Name: genome editing and directed differentiation of hpscs for interrogating lineage determinants in human pancreatic development
Uploaded: 2017-03-05T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
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この作品は、NIH / NIDDK（R01DK096239）とニューヨーク州の幹細胞科学（NYSTEM C029156）によって部分的に資金を供給されました。 ZZはスローンケタリング研究所の幹細胞生物学のためのセンターからNYSTEMポスドクフェローシップによってサポートされていました。

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著者らは、開示することは何もありません。

生成突然変異系統のための時間に関する検討事項ゲノム編集のためのCRISPR / CASシステムに基づいて、最近のアプローチが成功した標的につながっているが、より効果的かつ普遍的なプラットフォームは、遺伝子機能の大規模解析のために好ましいであろう。 iCRISPRプラットフォームは利息5、9のいずれかの遺伝子に変異を導入するための迅速かつ効率的な方法を提供しています。まず、PCRベースのgRNA合成方法は、時間のかかるクローニングステップなしで一日に配列形式でgRNAs数百の製造を可能にします。第二に、iCas9 hPSCsにおけるドキシサイクリン誘導性Cas9発現と、gRNAトランスフェクションを伴うステップは仕事の最小限の量を必要とし、したがって、複数のgRNAターゲッティング実験を同時に行うことができます。我々のシステムの分析で達成第三に、高いターゲティングによる効率〜24 - トランスフェクトgRNAあたり48コロニーがsuffでなければなりません効率は、標的遺伝子座に依存して変化するがicientは、単一の遺伝子のための複数の1アレル及び対立遺伝子変異体系統を確立します。訓練を受けた個人は、機械的に、一気に384コロニー（4×96ウェルプレート）を選択するために解剖顕微鏡下で約4時間を取るべきであることが可能であるので、訓練を受けた個人は、内12の遺伝子に影響する変異株を作製することが期待できます1から2ヶ月。短時間でHPSC変異体の合理化された世代は発達過程9を規制する 、互いに相互作用する転写因子および/またはシグナル伝達経路成分の配列の体系的な分析を可能にします。また、効率的な多重遺伝子ターゲティングは、複雑な人間の形質の根底にある遺伝的相互作用を調査への扉を開きます。 正確な遺伝子改変の生成簡単にアクセスできる体細胞型からの患者固有のiPS細胞の誘導<html> sおよび疾患関連細胞型への分化は、疾患関連変異の機能的検証のための素晴らしい機会を提供します。しかし、個体間の遺伝的背景にはかなりのばらつきに、患者からiPS細胞間および健康なドナーからの直接比較は1つが、背景効果から疾患の表現型を区別することができない場合があります。したがって、バック野生型配列へ病変異を補正して同系制御性IPSCを生成する等25,26によって提案されているように、野生型HPSC背景に患者特異的変異を導入することが必要です。機能喪失（ヌル）の変異に加えて、一つは今より正確に、hypermorphic低形質、neomorphic、またはドミナントネガティブ患者を含むhPSCsにおける内因性遺伝子座の中に患者特異的配列改変を導入することにより病気のメカニズムを分析することができます突然変異。 それはNHEJ媒介DNA修復よりもはるかに効率が低いので。修理テンプレートの存在下で、DSB修復のためのHDRを採用して正確な遺伝子改変ntent &quot;&gt;、患者特異的変異、薬剤選択カセット、および相同性アームを含むドナープラスミド以前に患者特異的変異の薬剤選択と検証した後、第二段階は、一般的に薬剤選択カセットを除去するために必要である。最も広く使用されているのCre-loxP配列とFLP-FRTシステムは残しながら。修理テンプレート2として使用されています内因性遺伝子座における残留シーケンス、のpiggyBacトランスポゾンの使用は、薬剤選択カセット27のシームレスな除去を可能にした。さらに最近では、短い一本鎖DNAテンプレートはまた、操作されたDNAエンドヌクレアーゼ28で効率的なHDRをサポートすることが示されている。ドナープラスミドと比較すると、一本鎖DNAを直接合成し、従って、時間のかかるクローニングステップを回避することができる。ここで、であるました同時トランスフェクションgRNAと相同性指向性修復を誘導するssDNA鋳型によって、iCRISPRが高効率で特定のヌクレオチド修飾を導入することができる、ことを示しアン。これは、タンパク質の機能的ドメイン内だけでなく、ヒト疾患変異をモデル化し、潜在的な治療的介入のためのこれらの疾患関連変異を補正するための必須のヌクレオチドの役割を解剖するだけでなくするために重要です。各糖尿病などの複雑かつ多遺伝子疾患をモデル化し、複数の配列変異体に関連付けられている感受性遺伝子座の数が多いために遺伝学者のための課題でした。 iCRISPRプラットフォームは、対立遺伝子シリーズの迅速な生成のためにまたは多重化可能遺伝子ターゲティングを許容するように、個別にまたは同質遺伝子的背景との組み合わせで、複数の疾患関連遺伝子座の調査を容易にすることができます。 