Name: genome editing and directed differentiation of hpscs for interrogating lineage determinants in human pancreatic development
Uploaded: 2017-03-05T15:00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert delvis av NIH / NIDDK (R01DK096239) og New York State Stem Cell Science (NYSTEM C029156). ZZ ble støttet av NYSTEM postdoktorstipend fra Center for Stem Cell Biology av Sloan Kettering Institute.

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li><li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells.">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li><li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells.">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11 (7), 514-518 (2001).</li><li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases.">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li><li>Gonz&#225;lez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iCRISPR+Platform+for+Rapid,+Multiplexable,+and+Inducible+Genome+Editing+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 215-226 (2014).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells.">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5 (5), 389-392 (2008).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+of+Lineage+Determinants+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Reveals+Mechanisms+of+Pancreatic+Development+and+Diabetes.">Genome Editing of Lineage Determinants in Human Pluripotent Stem Cells Reveals Mechanisms of Pancreatic Development and Diabetes.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 755-768 (2016).</li><li>Kotini, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+a+chromosomal+deletion+associated+with+myelodysplastic+syndromes+using+isogenic+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).</li><li>Carlson-Stevermer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Analysis+of+CRISPR-Cas9+Gene-Edited+Human+Embryonic+Stem+Cells.">High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 109-120 (2016).</li><li>Zhu, Z., Verma, N., Gonzalez, F., Shi, Z. D., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas-Mediated+Selection-free+Knockin+Strategy+in+Human+Embryonic+Stem+Cells.">A CRISPR/Cas-Mediated Selection-free Knockin Strategy in Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1103-1111 (2015).</li><li>Mandegar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+Interference+Efficiently+Induces+Specific+and+Reversible+Gene+Silencing+in+Human+iPSCs.">CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+functional+glucagon-secreting+alpha-cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells.</a> Diabetes. 60 (1), 239-247 (2011).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+that+directs+differentiation+of+human+ESCs+into+the+pancreatic+lineage.">A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage.</a> Nat Chem Biol. 5 (4), 258-265 (2009).</li><li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+NKX6-1++pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li><li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro.">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO J. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li><li>Zhu, Z., Gonzalez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells.">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods Enzymol. 546, 215-250 (2014).</li><li>Soh, C. L., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Mediated+Mutagenesis+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+Defined+Xeno-Free+E8+Medium.">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium.</a> Methods in Molecular Biology. 1498, (2017).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li><li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 750-756 (2011).</li><li>Musunuru, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+of+human+pluripotent+stem+cells+to+generate+human+cellular+disease+models.">Genome editing of human pluripotent stem cells to generate human cellular disease models.</a> Dis Model Mech. 6 (4), 896-904 (2013).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+alpha1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+genome+editing+using+ssDNA+oligonucleotides+with+zinc-finger+nucleases.">High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases.</a> Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).</li><li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+incidence+of+off-target+mutations+in+individual+CRISPR-Cas9+and+TALEN+targeted+human+stem+cell+clones+detected+by+whole-genome+sequencing.">Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Gene-Corrected+Adult+Beta+Globin+Protein+in+Human+Erythrocytes+Differentiated+from+Patient+iPSCs+After+Genome+Editing+of+the+Sickle+Point+Mutation.">Production of Gene-Corrected Adult Beta Globin Protein in Human Erythrocytes Differentiated from Patient iPSCs After Genome Editing of the Sickle Point Mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li><li>Shi, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+hPSCs+Reveals+GATA6+Haploinsufficiency+and+a+Genetic+Interaction+with+GATA4+in+Human+Pancreatic+Development.">Genome Editing in hPSCs Reveals GATA6 Haploinsufficiency and a Genetic Interaction with GATA4 in Human Pancreatic Development.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li></ol>

