Name: mammalian cell encapsulation in alginate beads using a simple stirred vessel
Uploaded: 2017-06-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel at JoVE.com

Vi takker Jill Osborne for hendes grundlægning på emulgeringsprocessen og Lauren Wilkinson for teknisk support. Vi takker Dr. Igor Laçik, Dr. Timothy J. Kieffer og Dr. James D. Johnson for deres input og samarbejde. Vi takker Diabète Québec, JDRF, ThéCell, Centre québécois sur les matériaux fonctionnels (CQMF), Det Naturvidenskabelige og Tekniske Forskningsråd (NSERC), Center for Human Islet Transplantation og Beta-Cell Regeneration, Det Canadiske Stamcelle Netværk, Michael Smith Stiftelsen for Sundhedsforskning, Le Fonds Québécois de la recherche sur la nature et les technologies og COST 865 til økonomisk støtte.

1. Forbered Alginatopløsningen, CaCO3-suspensionen og den syrnede olie <ol><li> Forbered procesbufferen og mediumet. <ol><li> Forbered den typiske procesbuffer, der anvendes til at generere højkoncentrationsalginatperler ved anvendelse af 10 mM HEPES, 170 mM NaCl. Juster pH til 7,4. </li><li> Forbered det typiske dyrkningsmedium under anvendelse af Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 6 mM glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin...

Forskellige trin (afbildet i figur 2 ) under den interne geleringsreaktion kan begrænse den samlede kinetik. For kalciumcarbonatkorn større end ~ 2,5 μm har hastigheden af ​​carbonatopløsning vist sig at være hastighedsbegrænsende 26 , 44 . Syringstrinnet, der fører til intern calciumfrigivelse, har også vist sig at være den kritiske procesvariabel, der påvirker celleoverlevelse 32 . De betingelser, der før...