効率およびオフターゲット効果をターゲット我々は持っています<html> T7E1とRFLPアッセイの結果及び配列決定により同定された変異体のライン数との間に良好な相関関係を発見しました。これは、クローン株の確立と並行して、これらのアッセイを行うことの重要性を強調しています。得ターゲティング効率は、ゲノム遺伝子座に依存して変化し得るが、ほとんどの単一遺伝子ターゲティング実験において、20 -クローンの60％が（フレームおよびフレームシフト変異を含む）変異した対立遺伝子9の両方で発見されました。多重遺伝子ターゲティングを行った場合には、5〜10％の効率で三重二対立遺伝子突然変異体のクローンが5を得ました。 10％5 -いくつかの遺伝子の一本鎖DNA媒介HDRはまた、ホモ接合ノックイン1の範囲のクローンを得るための効率で、正確な遺伝的変化を得るために行われました。 hPSCsにCRISPR / CASでの作業、同じgRNA標的配列を共有していない潜在的なオフターゲットサイト内の任意の突然変異がまだ検出されるべきです小娘= &quot;外部参照&quot;&gt; 5、9、12。最近の研究で行われる全ゲノム配列決定はまた、CRISPR / Casの29を使用して生成されたクローンHPSCラインに実質的なオフターゲット変異を同定するために失敗しました。それにもかかわらず、オフターゲット効果部位での変異によって導入表現型を交絡の潜在的な影響を最小限にするために、同じ遺伝子内の異なる配列を標的とする少なくとも2つの独立しgRNAsを使用して独立した変異株を作製することが提案されています。別gRNAsを使用して生成された複数のラインで観察された類似の表現型は、主に表現型がオフターゲット効果から来ている可能性を除外することができました。 フィーダー依存独立した文化とターゲット対 HPSC培養のための従来の方法は、動物のPRODを含み、血清または血清代替を含む培地中でフィーダー細胞上のそれらの維持・拡大を伴いますウシ血清アルブミンのようなUCTS。フィーダー細胞、血清、血清代替品、およびアルブミンすべては、複雑な、未定義の成分が含まれており、かなりのバッチ可変性を示します。無フィーダーと化学的に定義された条件への適応が大幅HPSC維持のための努力を低減し、より重要なのは、分化実験の一貫性を向上させます。現時点では、完全に定義された培養条件30で培養hPSCsのゲノム編集手順を説明し、非常に少数の研究があります。我々はgRNAトランスフェクションおよびクローン堆積は、フィーダー依存培養条件と比較して、無フィーダー条件で行ったときの効率をターゲットに高いCRISPRを発見しました。これはコロニー形成のためのトランスフェクションおよび単一細胞播種後に増加した細胞の生存のためであると考えています。また、フィーダー細胞は、以前にそれによってトランスフェクション効率を低下させる、トランスフェクション試薬を隔離することが示されています。 結合ダイレクト差別とゲノムの編集前分化プロトコルはインスリン陽性細胞のわずかな部分のみが得られている、の大半はpolyhormonalたと胎児の内分泌細胞23に似ていました 。最近の進歩は、より成熟したグルコース応答性β様細胞16、17、19、20にhPSCsの分化を可能にしました。私たちは日常的にHUES8 hPSCs 9を用いて、少なくとも75％の胚体内胚葉細胞、40％のPDX1 + NKX6.1 +膵臓前駆細胞、および約20％のNKX6.1 + CPEP +グルコース応答性β様細胞を得ることができます。 iCRISPRゲノム編集システムと組み合わせると、このより堅牢な分化プロトコルは、膵臓分化の膵臓前駆細胞および内分泌段階に不可欠である転写因子の解析を容易にしました。これは、ようになりますそれが可能な、将来の研究では、糖尿病9の根底にあるメカニズムへの機能検証や調査のための候補疾患遺伝子の大規模な数を調べました。 将来のアプリケーションや行き方我々のiCRISPRシステムは長いドナーDNAテンプレートをコードするタンパク質タグまたは蛍光レポーター12を使用して標的とHDR媒介遺伝子を通じて、このようなレポーター対立遺伝子の作成など、より複雑なゲノムの改変、の生成を容易にすることができます。我々は、システムにおいて達成効率を標的ハイCRISPRに、このプロセスはさらに、薬剤選択12を必要とせず、hPSCsに行うことができることを示しています。さらに、標的化多重遺伝子は、我々は、このようなワーク31の第一の例であると考えて我々の最近の研究で示されているように、複雑なヒト疾患の根底にある遺伝的相互作用を調査するために使用することができます。 iCRISPRはまた、プロモーターおよびエンハンサーなどの調節領域の欠失を作成することにより、いずれかの非コードRNAまたは遺伝子における遺伝子調節制御を理解するために使用することができます。効率iCRISPRを使用して調節変異体を生成するために、gRNAsを含む、DNA結合タンパク質の結合部位を破壊するように設計されたが、基本転写機構または組織特異的な転写因子に限定されないことができます。 ssDNA鋳型媒介HDRは、特定のタンパク質結合部位を突然変異させるために使用することができます。最後に、我々は、in vitroでの分化プロトコルと組み合わせた場合、さらに最適化が多能性表現型または疾患の表現型のより高いスループット遺伝子解析のためのhPSCsでiCRISPRプラットフォームの使用を可能にするであろうことを想定しています。これらのiCRISPR媒介の研究は、候補疾患関連遺伝子およびそれらの機能的関連性の研究のより迅速な同定を可能にすることができます。