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Tid Hensyn for å generere Mutant Lines Selv om de siste tilnærminger basert på CRISPR / Cas systemer for genom redigering har ført til en vellykket satsing, ville en mer effektiv og universell plattform være å foretrekke for større skala analyser av gen-funksjon. Den iCRISPR plattformen gir en rask og effektiv metode for å innføre mutasjoner til hvilket som helst gen av interesse 5, 9. For det første tillater PCR-baserte gRNA syntesemetode fremstilling av hundrevis av gRNAs i kledd format i en dag uten de tidkrevende kloningstrinn. For det andre, med doksycyklin-induserbar Cas9 uttrykk i iCas9 hPSCs, trinn involverer gRNA transfeksjon krever bare minimalt med arbeid, og dermed kan flere gRNA rettet mot forsøkene gjennomføres samtidig. Tredje, på grunn av den høye målretting effektivitet oppnåelig med vårt system, analyse av ~ 24 - 48 kolonier pr gRNA transfektert bør være sufficient for å etablere multiple monoallelic og biallelic mutant linjer for et enkelt gen, selv om effektiviteten varierer avhengig av mål-locus. Siden det er mulig for en trent person til mekanisk plukke 384 kolonier (4 x 96-brønners plater) i en sittende, som bør ta ~ 4 timer under et dissekere mikroskop, kan et trent individ forventes å generere mutant linjer som påvirker 12 gener innen 12 måneder. Den strømlinjeformede generasjon hPSC mutanter på kort tid gir mulighet for systematisk analyse av en rekke transkripsjonsfaktorer og / eller signalveien komponenter som samhandler med hverandre, regulere utviklingsprosess 9. I tillegg effektiv multiplekset genet targeting åpner også døren for å undersøke genetiske interaksjoner underliggende komplekse menneskelige trekk. Generering av Nøyaktige genetiske modifikasjoner Avledning av pasientspesifikke iPSCs fra lett tilgjengelige somatisk celletype<html> s og differensiering i sykdoms relevant celletyper gir en flott mulighet for den funksjonelle validering av sykdomsassosierte mutasjoner. Men på grunn av den betydelige variasjon i genetisk bakgrunn mellom individer, direkte sammenligninger mellom iPSCs fra pasienter og fra friske donorer ikke tillater en å skille sykdom fenotyper fra bakgrunnseffekter. Derfor er det nødvendig å generere isogene kontroll iPSCs ved å korrigere sykdommen mutasjonen tilbake til villtype-sekvensen, eller for å innføre de pasientspesifikke mutasjoner inn i en hPSC bakgrunn vill-type, som foreslått av andre 25, 26. I tillegg til tap-av-funksjon (null) mutasjoner, kan en nå mer presist dissekere sykdomsmekanismene gjennom innføring av en pasient-spesifikke sekvensendringer inn i den endogene locus i hPSCs, inkludert hypermorphic, hypomorphic, neomorphic, eller dominant-negativ pasient mutasjoner. ntent &quot;&gt; Precise genetisk modifikasjon anvender HDR for DSB reparasjon, i nærvær av en reparasjon mal. Siden det er mye mindre effektiv enn NHEJ-mediert DNA-reparasjon, en donor plasmid inneholdende pasientspesifikk mutasjon, en medikamentseleksjon kassett, og homologi armene har tidligere blitt brukt som reparasjons templat 2. Etter medikamentseleksjon og verifisering av pasientspesifikk mutasjon, blir et andre trinn vanligvis nødvendig for å fjerne den medikamentseleksjon kassetten. Mens de mest brukte Cre-loxP og FLP-FRT-systemer etterlate gjenværende sekvens i det endogene locus, har bruken av piggyBac transposon tillatt for sømløs fjerning av medikamentseleksjon kassetten 27. i den senere tid korte ssDNA maler har også blitt vist å understøtte effektiv HDR med konstruerte DNA-endonukleaser 28. Sammenlignet med en donor plasmid , ssDNA kan direkte syntetiseres og således omgår tidkrevende kloningstrinn. Her må det blino vist at, ved ko-transfeksjon av gRNA og en ssDNA mal for å indusere homologi rettet reparasjon, kan iCRISPR anvendes for å innføre bestemte nukleotid-endringer med høy virkningsgrad. Dette er kritisk for ikke bare å dissekere rollen av essensielle nukleotider innenfor protein funksjonelle domener, men også for modellering av humane sykdoms mutasjoner og eventuelt korrigere disse sykdomsassosierte mutasjoner for terapeutisk intervensjon. På grunn av det store antallet mottakelighet loci som hver er forbundet med flere sekvensvarianter, å modellere komplekse og multigenic sykdommer slik som diabetes har vært en utfordring for genetikere. Som iCRISPR plattformen er ettergivende for den raske dannelse av en allelisk serie eller for multiplexable gen målretting, kan det lette undersøkelsen av flere sykdomsassosierte loci, enten individuelt eller i kombinasjon med isogene bakgrunn. Målrette Effektivitet og Off-målet Effects Vi har<html> funnet en god korrelasjon mellom T7E1 og RFLP-analyseresultatene, og antallet mutant linjer identifisert ved sekvensering. Dette understreker viktigheten av å utføre disse analyser parallelt med etableringen av klonale linjer. Mens de er målrettet mot effektiviteter oppnås kan variere avhengig av det genomiske loci i de fleste enkelt-gen-målsøkende eksperimenter, 20 - 60% av klonene ble funnet med begge alleler mutert (inklusive i-ramme og rammeskiftmutasjoner) 9. I tilfeller der multiplexed genet målretting ble utført, ble trippel biallelic mutante kloner med 5-10% effektivitet oppnås 5. ssDNA-mediert HDR av flere gener ble også utført for å oppnå presise genetiske endringer, med effektiviteten av å skaffe homozygot knock-in kloner fra 1 - 10% 5. Arbeide med CRISPR / Cas i hPSCs, eventuelle mutasjoner i potensielle off-target nettsteder som ikke deler samme gRNA målsekvensen er ennå ikke oppdagetlass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 9, 12. Hel-genomsekvensering utført i en fersk studie har også unnlatt å identifisere betydelige off-target mutasjoner i klonale hPSC linjer generert ved hjelp CRISPR / Cas 29. Likevel, for å minimalisere eventuelle effekten av konfunderende fenotyper introdusert av mutasjoner ved off-target effekt områder, er det foreslått å generere uavhengige mutant linjer ved hjelp av minst to uavhengige gRNAs rettet mot ulike sekvenser innenfor samme genet. Lignende fenotyper observert i flere linjer generert ved hjelp av ulike gRNAs kan prinsipielt utelukke muligheten for at fenotype kommer fra en off-target effekt. Feeder-avhengige versus Uavhengig Kultur og målretting Tradisjonelle metoder for hPSC kultur involvere deres vedlikehold og utvidelse på feeder-celler i medier som inneholder serum eller serum erstatning som inkluderer dyr proddukter, slik som bovint serumalbumin. Feeder celler, serum, serum erstatning, og albumin alle inneholder komplekse, udefinerte komponenter og viser stor batch variasjon. Tilpasning til materen fritt og kjemisk definert tilstand reduserer innsatsen for hPSC vedlikehold og, enda viktigere, øker konsistensen av differensiering eksperimenter. I dag er det svært få studier som beskriver genom redigering prosedyrer på hPSCs dyrket i fullt definerte kultur forhold 30. Vi har funnet høyere CRISPR rettet mot effektivitet når gRNA transfeksjon og klonal deponering ble utført i mater frie forhold i forhold til mateavhengige dyrkningsforhold. Vi tror at dette skyldes økt celle overlevelse etter transfeksjon og encellede seeding for kolonidannelse. Dessuten har feeder-celler tidligere er blitt vist å beslaglegge transfeksjon reagenser, for derved å senke transfeksjonseffektiviteten. kombinereGenome Redigerer med Regissert Differensiering Tidligere differensiering protokoller har gitt bare en liten brøkdel av insulin-positive celler, de fleste som var polyhormonal og lignet fosterets endokrine celler 23. Nyere fremskritt har tillatt differensiering av hPSCs til mer modne glukose-responsive beta-lignende celler 16, 17, 19, 20. Vi kan rutinemessig få minst 75% definitive endoderm celler, 40% PDX1 + NKX6.1 + pancreatic stamfedre, og rundt 20% NKX6.1 + CPEP + glukose-responsive beta-lignende celler ved hjelp HUES8 hPSCs 9. Når det kombineres med iCRISPR genomet redigeringssystem, har dette mer robust differensiering protokollen tilrettelagt analyse av transkripsjonsfaktorer som er avgjørende for bukspyttkjertelen progenitor og endokrine stadier av bukspyttkjertel differensiering. Dette vil gjøredet er mulig, i fremtidige studier for å undersøke et stort antall kandidat sykdomsgener for den funksjonelle validering og gransking av mekanismene som ligger til grunn diabetes 9. Fremtidige applikasjoner eller Veibeskrivelse Vår iCRISPR Systemet kan bidra til generering av mer komplekse genomiske modifikasjoner, for eksempel etableringen av reporter alleler gjennom HDR-mediert genet targeting bruker lang donor DNA maler koding protein tags eller fluoriserende journalister 12. Vi har vist at, på grunn av den høye CRISPR målretting effektivitet oppnådd i systemet, kan denne prosessen utføres i hPSCs, uten behov for ytterligere medikamentseleksjon 12. Videre kan multiplekset genet målretting bli brukt til å undersøke genetiske interaksjoner liggende kompleks sykdom hos mennesker, som vist i vår nylig studie, som vi mener er det første eksempel på et slikt arbeid 31. ICRISPR kan også brukes til å forstå gen regulatorisk kontroll ved å skape delesjoner enten i ikke-kodende RNA eller i-gen regulerende områder, slik som promotere og enhancere. Til effektivt å generere regulerings mutanter ved hjelp av iCRISPR kan gRNAs være utformet for å forstyrre bindingssetet av en DNA-bindende protein, inkludert, men ikke begrenset til basaltranskripsjonelle maskiner eller et vev-spesifikk transkripsjonsfaktor. ssDNA mal-mediert HDR kan også brukes for å mutere spesifikke proteinbindingsseter. Til slutt, ser vi for oss at ytterligere optimalisering vil muliggjøre bruken av iCRISPR plattformen i hPSCs for høyere gjennomstrømning genetiske analyser av pluripotency fenotyper eller sykdoms fenotyper når den kombineres med en in vitro differensiering protokollen. Disse iCRISPR-mediert studier kan gi rom for raskere identifisering av kandidatsykdomsassosierte gener og studier av deres funksjonelle relevans.