Mammalcelleindkapsling er bredt undersøgt som et middel til at beskytte transplanterede celler mod immunafstødning 1 eller for at tilvejebringe en tredimensionel støtte til immobiliseret cellekultur 2 , 3 , 4 . Indkapsling af pancreasøer i alginatperler har været anvendt til at reversere diabetes i allogene 5 , 6 eller xenogene 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 gnavere. Prækliniske og kliniske forsøg med indkapslet pankreatisk øletransplantation til behandling af type 1 diabetes er løbende 13 , 14 , 15 . Til transplantationsapplikationer eller større skalE in vitro immobiliseret celleproduktion anvendes dysebaserede perlegeneratorer generelt. Typisk pumpes en blanding af alginat og celler gennem en dyse for at danne dråber, der falder ind i en omrørt opløsning indeholdende divalente kationer, hvilket resulterer i den ydre gelering af dråberne. Koaksial gasstrøm 16 , 17 , dysevibration 18 , elektrostatisk afstødning 19 eller roterende ledninger 20 letter dråbeformation ved dysespidsen. De væsentligste ulemper ved konventionelle perlegeneratorer er deres begrænsede gennemstrømning og det begrænsede interval af opløsningsviskositeter, som vil resultere i tilstrækkelig perledannelse 21 . Ved høje strømningshastigheder bryder væsken ud af dysen op i dråber, der er mindre end dysediameteren, hvilket reducerer størrelsesstyringen. Multi-dyse perle generatorer kan bruges til at øge gennemstrømningen, menDen ensartede fordeling af strømmen mellem dyserne og brugen af ​​opløsninger&gt; 0,2 Pas er problematisk 22 . Endelig forventes alle dysebaserede anordninger at medføre nogen skade på øerne, da diameteren af ​​de anvendte dyser er mellem 100 μm og 500 μm, mens ~ 15% af menneskelige holme kan være større end 200 μm 23 . I denne video beskriver vi en alternativ metode til indkapsling af pattedyrceller ved at danne dråber i et enkelt emulgeringstrin i stedet for drop-by-drop. Da perleproduktionen udføres i en simpel omrørt beholder, er metoden egnet til små (~ 1 ml) til storskala (10 3 L række) perleproduktion med lave udstyrsomkostninger 24 . Denne metode tillader fremstilling af perler med høj sfæricitet ved anvendelse af en bred vifte af alginatviskositeter med korte ( f.eks. 20 min) perlegenereringstider. Denne metode blev oprindeligt udviklet af Poncelet et al. 25 , 26 og anvendes til at immobilisere DNA 27 , proteiner 28 inklusiv insulin 29 og bakterier 30 . Vi har for nylig tilpasset disse metoder til indkapslingen af ​​pattedyrsceller under anvendelse af pancreas-beta-cellelinier 31 , 32 og primært pankreasvæv 32 . Princippet med metoden er at frembringe en vand-i-olie emulsion bestående af alginatdråber i mineralolie efterfulgt af intern gelering af alginatdråberne ( figur 1 ). Først dispergeres indkapslingsmiddelet ( f.eks. Celler) i en alginatopløsning indeholdende et fint korncalciumsalt med lav opløselighed ved den indledende proces pH. Alginatblandingen tilsættes derefter til en omrørt organisk fase for at danne en emulsion, sædvanligvis i nærværelse af aoverfladeaktivt middel. I tilfælde af pattedyrcelleindkapsling kan komponenter, der er til stede i serum, fungere som overfladeaktive midler. Dernæst reduceres pH for at solubilisere calciumsaltet ved tilsætning af en olieopløselig syre, som skiller sig ind i vandfasen. Eddikesyre, med en partikelkoefficient på mineralolie / vand &lt;0,005 33 , skal foropløses i olie, tilsættes derefter til emulsionen, hvor den blandes i oliefasen og hurtigt skiller sig ind i vandfasen 34 . Figur 2 illustrerer de kemiske reaktioner og diffusion, som finder sted under forsurende og indre geleringstrin. Endelig gendannes de indkapslede celler ved faseinversion, faseseparation accelereret ved centrifugering, gentagne vaskningstrin og filtrering. Disse trin kan derefter efterfølges af perle- og celleprøvetagning til kvalitetskontrolanalyser, in vitro cellekultur og / eller transplantation af de indkapslede celler. Figur 1: Skematisk af emulgeringsbaseret proces til indkapsling af pattedyrsceller. Perler fremstilles først ved at emulgere en alginat-, celle- og CaCO3-blanding i mineralolie (trin 1 og 2 i skematisk), der udløser intern gelering ved tilsætning af eddikesyre (trin 3). De gelerede perler adskilles derefter fra olien ved tilsætning af en vandig buffer til udløsningsfaseinversion (trin 4) efterfulgt af centrifugering og oliesugning (trin 5) og derefter filtrering (trin 6). Endelig overføres perlerne opsamlet på filteret til cellekulturmedium til in vitro- kultur eller til transplantation. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <imgAlt = &quot;Figur 2&quot; class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55280 / 55280fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2: Reaktioner og diffusionstrin, der forekommer under intern gelering. (1) Eddikesyre tilsættes til den organiske fase og transporteres til alginatdråberne ved konvektion. (2) Eddikesyren fordeler sig i vandfasen. (3) I nærvær af vand dissocierer og diffuserer syren til opnåelse af CaCO3-kornene afbildet i mørkeblå. (4) H + -ionerne udveksles med Ca2 + -ionerne i CaC03, idet Ca2 + -ioner frigives. (5) Calciumionerne diffunderer, indtil de rammer uomsat alginat, hvilket fører til ionotrop krydsbinding af alginatkæderne. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> I modsætning til konventionelle dysebaserede celleindkapslere er en bred perlestørrelsesfordeling eksponeretCted fra denne proces på grund af dråbeformationsmekanismen i omrørt emulgering. For en delmængde af applikationer kan denne perlestørrelsesfordeling være problematisk. For eksempel kan en større del af celler eksponeres ved perleoverfladen i mindre perler. Hvis næringsstofbegrænsninger ( f.eks. Ilt) er en bekymring, kan disse begrænsninger forværres i større perler. En fordel ved den omrørte emulgeringsfremgangsmåde er, at den gennemsnitlige vulststørrelse let kan justeres ved at ændre omrøringshastigheden under emulgeringstrinnet. Breddsstørrelsesfordelingen kan også udnyttes til at studere effekten af ​​perleformat på indkapslet celleydelse. Mammalcelleindkapsling ved emulgering og intern gelering er et interessant alternativ til laboratorier, der ikke er udstyret med en vulstgenerator. Desuden giver denne metode brugerne mulighed for at reducere behandlingstiden eller generere perler ved meget lav eller meget høj alginatkoncentreringtioner. Protokollen beskrevet nedenfor beskriver, hvordan man indkapsler celler i 10,5 ml 5% alginatopløsning fremstillet i 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) buffer. Alginatet består af en 50:50 blanding af transplantationskvalitet LVM (lavviskositetshøjt mannuronsyreindhold) og MVG (middelviskositetshøj guluronsyreindhold) alginat. Calciumcarbonat i en slutkoncentration på 24 mM anvendes som det fysiske tværbindingsmiddel. Let mineralolie udgør den organiske fase, medens eddikesyre anvendes til at syrne emulsionen og udløse intern gelering. Imidlertid afhænger alginat typen og sammensætningen såvel som den valgte procespuffer af den ønskede anvendelse 32 . En række alginattyper (se tabel over materialer) er blevet anvendt til fremstilling af perler med denne protokol.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="990">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Reagents and consumables</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">LVM alginate (transplantation-grade)</td>
			<td style="width:164px;">Novamatrix</td>
			<td style="width:223px;">Non-applicable</td>
			<td style="width:348px;">Referred to as &#34;alginate #1&#34; in the results.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">MVG alginate (transplantation-grade)</td>
			<td style="width:164px;">Novamatrix</td>
			<td style="width:223px;">Non-applicable</td>
			<td style="width:348px;">Referred to as &#34;alginate #2&#34; in the results.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Alginate (cell culture-grade)</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity)</td>
			<td style="width:348px;">A2033 is referred to as &#34;alginate #3&#34; in the results.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">DMEM</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:223px;">11995-065</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">SH3039603</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Glutamine</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:223px;">25030</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">P4333-100ML</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">HEPES, cell culture tested</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">H4034-100G</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">NaCl</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">S271-1</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:256px;">Fine-grain CaCO3</td>
			<td style="width:164px;">Avantor Materials</td>
			<td style="width:223px;">1301-01</td>
			<td style="width:348px;">After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Light mineral oil</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">O121-4</td>
			<td style="width:348px;">Sterile filter through a 0.22 &#956;m pore size membrane prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">A38-500</td>
			<td style="width:348px;">Handle with caution: refer to MSDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Sterile spatulas</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">CLS3004-100EA</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sterile nylon cell strainers, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">08-771-1</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)</td>
			<td style="width:164px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:223px;">86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:223px;">14673-043</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Toluidine Blue-O</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">T3260</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Equipment</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:256px;">100 mL microcarrier spinner flasks</td>
			<td style="width:164px;">Bellco</td>
			<td style="width:223px;">1965-00100</td>
			<td style="width:348px;">The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Magnetic stir plate with adjustable speed</td>
			<td style="width:164px;">Bellco</td>
			<td style="width:223px;">7760-06005</td>
			<td style="width:348px;">The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:256px;">Cell counter</td>
			<td style="width:164px;">Innovatis</td>
			<td style="width:223px;">Cedex AS20</td>
			<td style="width:348px;">This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">LED light box</td>
			<td style="width:164px;">Artograph</td>
			<td style="width:223px;">LightPad&#174; PRO</td>
			<td style="width:348px;">This item can be replaced by other types of illuminators.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:256px;">Handheld camera</td>
			<td style="width:164px;">Canon</td>
			<td style="width:223px;">PowerShot A590 IS</td>
			<td style="width:348px;">A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:256px;">Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters</td>
			<td style="width:164px;">Olympus</td>
			<td style="width:223px;">IX81</td>
			<td style="width:348px;">Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Image aquisition software</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:223px;">Metamorph</td>
			<td style="width:348px;">A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Image analysis freeware</td>
			<td style="width:164px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:223px;">Non-applicable</td>
			<td style="width:348px;">A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammalian cell encapsulation in alginate beads using a simple stirred vessel

