Name: a rapid filter insert-based 3d culture system for primary prostate cell differentiation
Uploaded: 2017-02-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי T32 (CA 9686-18) ו TL1 (TL1TR001431) פרסים מענק עבודת הפוסט דוקטורט (שעון מקומי), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) וכן U01 PAR-12-095 (קומאר) ו P30 CA051008-21 (ויינר). קיבעון לדוגמא, חתך מכתים בוצע היסטולוגיה במרכז לחקר הסרטן לומברדי מקיף ואת המשאב המשותף רקמות. אנו מודים ריצ&#39;רד שלגל לדיונים מועילים. התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או מכוני הבריאות הלאומיים.

1. הקמת תא 3D תרבות כנס מערכת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 2 מוסיף תרבית תאים פוליקרבונט אוריינטציה הפוכה (צד מסנן למעלה) מטה (איור 1 א) 6 גם צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח שכבה דקה של ג&#39;לטין 0.1% במים אל הצד התחתון של הכנס ולאפש?...

<ol>
	<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells.">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+reprogrammed+cells+to+identify+therapy+for+respiratory+papillomatosis.">Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis.</a> N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).</li><li>Signoretti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+is+a+prostate+basal+cell+marker+and+is+required+for+prostate+development.">p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).</li><li>Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+stem+cells.">Prostate cancer stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).</li><li>Ringer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+the+p53+tumor+suppressor+protein+bridges+the+apoptotic+and+autophagic+signaling+pathways+to+regulate+cell+death+in+prostate+cancer+cells.">The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).</li><li>Pollock, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone+analogues+induce+apoptosis+through+activation+of+p38+and+the+stress+response+pathway+in+cancer+cell+lines+and+in+conditionally+reprogrammed+primary+prostate+cancer+cells.">Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).</li><li>Crogliom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogs+of+the+Novel+Phytohormone,+Strigolactone,+Trigger+Apoptosis+and+Synergy+with+PARP1+Inhibitors+by+Inducing+DNA+Damage+and+Inhibiting+DNA+Repair.">Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Drug+Testing+of+Patient-derived+Conditionally+Reprogrammed+Cells+from+Castration-resistant+Prostate+Cancer.">Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer.</a> Eur Urol. , (2016).</li><li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor(s)+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells.">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li><li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks.">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> J Vis Exp. (99), e52868 (2015).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li></ol>

שורות תאים ראשיות הן פלטפורמה חשובה המתפתחת במהירות לחקר הסרטן. מערכת תרבות 3D תרבות מבוססת כנס תומכת הבידול של CRCs ערמונית העיקרי בתוך פרק זמן של שבועות. השיטה המסננת CRC מייצגת שיטת תפוקה חדשה, בינונית למחקר ערמונית. מודלי העכבר PDX קיימים הם זמן רב ויקר מאוד, ורבי דגימו?...

זיהוי והשימוש של טיפולים בסרטן שמותאם אנשים הם יעד מרכזי בחקר הסרטן. לאחרונה, גישות חדשות פותחו המאפשרות ביתר קל בהקמה בתרביות תאים ראשוניות, פוטנציאל לספק דרכים של שניהם זיהוי ובדיקת טיפולים אישית. לדוגמא, הערמונית מבוססת R-spondin גישת organoid 1 מאפשרת תלת ממדי (3D) culturing של תאי סרטן הערמונית נורמלים גרורתי בתוך תאי מטריקס מסחריים (למשל, Matrigel), בעוד Reprogramming המותנה של תאים (CRC) שיטה 2 שפותח בג&#39;ורג&#39;טאון, 3 מנצל תנאי תרבות 2D סטנדרטיים יותר. באופן ספציפי, השילוב של מעכבי קינאז Rho (Y-27632) ותאי מזין פיברובלסטים murine J2 מוקרן להוביל culturing בלתי מוגדר של CRCs keratinocyte 2. המתודולוגיה CRC היאמאוד חזק, עם שורות תאים ראשוניות הוקמו בהצלחה ומתוחזק ללא הגבלה זמן מהערמונית ורקמות אפיתל רגילות וממאירים רבים אחרות 3. חשוב לציין, טכנולוגית CRC שלנו מוותר עבור זיהוי המהיר של הבסיס אטיולוגי עבור papillomatosis נשימתיים חוזר אצל חולה אשר נכשל מספר הטיפולים התרופתיים קודמים. בנוסף, באמצעות CRCs נורמלי הנגזרות הגידול, זיהוי מוצלח של ה- FDA אישר תרופה, vorinostat, נעשתה תוך שבועיים מיום ביופסיה רקמות הראשונית. החולה הונח על vorinostat, וכתוצאה מכך הטיפול המוצלח של המחלה שלהם 4. בלוטת הערמונית הנורמלית מורכבת הלומינל, הבזליים ותאי נוירואנדוקריניים הנדירים 5. תאי לומינל מהווים את שכבת האפיתל העמודים של הבלוטה ולהביע לקולטן האנדרוגן (AR), כמו גם סמנים לומינל אחרים כגון cytokeratins 8 ו -18 ופרוהמדינה אנטיגן ספציפי (PSA) 6. לעומת זאת, תאי הבזליים הם נקודות מתחת לשכבת לומינל ולהביע cytokeratin 5 ו p63, אבל רמות נמוכות של AR 5. אנחנו 7, 8, 9 ואחרים 10 השתמשו בהצלחה CRCs הערמונית בחקירות רגישות לתרופה מכניסטית פרה-קליניים. עם זאת, כאשר גדל בתנאים בתרבית רקמה 2D רגיל, תאים אלה אינם לגמרי לעסוק AR איתות 10. חשוב לציין, כאשר הניח תחת הקפסולה הכליות של עכברי immunodeficient, את CRCs שהעלה אדריכלות בלוטות נורמלית ערמונית ותפקוד מציין CRCs הערמונית לשמור שושלת מחויבותם כאשר הניח סביבת מתירנית. ההתפתחות של מסנן מערכת תרבית תאים להכניס המבוססת המתואר כאן מאפשרת המהירים (2 שבועות) במבחנת בידול של CRCs ערמונית כמו ב שמעידy הביטוי המוגבר של גני מטרת AR ו AR וכן הירידה ברמות של p63. המחדיר המסנן הנמצא מכיל ממברנות פוליקרבונט (גודל נקבובי, 0.4 מיקרומטר) שיכול לתמוך culturing של בתאי יונקים. המערכת, שפותחה על, עושה שימוש CRCs ערמונית נורמלי וממאירים, 6 מנות תרבות היטב המחדירה המסנן. תרבית תאי תקשורת מותנית תאי J2 11 מושם בתקשורת ההבחנה קאמרית ערמונית התחתונה בתא העליון. הטכניקות המתוארות במסמך זה לתמוך התמיינות תאים luminal הערמונית בתוך פרק זמן 2 בשבוע, עולה בקנה אחד עם המטרות של רפואה אישית. זה היה גם הכרחי כדי לפתח מתודולוגיות המאפשרים פרופיל מולקולרי, גנטי ותאי המקיף של התרבויות. גישות לבידוד DNA, RNA וחלבון מתאי שוחרר מפני השטח המסנן פותחו יעיל לעיבוד מדגם חוזר מדויקת. פינהlly, המתודולוגיה הנדרשת להסרת המסנן כדי לאפשר הטמעה, חתך עבור H &amp; E, immunohistochemical מכתים immunofluorescent, מתואר באופן מלא.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Corning Costar Snapwell Culture Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3801</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PIHP01250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 Well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin 0.1% in water</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7903</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Saftey Scapel 10 Blade</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Standard Scalpel 11 Blade</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4411</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Fishcer Scientific</td>
			<td>S299-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Vanadate</td>
			<td>Fishcer Scientific</td>
			<td>13721-39-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3483123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12 Nutrient Mix Media</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11765054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-270-333-M025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PHG0315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12585-014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15710-064</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP264550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Adherent Dressing</td>
			<td>Telfa</td>
			<td>KDL2132Z</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SIAL0167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>CG-M492</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid filter insert-based 3d culture system for primary prostate cell differentiation