Humane pluripotente stamceller (hPSCs) har evnen til både å fornye seg selv og gi opphav til alle derivater av de tre embryonale bakterie linjene. De gir en verdifull ressurs for celle erstatning terapi og sykdom modellering ved å fungere som en unik plattform for å rekapitulere cellulære prosesser i en menneskelig utviklingssammenheng. De er også en kilde til eksperimentelle celler for skalerbare, high-throughput analyser. Imidlertid har fremgang vært begrenset på grunn av to hovedutfordringer: mangel på effektive genetisk modifikasjon verktøy og vanskeligheten med å rekapitulere de komplekse embryonale utviklingstrinn i en kultur tallerken. Genetisk modifikasjon er en uunnværlig verktøy for å studere genfunksjon i normal utvikling og sykdom. Imidlertid, mens klassiske gene targeting tilnærminger via homolog rekombinasjon har vist seg å være et kraftig verktøy for å dissekere genfunksjon i mus embryonale stamceller (mESCs) 1, denne tilnærmingenhar vært svært ineffektiv når den brukes til hPSCs to, tre. Den nylige rask tiltredelse av programmerbare, stedsspesifikke nukleaser fra naturen til laboratoriebruk, blant annet sink finger nukleaser (ZFNs), transkripsjon aktivator lignende effektor nukleaser (Talens), og gruppert regelmessig avbrutt av korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / CRISPR-forbundet (Cas) systemer 4, innebærer at genom teknikk har blitt en mye enklere oppgave i et bredt spekter av organismer og cellelinjer, blant annet i hPSCs. Disse genet redigeringsverktøy dra nytte av det faktum at kimære nukleaser som Cas9 endonuklease kan tillate en hel rekke genetiske endringer ved å fremkalle dobbel-strandet pauser (DSB sin) på presise steder, utløser den endogene DNA reparasjon av veier for å aktivere enten ikke-homolog ende sammenføyning (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR). Begge mekanismene kan utnyttes for genetisk manipulasjon ved å fremkalle either tilfeldig innsetting og sletting mutasjoner (indels, via NHEJ), for å skape rammeskifte mutasjoner som opphever genet alleler, eller presise nukleotidsubstitusjoner (via HDR), for å rekapitulere pasient mutasjoner for menneskelig sykdom modellering eller for å rette en sykdomsfremkallende mutasjon for genterapi . CRISPR / Cas-mediert genomet teknikk krever to komponenter: konstant RNA-guidet Cas9 endonuklease nødvendig for DNA cleavage og en variabel CRISPR RNA (crRNA) og trans-aktivering (tracrRNA) dupleks som angir DNA target anerkjennelse. Den crRNA / tracrRNA dupleks kan erstattes med en enkelt kimært guide RNA (gRNA), som er blitt funnet å fungere mer effektivt 5, 6, 7. Mens CRISPR / Cas9 systemet er tilpasset mest eksperimentelle organismer og cellelinjer, levering og uttrykk for Cas9 og gRNA varierer betydelig og må ytterligere optimalisert til Achieve effektiv genom redigering i mange systemer, inkludert hPSCs 8. En effektiv genom-redigering plattform, iCRISPR, har vært etablert i hPSCs 5. I dette system har en TALEN-mediert metode blitt benyttet til å målrette begge allelene av &quot;transgene trygg havn locus&quot; AAVS1 i trans, ett allel med en omvendt tetracyklin-kontrollert transaktivator (M2rtTA) og den andre med en tetracyklin-responselement (TRE ) kjører uttrykk for Cas9 (iCas9) i hPSCs. I etablerte klonale linjer (iCas9 hPSCs), er Cas9 sterkt uttrykt med doksycyklin behandling. I mellomtiden, på grunn av sin lille størrelse (100 nt), én eller flere gRNAs lett kan leveres inn iCas9 hPSCs med høy effektivitet og kan henvise Cas9 for stedsspesifikke cleavage, muliggjør effektiv NHEJ-mediert genet avbrudd, samt HDR-mediert presise nukleotid-endringer i nærvær av korte enkeltkjedet DNA (ssDNA) donor maler. Den iCRISPR systemet kan værebrukt for å kunne generere et panel av sykdomsligne hPSC linjer med biallelic (homozygot eller sammensatte heterozygot) eller heterozygote tap-av-funksjon mutasjoner i viktige utviklings gener 5, 9. Mens et antall grupper har rapportert effektiv gen redigering ved hjelp av CRISPR / Cas i hPSCs, forblir suksess begrenset til et lite antall teknologisk flinke laboratorier. Den iCRISPR plattformen tilbyr en effektiv men enkel løsning for rutine genet redigering av forskere på ulike ferdighetsnivåer, og det har allerede blitt brukt i en rekke publiserte studier av vår gruppe og andre 9, 10, 11, 12. Denne tilnærmingen har også blitt ytterligere utvidet til induserbar stanse basert på uttrykk for dCas9-KRAB 13. Sammen med fremdriften i genomet-redigering technologi, betydelige forbedringer har også blitt oppnådd i hPSC vedlikehold og rettet differensiering. Kultur vilkår for hPSCs har utviklet seg fra bestrålte mus embryonale fibroblast (iMEF) mater avhengig til mater-frie forhold på definerte ekstracellulære matrise komponenter, og fra komplekse medie formuleringer til kjemisk definerte mellom forhold 14. Slike forbedringer har redusert variabilitet i hPSCs grunn av batch-til-batch-forskjeller i iMEF forberedelse og knockout serumreservekomponenter, og dermed gi en mer reproduserbar miljø for hPSC differensiering. I mellomtiden, bedre kunnskap om signalveier som styrer menneskelig embryoutvikling, samt funn fra high-throughput narkotika screenings, har ført til bedre differensiering protokoller 15, 16, 17, 18. Disse protokollene nærmere etterligne i vivo utviklingstrinn og generere celletyper som tett rekapitulere sine in vivo kolleger. For hPSC differensiering i bukspyttkjertelen avstamning, innledende protokoller lignet tidlig bukspyttkjertelen utvikling relativt godt, men til slutt generert polyhormonal betaceller som var av umodne foster fenotyper og respondert dårlig til glukose stimulering. Nylige fremskritt 16, 17, 19, 20 har tillatt for generering av glukose-responsive bukspyttkjertelen beta-lignende celler, noe som vil gjøre oss i stand til å undersøke senere hendelser, som for eksempel dannelse og den videre modning av monohormonal betaceller. Her har vi detalj anvendelse av genom-modifisert linjer for studiet av pankreatisk utvikling ved å kombinere iCRISPR systemet med hPSC basert in vitro differensiering plattformen mot glukose-responsive pancreatic B-lignende celler. Denne koblingen av kraftige genome redigeringsverktøy med en forbedret hPSC differensiering protokollen tilbyr ikke bare hastigheten og omfanget er nødvendig for å møte den økende etterspørselen etter validering sykdom kausalitet, men gjør det også avanserte genetiske manipulasjoner for videre mekanistiske undersøkelser i transkripsjonen kontroll underliggende normal utvikling og sykdom 9 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="847">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:368px;">Chemically defined medium (E8)</td>
			<td style="width:261px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">A1517001</td>
			<td style="width:87px;">Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Truncated recombinant human form of vitronectin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563029</td>
			<td>1X, animal origin free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418 Sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10131035</td>
			<td>Geneticin Selective Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td>Puromycin Selective Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA Polymerase (Herculase II Fusion)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600679</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEGAshortscript T7 Transcription kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Reduced Serum Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69504</td>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BLAR medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine supplement (GlutaMAX)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaHCO3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>LAMPIRE Biological Laboratories</td>
			<td>7500855</td>
			<td>Fatty acid free</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GDF8</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CHIR-99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>GSK-3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Vitamin C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FGF7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SANT1</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1974</td>
			<td>Hedgehog inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LDN</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0019</td>
			<td>BMP inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IWP-2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3533</td>
			<td>Wnt antagonist&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ITS-X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TPB</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565740-1MG</td>
			<td>PKC activator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3,3&#8217;,5-Triiodo-L-thyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ALK5i II</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-445</td>
			<td>ALK5 inhibitor II</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZnSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GSiXX</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565789</td>
			<td>Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-Cys (N-acetyl cysteine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trolox</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>648471</td>
			<td>Vitamin E analogue</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">R428</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2841</td>
			<td>AXL receptor tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24mm Transwell with insert</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gene Pulser Xcell Electroporation System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.4 cm Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-TALEN-L</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-TALEN-R</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>59026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-Neo-M2rtTA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>60843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AAVS1-Puro-iCas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>58409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T7 Endonuclease I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0302L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer 2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7002S</td>
			<td>NEBuffer 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Long oligonucleotide</td>
			<td>Eton Bioscience or IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOX17 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1924</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FOXA2 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CXCR4-APC antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB170A</td>
			<td>1: 25</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NKX6.1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F55A12</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NKX2.2 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NEUROD1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-1084</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0564</td>
			<td>1: 2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C-peptide antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>GN-ID4-c</td>
			<td>1: 2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucagon antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2654</td>
			<td>1: 1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome editing and directed differentiation of hpscs for interrogating lineage determinants in human pancreatic development