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）自己複製の両方三胚性生殖系列の全ての誘導体を生じる能力を有します。彼らは人間の発達のコンテキストで細胞プロセスを再現するユニークなプラットフォームとして機能することにより、細胞置換療法と病気のモデリングのための貴重なリソースを提供しています。彼らはまた、スケーラブル、高スループット分析のための実験的な細胞の供給源です。効率的な遺伝子改変ツールの欠如および培養皿に複雑な胚の発達段階を反復することの困難：しかし、進展があるため、2つの主要な課題に制限されていました。 遺伝子改変は、通常の開発と疾患における遺伝子機能を研究するための不可欠なツールです。相同組換えを介してのアプローチを標的古典的な遺伝子が証明されているがしかし、マウス胚性幹細胞（たmESC）における遺伝子機能を分析するための強力なツール1は、このアプローチであることがhPSCs 2、3に適用された場合、非常に非効率的となっています。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）、転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）、およびクラスタ化された定期的interspaced短いパリンドローム反復（CRISPR）/ CRISPRは関連を含む実験使用に自然からプログラマブル、サイト固有のヌクレアーゼ、最近の活発なアク（CAS）システム4は 、ゲノム工学はhPSCsを含め、生物および細胞株の広い範囲で非常に容易課題となっていることを意味します。これらの遺伝子の編集ツールは、このようなCas9エンドヌクレアーゼとキメラヌクレアーゼは、いずれかの非相同を活性化するために、正確な位置での二重鎖切断（DSB）を誘導する内因性DNA修復機構をトリガすることによって遺伝子改変の全範囲を可能にすることができるという事実を利用します結合（NHEJ）終了または相同性指向修理（HDR）。両方のメカニズムはEITHを誘導することによって遺伝子操作のために利用することができますえーランダム挿入および欠失変異（インデル; NHEJ を介した）は 、ヒト疾患のモデリングのための患者の変異を再現したり、遺伝子治療のための疾患を引き起こす変異を修正するために、遺伝子の対立遺伝子、または（HDR経由で）正確なヌクレオチド置換を無効にフレームシフト変異を作成します。 DNA標的認識を指定するDNAの切断と変数のCRISPR RNA（crRNA）およびトランス活性化（tracrRNA）二重のために必要な一定のRNA誘導型Cas9エンドヌクレアーゼ：CRISPR / Casの媒介ゲノム工学は、2つのコンポーネントが必要です。 crRNA / tracrRNA二本鎖は、より効率的に5、6、7働くことが見出されている単一のキメラガイドRNA（gRNA）で置き換えることができます。 CRISPR / Cas9システムが最も実験的な生物および細胞株に適合されているが、Cas9およびgRNAの送達および発現は有意に変化し、さらに阿智に最適化される必要がありますhPSCs 8を含む多くのシステムでの前夜効率的なゲノム編集。効率的なゲノム編集プラットフォーム、iCRISPRは、hPSCs 5に設立されました。このシステムでは、TALEN媒介アプローチは、テトラサイクリン応答エレメント（TREと逆テトラサイクリン制御トランス（M2rtTA）や他とのトランス 、一つの対立遺伝子の 「導入遺伝子セーフハーバー軌跡」AAVS1の両方の対立遺伝子を標的とするために使用されてきました）hPSCsにおけるCas9（iCas9）の発現を駆動します。確立されたクローン系（iCas9 hPSCs）では、Cas9は非常にドキシサイクリン処理で表現されています。一方、、その小さなサイズ（100ヌクレオチド）に、単一または複数のgRNAsは、簡単に高効率でiCas9 hPSCsに送達することができ、部位特異的切断のためのCas9を指示することができ、効率的なNHEJ媒介遺伝子破壊を可能にするだけでなく、HDR-媒介します短い一本鎖DNA（ssDNA）ドナーテンプレートの存在下での正確なヌクレオチド修飾。 iCRISPRシステムは、することができます成功し、9が重要な発生遺伝子5で二対立遺伝子（ホモ接合または複合ヘテロ接合）またはヘテロ接合機能喪失型変異を有する疾患模倣HPSC株のパネルを生成するために使用されます。グループの数はhPSCsにCRISPR / CASを使用して、効率的な遺伝子編集を報告しているが、成功は技術的に熟達研究室の小さな数に制限されたままです。 iCRISPRプラットフォームは、異なるスキルレベルの研究者による日常的遺伝子編集のための効率的かつシンプルなソリューションを提供しています、そして、それは既に公開された私たちのグループによる研究およびその他9、10、11、12の数で使用されています。このアプローチは、さらにdCas9-KRAB 13の発現に基づいて、誘導性サイレンシングに拡張されています。 ゲノム編集テクノの進展に伴いでれっと、大幅な改善もHPSCのメンテナンスと向かう分化に達成されています。 hPSCsのための培養条件は、定義された細胞外マトリックス成分に無フィーダー条件に、かつ化学的に培地条件14を定義したために、複雑な培地製剤から照射したマウス胚性線維芽細胞（iMEF）フィーダ依存から進化してきました。このような改善はiMEF準備とノックアウト血清代替成分中のバッチ間の差異に起因するhPSCsのばらつきを低減し、ひいてはHPSCの分化のためのより再現環境を提供しています。また、改良されたヒト胚発達を支配するシグナル伝達経路についての知識、ならびにハイスループット薬物スクリーニングの発見は、改良された分化プロトコル15、16、17、18につながっています。これらのプロトコルは、より密接VIVに模倣します発達段階oおよび密接にそれらのインビボの対応を再現細胞型を生成します。膵臓系統へのHPSCの分化のために、初期のプロトコルは比較的よく早期膵臓の開発を模倣するが、最終的に未熟な胎児の表現型のものであり、グルコース刺激に乏しい回答polyhormonalβ細胞を生成しました。最近の進歩は16、17、19、20は、このように形成し、monohormonalβ細胞のさらなる成熟として後でイベントを調査するために私達を許可して、グルコース応答性膵β細胞様細胞の生成のために許可されています。 ここでは、詳細グルコース応答pancrに向かってHPSCベースのインビトロ分化プラットフォームとiCRISPRシステムを組み合わせることにより、膵臓の開発の研究のためのゲノム修飾されたラインの適用eaticβ様細胞。改良されたHPSCの分化プロトコルを備えた強力なゲノム編集ツールのこの結合は、疾患の因果関係を検証するための需要を満たすために必要なスピードとスケールを提供していますが、また正常な発達と病気9の根底にある転写制御へのさらなるメカニズムの調査のための洗練された遺伝子操作を可能にするだけでなく、 。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="847">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:368px;">Chemically defined medium (E8)</td>
			<td style="width:261px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">A1517001</td>
			<td style="width:87px;">Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Truncated recombinant human form of vitronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563029</td>
			<td>1X, animal origin free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418 Sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10131035</td>
