישות באמצעות רקומבינציה הומולוגיים הוכיחו להיות כלי רב עוצמה כדי לנתח תפקוד הגן בתאי גזע עובריים בעכבר (mESCs) 1, גישה זולא יעיל כבר מאוד כאשר חלים על 2 hPSCs, 3. הצטרפותן הנמרצת האחרונה של nucleases לתכנות, אתר ספציפי מטבע לשימוש במעבדה, כולל nucleases אצבע אבץ (ZFNs), nucleases מפעיל דמוי מפעיל שעתוק (TALENs), ואת חזרות palindromic קצרות interspaced התקבצו באופן קבוע (CRISPR) / CRISPR הקשורים (CAS) מערכות 4, כלומר הנדסה הגנום הפכה משימה הרבה יותר קלה במגוון רחב של אורגניזמים שורות תאים, כולל hPSCs. כלי עריכת גנים אלה לנצל את העובדה nucleases כימרי כגון endonuclease Cas9 יכול להרשות מגוון שלם של שינויים גנטיים על ידי גרימת הפסקות פעמים התקועות (DSBs) במקומות מדויקים, מפעיל את מנגנון תיקון DNA אנדוגני כדי להפעיל או שאינו הומולוגי סוף להצטרף (NHEJ) או תיקון מכוון הומולוגיה (HDR). שני המנגנונים עשויים להיות מנוצלים עבור מניפולציה גנטית על ידי גרימת eithאה כניסה אקראית מוטציות מחיקות (indels; דרך NHEJ), ליצור מוטציות frameshift כי לבטל אללים גנים, או החלפות נוקלאוטיד מדויקות (באמצעות HDR), לשחזר מוטציות המטופל עבור מודלי מחלות אנושיים או לתקן מוטציה הגורמים למחלות עבור ריפוי גנטי . CRISPR / הנדסת הגנום בתיווך קאש דורש שני מרכיבים: endonuclease Cas9 קבוע מודרך-רנ&quot;א הדרושים מחשוף DNA ו RNA CRISPR משתנה (crRNA) והפעלת-טרנס (tracrRNA) דופלקס המציין זיהוי מטרות DNA. הדופלקס crRNA / tracrRNA יכול להיות מוחלף עם RNA מדריך כימרי יחיד (gRNA), אשר נמצאו לעבוד בצורה יעילה יותר 5, 6, 7. בעוד מערכת CRISPR / Cas9 הותאמה אורגניזמים שורות תאים הניסיונות ביותר, המשלוח והביטוי של Cas9 ו gRNA משתנה משמעותי ועליו להיות מותאם יותר כדי אח&quot;יערב עריכת הגנום יעיל במערכות רבות, כולל hPSCs 8. פלטפורמה יעילה עריכת הגנום, iCRISPR, הוקמה בשנת hPSCs 5. במערכת זו, גישה בתיווך Talen נעשה שימוש כדי למקד הן אללים של &quot;מוקד נמל מבטחים transgene&quot; AAVS1 טרנס, אלל אחד עם transactivator טטרציקלין שבשליטת הפוכה (M2rtTA) והשני עם אלמנט בתגובה טטרציקלין (TRE נהיגה) הביטוי של Cas9 (iCas9) ב hPSCs. בשורות משובטות הוקמו (iCas9 hPSCs), Cas9 מבוטא בכמות גבוהה עם טיפול דוקסיציקלין. בינתיים, בשל גודלו הקטן (100 NT), gRNAs בודדת או מרובה ניתן לשלוח בקלות לתוך iCas9 hPSCs עם יעילות גבוהה והוא יכול לכוון Cas9 עבור מחשוף אתר ספציפי, מה שמאפשר שיבוש גנטי NHEJ בתיווך יעיל, כמו גם HDR בתיווך שינויי נוקלאוטיד מדויקים בנוכחות דנ&quot;א חד-גדילים קצרים תבניות תורמות (ssDNA). מערכת iCRISPR יכולה להיותהשתמשו כדי ליצור פאנל של מחלת-מחקה hPSC קווי עם biallelic (הומוזיגוטים או תרכובת הטרוזיגוטיים) או הטרוזיגוטיים הפסד של פונקציה מוטציות בגנים התפתחותי חשוב בהצלחה 5, 9. בעוד מספר קבוצות דיווחו עריכה יעילה של גנים באמצעות CRISPR / קאש ב hPSCs, ההצלחה נותרת מוגבלת למספר קטן של מעבדות מיומנות מבחינה טכנולוגית. פלטפורמת iCRISPR מציעה פתרון יעיל אך פשוט לעריכת גן שיגרתית על ידי חוקרים של רמות מיומנות שונות, וזה כבר נעשה שימוש בכמה מחקרים שפורסמו על ידי הקבוצה שלנו ועוד 9, 10, 11, 12. גישה זו גם הורחבה בהמשך השתקה מושרה מבוסס על הביטוי של dCas9-קראב 13. יחד עם התקדמות הטכנו עריכה-הגנוםמשעממים, שיפורים משמעותיים גם הושגו תחזוקת hPSC והבחנה מכוונת. תנאי תרבות עבור hPSCs התפתחו מעכבר מוקרן פיברובלסטים עובריים (iMEF) מזין תלוי לתנאים מזינים חינם על רכיבים תאים מטריקס מוגדר, ומתוך ניסוחי מדיה מורכבים לתנאים בינוניים הגדרה כימית 14. שיפורים כאלה צמצמו את השתנות hPSCs בשל תצווה ל-תצווה הבדלי רכיבי החלפה בסרום הכנה בנוקאאוט iMEF, ובכך לספק סביבה לשחזור יותר לבידול hPSC. בינתיים, ידע משופר של מסלולי איתות לפיקוח על בנייה עוברית אנושית, כמו גם תגליות מן קרנות תרופת תפוקה גבוהה, הוביל פרוטוקולי בידול משופרים 15, 16, 17, 18. פרוטוקולים אלה לחקות באופן הדוק יותר ב vivo צעדים התפתחותיים וליצור תאים מסוגים כי מקרוב לשחזר עמיתיהם in vivo שלהם. לבידול hPSC לתוך שושלת הלבלב, פרוטוקולים ראשוניים חיקו התפתחות לבלב מוקדם יחסית טוב אבל בסופו של דבר שנוצרה תאי β polyhormonal שהיו של פנוטיפים עובר בשלה ומגיבים בצורה גרועה לגירוי גלוקוז. 16 הפיתוחים האחרונים, 17, 19, 20 אפשרו לדור של תאי β-כמו הלבלב מגיב גלוקוז, אשר יאפשר לנו לחקור אירועים מאוחר יותר, כגון היווצרות ואת התבגרות נוספת של תאי β monohormonal. כאן, אנו בפירוט את היישום של קווים-modified הגנום לחקר התפתחות לבלב על ידי שילוב של מערכת iCRISPR עם פלטפורמת בידול hPSC המבוססת במבחנה לקראת pancr גלוקוז-התגובהתאי β-כמו eatic. צימוד זה של כלי עריכת הגנום חזקים עם פרוטוקול בידול hPSC משופר לא רק מציע את המהירות בהיקף הצורך לענות על הדרישה הגוברת על תיקוף סיבתיות מחלה, אלא גם מאפשר מניפולציות גנטיות מתוחכמות עבור חקירות מכניסטית נוספות לתוך מלא תעתיק שבבסיס התפתחות נורמלית למחלה 9 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="847">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:368px;">Chemically defined medium (E8)</td>
			<td style="width:261px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">A1517001</td>
			<td style="width:87px;">Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Truncated recombinant human form of vitronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563029</td>
			<td>1X, animal origin free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418 Sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10131035</td>
			<td>Geneticin Selective Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td>Puromycin Selective Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA Polymerase (Herculase II Fusion)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600679</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEGAshortscript T7 Transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Reduced Serum Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69504</td>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BLAR medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine supplement (GlutaMAX)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaHCO3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>LAMPIRE Biological Laboratories</td>
			<td>7500855</td>
			<td>Fatty acid free</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GDF8</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CHIR-99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>GSK-3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SANT1</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1974</td>
			<td>Hedgehog inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LDN</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0019</td>
			<td>BMP inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IWP-2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3533</td>
			<td>Wnt antagonist&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ITS-X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TPB</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565740-1MG</td>
			<td>PKC activator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3,3&#8217;,5-Triiodo-L-thyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ALK5i II</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-445</td>
			<td>ALK5 inhibitor II</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZnSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GSiXX</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565789</td>
			<td>Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-Cys (N-acetyl cysteine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trolox</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>648471</td>
			<td>Vitamin E analogue</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">R428</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2841</td>
			<td>AXL receptor tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24mm Transwell with insert</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gene Pulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.4 cm Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-TALEN-L</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-TALEN-R</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-Neo-M2rtTA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-Puro-iCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>58409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0302L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer 2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7002S</td>
			<td>NEBuffer 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Long oligonucleotide</td>
			<td>Eton Bioscience or IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOX17 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1924</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FOXA2 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CXCR4-APC antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170A</td>
			<td>1: 25</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NKX6.1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F55A12</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NKX2.2 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NEUROD1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-1084</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0564</td>
			<td>1: 2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C-peptide antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>GN-ID4-c</td>
			<td>1: 2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucagon antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2654</td>
			<td>1: 1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing and directed differentiation of hpscs for interrogating lineage determinants in human pancreatic development