Avhør gen-funksjon i selv fornye eller differensierende humane pluripotente stamceller (hPSCs) tilbyr en verdifull plattform mot å forstå menneskelig utvikling og dissekere sykdomsmekanismer i en skål. For å utnytte dette potensialet applikasjonen krever effektive genom-redigeringsverktøy for å generere hPSC mutanter i sykdomsassosierte gener, samt in vitro hPSC differensiering protokoller for å produsere sykdomsrelevant celletyper som tett rekapitulere sine in vivo kolleger. En effektiv genom-redigering plattform for hPSCs heter iCRISPR har blitt utviklet gjennom TALEN-mediert målretting av en Cas9 uttrykk kassett i AAVS1 locus. Her er de protokoller for generering av induserbare Cas9 hPSC linjer ved hjelp av celler dyrket i et kjemisk definert medium og en mater-fri tilstand er beskrevet. Detaljerte prosedyrer for bruk av iCRISPR system for genet knockout eller presise genetiske endringer i hPSCs, enten gjennom non-homolog ende bli (NHEJ) eller via presise nukleotid endringer ved hjelp av en homologi-rettet reparasjon (HDR) mal, henholdsvis, er inkludert. Disse tekniske prosedyrer inkluderer beskrivelser av design, produksjon og transfeksjon av CRISPR guide RNA (gRNAs); måling av CRISPR mutasjonsraten ved T7E1 eller RFLP analyser; og etablering og validering av klonal mutant linjer. Til slutt, vi krønike prosedyrer for hPSC differensiering til glukose-responsive bukspyttkjertelen beta-lignende celler ved å etterligne in vivo bukspyttkjertelen embryonal utvikling. Kombinere iCRISPR teknologi med rettet hPSC differensiering gjør at systematisk undersøkelse av gen-funksjon for å videreutvikle vår forståelse av bukspyttkjertelen utvikling og diabetes sykdomsmekanismer.