			<td>Geneticin Selective Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td>Puromycin Selective Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA Polymerase (Herculase II Fusion)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600679</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEGAshortscript T7 Transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Reduced Serum Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69504</td>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BLAR medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine supplement (GlutaMAX)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaHCO3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>LAMPIRE Biological Laboratories</td>
			<td>7500855</td>
			<td>Fatty acid free</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GDF8</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CHIR-99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>GSK-3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SANT1</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1974</td>
			<td>Hedgehog inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LDN</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0019</td>
			<td>BMP inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IWP-2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3533</td>
			<td>Wnt antagonist&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ITS-X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TPB</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565740-1MG</td>
			<td>PKC activator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3,3&#8217;,5-Triiodo-L-thyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ALK5i II</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-445</td>
			<td>ALK5 inhibitor II</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZnSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GSiXX</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565789</td>
			<td>Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-Cys (N-acetyl cysteine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trolox</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>648471</td>
			<td>Vitamin E analogue</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">R428</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2841</td>
			<td>AXL receptor tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24mm Transwell with insert</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gene Pulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.4 cm Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-TALEN-L</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-TALEN-R</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-Neo-M2rtTA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-Puro-iCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>58409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0302L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer 2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7002S</td>
			<td>NEBuffer 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Long oligonucleotide</td>
			<td>Eton Bioscience or IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOX17 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1924</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FOXA2 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CXCR4-APC antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170A</td>
			<td>1: 25</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NKX6.1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F55A12</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NKX2.2 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NEUROD1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-1084</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0564</td>
			<td>1: 2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C-peptide antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>GN-ID4-c</td>
			<td>1: 2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucagon antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2654</td>
			<td>1: 1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing and directed differentiation of hpscs for interrogating lineage determinants in human pancreatic development