תאים לתכנות מחדש מותנה (CRCs) לספק שיטת קיימא עבור תרבית תאים ראשונית ואת היכולת לפתח &quot;biobanks חיים&quot; הנרחב של שורות תאים שמקורם בחולה. עבור סוגים רבים של תאי אפיתל, שונות תלת ממדים (3D) גישות התרבות תואר התומכים מדינת בדיל השתפרה. בעוד CRCs לשמור מחויבות השושלת שלהם לרקמה שממנו הם מבודדים, הם לא מצליחים לבטא רבים של סמנים בידול הקשורים רקמות ממוצא כאשר גדל תחת נורמלי שני התנאים תרבות מימדי (2D). כדי לשפר את היישום של CRCs נגזרות החולות למחקר סרטן הערמונית, פורמט תרבות 3D הוגדר המאפשר בידול תא מהיר (2 שבועות סה&quot;כ) לומינל בשני נורמלי גידולים שמקורם בתאי האפיתל ערמונית. בזאת, פורמט מבוסס כנס מסנן מתואר עבור culturing וההבחנה של שני CRCs ערמונית הנורמלי וממאירים. דהתיאור זנב של ההליכים הנדרשים לצורך איסוף תאים ועיבוד מכתים immunohistochemical ו immunofluorescent מסופקים. קולקטיבי בפורמט תרבות 3D תאר, בשילוב עם קווי CRC העיקריים, מספק בינוני חשוב גבוהה מערכת מודל תפוקה למחקר ערמונית מבוססת biospecimen.

את כנס תרבית תאי המערכת המבוססת היא הליך יחסי פשוט ומהיר להפקת תרבויות 3D של CRCs הערמונית שתומך התמיינות תאי luminal. סכמטי של המערכת מוצג (איור 1 א) המדגיש את היישום של ציפוי ג&#39;לטין על פני השטח התחתונים של להכניס המסנן. המחדיר הפוך רק עבור היישו?...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation at JoVE.com

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

מסנן ראפיד הכנס מבוססת מערכת 3D תרבות התמיינות תאי ערמונית ראשית

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

פרוטוקול תרבית תאי ראפיד פוסט מורטם של Glioma Pontine המפוזר העצמותי (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

הקמתה של תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

טיפול בדיקות במודל תרבות המבוסס ספרואיד Cell תלת-ממד עבור קרצינומה של תאים קשקשיים בצוואר ואחראי

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

וירוס משלוח של מדריכים CRISPR הערמונית מאתר עבור שינוי גנטי

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

תא תלת-ממדי מערכת תרבות עבור הלומדים הפלישה והערכת הרפוי בסרטן שלפוחית השתן

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

זיהוי ואפיון היסטולוגית, דיסקציה של האונות הערמונית עכבר במודלים תרבות חוץ גופית ספרואיד תלת-ממד

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

תלת מימדי הרתי תרבות מערכת לייצר Murine המושרה תא גזע Pluripotent-הגידול הנגזר אנטיגן-מהגרים ספציפיים הרתי

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

הדור המהיר של משפחת מלנוציט הראשית והתרבויות בפיברובלסט

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

הבידול של השד העכבר האפיתל HC11 ו EpH4 תאים

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...