<html> hPSC kjemisk definerte og mater-fri kultur Tilpasning og vedlikehold hPSCs dyrket på iMEF brett kan være raskt tilpasses VTN-belagte plater i materen frie kultur tilstand. Den samme spalteforhold som normalt iMEF mater kulturen kan brukes under tilpasning. Figur 1A viser typiske morfologi av hPSCs på iMEF forer i KSR basert medium og på en VTN-belagt overflate i mater fritt medium. Figur 1B viser et typisk morfologisk forandring og vekst av hPSC kolonier i løpet av den første passasje av tilpasnings (4 dager). Cellene kan være ytterligere passaged eller frosset for senere eksperimenter. Gjennomføre 2 - 3 passeringer av tilpasning kultur før du starter differensierings eksperimenter. Karyotypering anbefales også etter tilpasning, selv om vi ikke har observert Karyotype forstyrrelser under tilpasningen fasen. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Generation of iCas9 hPSC Lines gjennom TALEN-mediert AAVS1 målretting Som vist tidligere, ble hPSCs electroporated med et par AAVS1 Talen plasmider og Cas9 og M2rtTA plasmider 5. Figur 2A og B viser detaljert donor vektor rettet mot design og hele prosedyren for å generere iCas9 hPSC klonale linjer. Etter antibiotisk utvelgelse, enkelt-celle-avledede kloner som viser tilstrekkelig størrelse og typisk hPSC morfologi var klar til å bli plukket (10 - 12 dager etter elektroporering, figur 2C). Vanligvis ~ 50% av klonene er riktig rettet uten tilfeldige integreringer, som bekreftet ved Southern blotting (figur 2D) 5. Tilfeldig integrasjon kan forårsake utette ekspresjon av Cas9 i fravær av doksycyklin behandling. Effektiv Genetisk Modification i hPSCs Bruke iCRISPR Platform I etablert iCas9 hPSCs er Cas9 uttrykt med doksycyklin behandling og guidet til målet sitt locus av de transfekterte gRNAs, hvor den genererer DSB sin. I fravær av en reparasjon mal, DNA-reparasjon gjennom NHEJ genererer indels, som ofte resulterer i genet avbrudd eller knockout. I nærvær av en reparasjon mal (for eksempel en ssDNA donor), kan HDR anvendes for nøyaktig genetiske endringer, slik som generering av en pasient-spesifikke mutasjon i et hPSC bakgrunn villtype eller korrigere en sykdomsassosierte genetisk variant i pasient- avledet iPSCs (figur 3A). Det tar ~ en måned for å generere klonal mutant linjer ved hjelp av iCRISPR system. Etter iCas9 induksjon og gRNA transfeksjon, T7EI og / eller RFLP analyser ble brukt for å vurdere Cas9 effektiv kutting, og de transfekterte cellene ble sådd ut senere som enkle celler i 10-cm skåler ved lav tetthet (~ 500 - 2, 000celler / 10 cm parabol). 10 - 12 dager senere, ble enkelt-celle-avledede kloner plassert i brønnene til en 96-brønns plate for ekspansjon og ytterligere karakteristikk (dvs. genotyping og Western blotting) (figur 3B). Siden iCRISPR-mediert genet knockout er svært effektiv, er ingen utvelgelsesprosess involvert, og vanligvis 20 - 50% biallelic mutanter lett kan oppnås (figur 3C) 5. For effektive og presise genetiske endringer, gRNAs er co-transfektert med et ssDNA donor bærer bestemt rekkefølge endring (for en liten, men bestemt endring av genomsekvens). Ofte, for å hindre re-kutting i modifiserte alleler, er det anbefalt å inkludere en taus mutasjon i umiddelbar nærhet til eller i PAM-sekvensen (figur 3D). Med dette systemet, ~ 10% av kloner som bærer det ønskede HDR-mediert genomet modifikasjon uten ytterligere endringer i begge alleler er oppnådd (fig 3E). Den raske og precise endring av hPSC genomet bruker iCRISPR plattformen tillater oss å raskt og effektivt lage hPSC linjer som fungerer som modeller for å studere menneskelig utvikling og sykdom. Effektiv Differensiering av hPSCs mot Glukose-responsive e-lignende celler Framskritt i hPSC bukspyttkjertelen differensiering har tillatt utviklingen av protokoller som tett rekapitulere bukspyttkjertelen embryonal utvikling. Udifferensierte hPSCs første differensiert i den definitive endoderm, deretter inn PDX1 + tidlige bukspyttkjertelen stamfedre (PP1) og PDX1 + NKX6.1 + senere bukspyttkjertelen stamceller (PP2), og til slutt til glukose-responsive β-lignende celler 16, 17, 19, 20 , 23, 24. disse protocoler ble ytterligere optimalisert for pålitelig generere PDX1 + NKX6.1 + bukspyttkjertelen stamfedre og glukose-responsive e-lignende celler 9. Figur 4A viser detaljerte kjemiske kosttilskudd brukes på hvert stadium av differensiering. Vanligvis, ~ 80% sammenflytning 2 dager etter den initielle celle plating er ideell for å starte differensiering av HUES8 hPSCs (figur 4B). Testing flere forskjellige seeding tettheter er sterkt anbefalt å oppdage den optimaliserte tilstand for hver enkelt cellelinje. Vanligvis minst 75% FOXA2 + SOX17 + -celler ved DE trinnet og 40% PDX1 + NKX6.1 + celler ved PP2 trinnet kan oppnås (figur 4C). Ved S5 trinnet, nærværet av en aura lignende form rundt cellen aggregat er en indikator for god overlevelse av cellene, noe som er viktig for ytterligere differensiering til NKX6.1 + CPEP + glukose-responsive p-lignende celler (figur 4D ). Denne protokollen er nyttig for å studere menneskelig bukspyttkjertelen d<html> evelopment og sykdom i en skål. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig1.jpg" /> Figur 1. hPSC kjemisk definerte og mater-fri Vedlikehold og kultur Adaptation fra iMEF Feeders. (A) Representative bilder av hPSCs dyrket på iMEF materen eller på VTN på dag 4, klar til å bli delt. (B) Typisk morfologi hPSCs under den første passering av tilpasning til mater-fri kultur fra en iMEF mater. Dag 4 hPSCs dyrket på iMEF forer ble splittet og belagt på VTN-belagte plater i kjemisk definert medium med ROCK hemmer. Spalteforholdet var den samme som den vanlige spalteforholdet for dyrking i iMEF mateforhold. Mediet ble skiftet hver dag uten ROCK inhibitor. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <html> ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig2.jpg" /> Figur 2. Generering av iCas9 hPSC Lines. (A) Targeting strategi for generering av iCas9 hPSC linjer. Puro-Cas9 donor og Neo-M2rtTA donor ble rettet i den menneskelige AAVS1 locus av et par AAVS1 Talens. (B) Skjematisk av hele målretting prosessen, inkludert elektroporering, antibiotika utvalg, koloniplukking og ekspansjon, og cellelinje karakterisering. (C) Representant encellede klone klar til å bli plukket på rundt 10 - 12 dager etter electroporation. (D) Southern blot eksempler for å identifisere korrekt rettet kloner uten den ytterligere integrering av to donor plasmider. Riktige kloner er merket med rødt. (A) og (D) ble tilpasset fra referanse 5, med tillatelse.ig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig3.jpg" /> Figur 3. Effektiv genmodifisering i hPSCs Bruke iCRISPR System. (A) Skjema for generering av genet knockout mutanter eller presise genmodifisering bruker iCRISPR system. (B) Targeting prosedyre og klonal linje etablering. (C) Gene knockout effektivitet gjennom NHEJ i hPSCs 9. (D) Design av en ssDNA som bærer et spesifikt nukleotid modifikasjon. P, i rødt: pasient-spesifikke mutasjonen; X, i grønt: stille mutasjon. (E) Effektivitet av HDR-mediert nøyaktig nukleotid modifikasjon. En presis R456C mutasjon (forårsaket av en spesifikk nukleotid C&gt; T-mutasjon) i GATA6 locus ble innført ved hjelp av iCRISPR system.(Se Referanse 5 for mer detaljert informasjon). (C) og (E) ble tilpasset fra referanse 9 og referanse 5, henholdsvis, med tillatelser. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/55267/55267fig4.jpg" /> Figur 4. Directed hPSC Differensiering til glukose-responsive bukspyttkjertelen e-lignende celler. (A) Skjematisk av detaljert differensiering protokollen, med kjemikalier supplert på hvert stadium av differensiering. Signalveier som er aktivert eller hemmes i løpet av differensiering er uthevet i grønt eller rødt, henholdsvis. Tsjir: gsk3 inhibitor; GDF8: vekst differensiering faktor 8 eller myostatin, en TGF-beta protein familiemedlem; HH: Hedgehog; DE: Definitive endoderm; PP1:PDX1 + tidlig bukspyttkjertelen stamfar; PP2: PDX1 + NKX6.1 + senere bukspyttkjertelen stamfar. (B) Typisk konfluens (70 - 80%) av hPSCs 48 timer etter seeding når du er klar for differensiering innvielse. (C) Representative immunfluorescens farging bilder som viser vellykket differensiering på definitive endoderm (DE) stadium (FOXA2 og SOX17 co-farging), bukspyttkjertelen stamfar scenen (PP2: PDX1 og NKX6.1 co-farging), og glukose-responsive β- liknende celle trinn (NKX6.1 og c-peptid ko-farging). Generelt, for å oppnå mer enn 10% NKX6.1 + CPEP + -celler ved β-liknende cellestadiet, minst 75% FOXA2 + SOX17 + DE-celler og 40% PDX1 + NKX6.1 + PP2 celler kreves ved de tilsvarende faser. (D) Typisk morfologi av en celle-aggregatet ved S5 trinnet på en innsatsfiltermembranen i luft-væske-grensesnittet kultur. De overlevende celler har migrert til sentrum av den samlede (i mørke) og til venstre en aura-lignende struktur på kanten. (En </strong&gt;) og (D) ble tilpasset fra Reference 9 med tillatelser. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55267/55267fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> plasmid </td><td> Beløp </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-L </td><td> 5 mikrogram </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-R </td><td> 5 mikrogram </td></tr><tr><td> AAVS1-Puro-iCas9 </td><td> 40 mikrogram </td></tr><tr><td> AAVS1-Neo-M2rtTA </td><td> 40 mikrogram </td></tr></tbody></table> Tabell 1 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> primer </td><td> Sekvens </td></tr><tr><td>T7F </td><td> TAATACGACTCACTATAGGG </td></tr><tr><td> TracrR </td><td> AAAAGCACCGACTCGGTGCC </td></tr></tbody></table> Tabell 2 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Komponent </td><td> Beløp </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 35,5 mL </td></tr><tr><td> 5x PCR reaksjon buffer </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> dNTP mix (25 mm) </td><td> 0,5 mL </td></tr><tr><td> T7F (10 mm) </td><td> 1,25 mL </td></tr><tr><td> TracrR (10 mm) </td><td> 1,25 mL </td></tr><tr><td> T7-gRNA IVT mal (250 nM) </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> DNA-polymerase </td><td> 0,5 mL </td></tr><tr><td> Total PCR reaksjon mix </td><td> 50 mL </td></tr></tbody&gt; </table> Tabell 