自己再生または分化するヒト多能性幹細胞（hPSCs）で遺伝子機能を尋問することは、人間開発を理解し、皿に病気のメカニズムを解剖に向けて貴重なプラットフォームを提供しています。この潜在的な用途に活用するには、密接にそれらのインビボの対応を再現疾患関連細胞型を生成するために、疾患関連遺伝子にHPSC変異体を生成するための効率的なゲノム編集ツールを必要とするだけでなく、in vitroでの HPSC分化プロトコル。 iCRISPRという名前hPSCsのための効率的なゲノム編集プラットフォームはAAVS1遺伝子座におけるCas9発現カセットのTALEN媒介ターゲティングによって開発されました。ここでは、化学的に定義された培地および無フィーダー条件で培養細胞を用いた誘導Cas9 HPSCラインを生成するためのプロトコルが記載されています。 nまでのいずれかの遺伝子ノックアウトまたはhPSCsで正確な遺伝的変化のためのiCRISPRシステムを使用するための詳細な手順、接合端（NHEJ）に相同オンまたは相同性指向修理（HDR）テンプレートを使用して、正確なヌクレオチド変異を経由して、それぞれ、含まれています。これらの技術的な手順は、設計、生産、およびCRISPRのガイドRNA（gRNAs）のトランスフェクションの記述を含みます。 T7E1またはRFLPアッセイによってCRISPR変異率の測定;およびクローン変異株の樹立と検証。最後に、 生体内膵臓の胚発生に模倣することによってグルコース応答性膵β細胞様細胞への我々 HPSC分化に記載の手順。有向HPSC分化にiCRISPR技術を組み合わせることにより、膵臓の開発と糖尿病のメカニズムの理解を促進するために遺伝子機能の系統的な検査を可能にします。

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Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

iCRISPRプラットフォームを使用HPSC変異株を作製し、グルコース応答性β様細胞にhPSCsを区別するためのプロトコルが記載されています。 HPSC指向分化にゲノム編集技術を組み合わせることにより、人間開発と疾患の進行中の系譜決定因子の役割の体系的な分析のための強力なプラットフォームを提供します。

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Research

JoVE Journal

Genetics

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

遺伝子編集アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイ胚に CRISPR/Cas9 蛋白質のマイクロインジェクション

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

ひと線維芽細胞の増殖静止ゲノムワイドな転写減衰率を決定します。

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクス パイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

作る条件付き変異体の人間のマラリア原虫マラリアに CRISPR/Cas9 遺伝子の編集

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR を介したゲノム人間病原菌カンジダの編集

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

CRISPR Cas を用いた哺乳類細胞におけるゲノム編集

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

窒素固定熱帯カンナバ科の木パラスポニア・アンダーソンニの変形、ゲノム編集、表現型

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

RNA-Seq解析によるヒト原発性角化細胞のインビトロ分化の特徴

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...