תפקוד גן חקירה בחידוש עצמי או הבחנת תאי גזע פלוריפוטנטיים אדם (hPSCs) מציע פלטפורמת ערך להבנת התפתחות אנושית לנתח מנגנוני מחלה בצלחת. כדי לנצל פוטנציאל היישום הזה דורש כלי הגנום עריכה יעילה לייצר מוטציות hPSC בגנים הקשורים במחלה, כמו גם פרוטוקולים בידול במבחנה hPSC לייצר תאים מסוגים רלוונטי-מחלה מקרוב לשחזר עמיתיהם in vivo שלהם. פלטפורמת הגנום עריכה יעילה עבור hPSCs בשם iCRISPR פותחה באמצעות מיקוד בתיווך Talen של קלטת ביטוי Cas9 שעבר על מקורות AAVS1. הנה, הפרוטוקולים עבור הדור של מושרת קווי Cas9 hPSC באמצעות תאים בתרבית בינוני הגדרה כימית ותנאי מזין ללא מתוארים. נהלים מפורטים עבור השימוש במערכת iCRISPR עבור נוקאאוט גנטי או שינויים גנטיים מדויקים hPSCs, בין אם באמצעות nהצטרפותו סוף על-הומולוגי (NHEJ) או באמצעות שינויי נוקלאוטיד מדויקים באמצעות תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) בתבנית, בהתאמה, כלולים. נהלים טכניים אלה כוללים תיאורים של עיצוב, ייצור, transfection של RNAs מדריך CRISPR (gRNAs); מדידת שיעור המוטציות CRISPR ידי מבחני T7E1 או RFLP; וההקמה ותיקוף קווים מוטנטים משובטים. לבסוף, אנו נהלים כרוניקה לבידול hPSC לתאי β-כמו לבלב גלוקוז-תגובה על ידי חיקוי ב התפתחות עוברית לבלב vivo. שילוב של טכנולוגית iCRISPR עם בידול hPSC מכוונת מאפשרת בחינה שיטתית של תפקוד הגן כדי לקדם את ההבנה שלנו של מנגנוני המחלה סוכרת התפתחות הלבלב.