3 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4"> PCR sykkelforholdene </td></tr><tr><td> Cycle nummer </td><td> denaturering </td><td> anneal </td><td> Forlenge </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 94 ºC, 2 min </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-31 </td><td> 94 ºC, 20 s </td><td> 60 ºC, 20 s </td><td> 72 ºC, 1 min </td></tr><tr><td> 32 </td><td></td><td></td><td> 72 ºC, 2 min </td></tr></tbody></table> Tabell 4 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Komponent </td><td><strong&gt; Beløp </td></tr><tr><td> T7 ATP </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> T7 CTP </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> T7 GTP </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> T7 UTP </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> T7 10x buffer </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> T7 enzym mix </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> PCR forsterket mal </td><td> 8 mL </td></tr><tr><td> Total in vitro gRNA transkripsjon mix </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> Inkuber ved 37 ° C i 6 timer til over natten </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 5 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Komponent </td><td> Beløp (pl) </td></tr><tr><td> Urenset PCR produkt </td><td> 8 </td></tr&gt; <tr><td> Buffer 2 10x </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Destillert vann (dH 2 O) </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabell 6 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> DNA denaturering og hybridisering sykkelforhold </td></tr><tr><td> Temperatur </td><td> Varighet </td><td> termo forhold </td></tr><tr><td> 95 ° C </td><td> 10 min </td><td></td></tr><tr><td> 85 ° C </td><td> 1 minutt </td><td> Rampe til 85 ° C ved 2 ° C / S </td></tr><tr><td> 75 ° C </td><td> 1 minutt </td><td> Gradient til 75 ° C ved 0,3 ° C / s </td></tr><tr><td> 65 ° C </td><td> 1 minutt </td><td> Rampe til 65 ° C 0.3 ° C / S </td></tr><tr><td> 55 ° C &lt;/ Td&gt; <td> 1 minutt </td><td> Gradient til 55 ° C ved 0,3 ° C / s </td></tr><tr><td> 45 ° C </td><td> 1 minutt </td><td> Gradient til 45 ° C ved 0,3 ° C / s </td></tr><tr><td> 35 ° C </td><td> 1 minutt </td><td> Rampe til 35 ° C 0.3 ° C / S </td></tr><tr><td> 25 ° C </td><td> 1 minutt </td><td> Gradient til 25 ° C ved 0,3 ° C / s </td></tr><tr><td> 4 ° C </td><td> Holde </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 7 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Scene </td><td> Dag </td><td> Media </td><td> supplement </td><td></td></tr><tr><td rowspan="3"> S1 </td><td> d0 </td><td> S1 </td><td> GDF8 100 ng / mL </td><td> Tsjir-99021 3 mikrometer </td></tr><tr><td> d1 </td><td> S1 </td><td> GDF8 100 ng / mL </td><td> Tsjir-99021 0,3 mikrometer </td></tr><tr><td> d2 </td><td> S1 </td><td> GDF8 100 ng / mL </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> S1 media: MCDB 131 + 1x L-glutamin supplement + 0,5% BSA + 1,5 g / l NaHCO3 + 10 mM glukose </td></tr></tbody></table> Tabell 8 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Scene </td><td> Dag </td><td> Media </td><td colspan="8"> supplement </td></tr><tr><td> S2 </td><td> d3-d4 </td><td> S1 </td><td> LAA 0,25 mM </td><td> FGF7 50 ng / ml </td><td> IWP-2 2,5 mikrometer </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td&gt; S3 </td><td> d5-d6 </td><td> S3 </td><td> LAA 0,25 mM </td><td> FGF7 50 ng / ml </td><td> SANT-en 0,25 mikrometer </td><td> RA 1 mikrometer </td><td> LDN 100 nM </td><td> TPB 200 nM </td><td> ITS-X 1: 200 </td><td></td></tr><tr><td> S4 </td><td> d7-d9 </td><td> S3 </td><td> LAA 0,25 mM </td><td> FGF7 2 ng / ml </td><td> SANT-en 0,25 mikrometer </td><td> RA 0,1 mikrometer </td><td> LDN 200 nM </td><td> TPB 100 nM </td><td> ITS-X 1: 200 </td><td> IWP-2 2,5 mikrometer </td></tr><tr><td colspan="11"> S3 media: MCDB 131 + 1 x L-glutamin supplement + 2% BSA + 2,5 g / l NaHCO3 + 10 mM Glukose </td></tr></tbody></table> Tabell 9 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-side = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Scene </td><td> Dag </td><td> Media </td><td colspan="8"> supplement </td></tr><tr><td> S5 </td><td> d10-d12 </td><td> S5 </td><td> T3 1fiM </td><td> ALK5i II 10 mm </td><td> Sant-en 0,25 mikrometer </td><td> RA 0,05 mikrometer </td><td> LDN 100 nM </td><td> ITS-X 1: 200 </td><td> ZnSO4 10 mm </td><td> Heparin 10 ug / mL </td></tr><tr><td> S6 </td><td> D13-s d19 </td><td> S5 </td><td> T3 1fiM </td><td> ALK5i II 10 mm </td><td> GSiXX 100 nM </td><td></td><td> LDN 100 nM </td><td> ITS-X 1: 200 </td><td> ZnSO4 10 mm </td><td> Heparin 10 ug / mL </td></tr><tr><td> S7 </td><td> d20- D33 </td><td> S5 </td><td> T3 1fiM </td><td> ALK5i II 10 mm </td><td> N-Cys 1mM </td><td> Trolox 10 mm </td><td> R428 2 mikrometer </td&gt; <td> ITS-X 1: 200 </td><td> ZnSO4 10 mm </td><td> Heparin 10 ug / mL </td></tr><tr><td colspan="11"> S5 media: Blar + 1x L-glutamin supplement + 2% BSA + 1,5 g / l NaHCO3 + 20 mM glukose </td></tr></tbody></table> Tabell 10