Celleindkapsling i alginatperler er blevet anvendt til immobiliseret cellekultur in vitro såvel som til immunoisolering in vivo . Indkapsling af pancreasøerne er blevet undersøgt i vid udstrækning som et middel til at øge overlevelsen af ​​øerne i allogene eller xenogene transplantater. Alginatindkapsling opnås almindeligvis ved dyseekstrudering og ydre gelering. Ved anvendelse af denne metode falder celleholdige alginatdråber dannet ved spidsen af ​​dyser i en opløsning indeholdende divalente kationer, der forårsager ionotrop alginat gelering, da de diffunderer ind i dråberne. Kravet om dannelse af dråber ved dysespidsen begrænser den volumetriske gennemstrømning og alginatkoncentration, der kan opnås. Denne video beskriver en skalerbar emulgeringsfremgangsmåde til indkapsling af pattedyrceller i 0,5% til 10% alginat med 70% til 90% celleoverlevelse. Ved denne alternative fremgangsmåde emulgeres alginatdråber indeholdende celler og calciumcarbonat i mineralolie, folNedsat ved et fald i pH, hvilket fører til intern calciumfrigivelse og ionotrop alginat gelering. Den nuværende metode tillader fremstilling af alginatperler inden for 20 minutter emulgering. Det udstyr, der kræves til indkapslingstrinnet, består i enkle omrørte beholdere til rådighed for de fleste laboratorier.