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development at JoVE.com

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

פרוטוקולים כדי ליצור קווים מוטנטים hPSC באמצעות פלטפורמת iCRISPR וכדי לבדל hPSCs לתאי β-כמו גלוקוז-תגובה מתוארת. שילוב של טכנולוגית עריכת הגנום עם בידול מכוון hPSC מספק פלטפורמה חזקה עבור הניתוח השיטתי של תפקיד גורמי שושלת בהתפתחות אנושית והתקדמות מחלה.

הגנום עריכה בימוי בידול של hPSCs עבור חקירת גורמים המשפיעים Lineage בהתפתחות האנושית הלבלב

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Research

JoVE Journal

Genetics

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

קביעת הגנום כולו התעתיק הניוון ב Fibroblasts האדם מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

ממוקד הדור הבא רצפי וכן ביואינפורמטיקה צינור להעריך גורמים גנטיים של המחלה החוקתי

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

בתיווך CRISPR הגנום עריכה של פטריות פתוגניות קנדידה אלביקנס

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

שינוי צורה, הגנום עריכת ופנוהקלדת החנקן-תיקון טרופי קנאביציים עץ Parasponia אנדרסונii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

אפיון של בידול במבחנה של Keratinocytes האדם העיקרי על ידי ניתוח RNA-Seq

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...