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development at JoVE.com

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Protokoller for å generere hPSC mutant linjer ved hjelp av iCRISPR plattform og å skille hPSCs til glukose-responsive e-lignende celler er beskrevet. Kombinere genom redigering teknologi med hPSC rettet differensiering gir en kraftig plattform for systematisk analyse av rollen avstamning determinants i menneskelig utvikling og progresjon av sykdommen.

Genome Redigering og Regissert Differensiering av hPSCs for Henting Lineage Determinanter i Human bukspyttkjertelen Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Research

JoVE Journal

Genetics

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En Standard metode for å undersøke stedet genetisk virkning som en funksjon av punkt mutasjon reparasjon katalysert av CRISPR/Cas9 og SsODN i menneskeceller

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 protein i kanalen Gråsteinbit, Ictalurus punctatus, embryo for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Bfu genomet hele transkripsjon forfall i voksende og Quiescent menneskelig fibroblaster

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Neste generasjons sekvensering og bioinformatikk rørledning for å evaluere genetisk determinanter av konstitusjonelle sykdom

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Forbedret genomet redigering med Cas9 Ribonucleoprotein i ulike celler og organismer

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene redigering gjør betinget mutanter av menneskelig malariaparasitten P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediert genomet redigering av Human Fungal patogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genomet redigering i pattedyr linjer med CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transformasjon, Genova redigering og bestemmelse av fenotype av nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Karakterisering av In Vitro differensiering av humane primære keratinocytter ved RNA-Seq Analyse

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...