<html> Ved afslutningen af ​​emulgerings- og intern geleringsprocessen bør et vulstvolumen svarende til det oprindelige alginat og celleblandingsvolumen genvindes. Perlerne skal være meget sfæriske med få defekter ( figur 3 ). Perlerne skal være tilstrækkeligt stærke til at modstå pipettering gennem storboringspipetter. Ved høje alginatkoncentrationer kan indkapslede olie- eller luftdråber observeres i perlerne. Dette skyldes sandsynligvis på g...

Watch this Scientific Journal Video about Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel at JoVE.com

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Denne video og manuskript beskriver en emulsionsbaseret fremgangsmåde til indkapsling af pattedyrsceller i 0,5% til 10% alginatperler, der kan fremstilles i store batcher under anvendelse af en simpel omrørt beholder. De indkapslede celler kan dyrkes in vitro eller transplanteres til cellulære terapiapplikationer.

Mammalcelleindkapsling i alginatperler ved hjælp af et enkelt omrørt skib

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat mikrokapselsammensætning som en 3D-platform for Formering og differentiering af humane embryonale stamceller (embryonale) til forskellige linier

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Overvågning af Wall Mekanik Under Stent Deployment i en beholder

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

High Throughput Enkelt-celle og Multiple-celle mikroindkapsling

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

En ny metode til lokalisering Reporter fluorescerende kugler nærheden cellekulturen overflade for trækkraft Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Dyrkning af pattedvrceller hjælp af en enkelt brug Pneumatic bioreaktorsystem

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Lagdelte alginat konstruktioner: En platform for Co-kultur af Heterogene Cell populationer

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Power Input målinger i Stirred bioreaktorer på laboratoriet skala

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...