Name: mammalian cell encapsulation in alginate beads using a simple stirred vessel
Uploaded: 2017-06-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel at JoVE.com

Vi takker Jill Osborne for sitt grunnleggingsarbeid på emulgeringsprosessen og Lauren Wilkinson for teknisk støtte. Vi takker Dr. Igor Laçik, Dr. Timothy J. Kieffer og Dr. James D. Johnson for deres innspill og samarbeid. Vi takker Diabète Québec, JDRF, ThéCell, Centre québécois sur les matériaux fonctionnels (CQMF), Forskningsrådet for naturvitenskap og ingeniørvitenskap (NSERC), Senter for human isletransplantasjon og betacelleregenerering, det kanadiske stamcelleverket, den Michael Smith Foundation for helseforskning, le Fonds québécois de la recherche sur la nature et les teknologier og COST 865 for økonomisk støtte.

1. Forbered Alginate Solution, CaCO 3 Suspension og Syret Olje <ol><li> Forbered prosessbufferen og mediumet. <ol><li> Forbered den typiske prosessbufferen som brukes til å generere høykonsentrasjonsalginatperler ved bruk av 10 mM HEPES, 170 mM NaCl. Juster pH til 7,4. </li><li> Forbered det typiske dyrkingsmediet ved bruk av Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) som inneholder 10% føtalt bovint serum (FBS), 6 mM glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin. </li></o...

Ulike trinn (vist i figur 2 ) under den interne geleringsreaksjonen kan begrense den totale kinetikken. For kalsiumkarbonatkorn større enn ~ 2,5 μm, har karbonatoppløsningen vist seg å være begrensningsbegrensende 26 , 44 . Syringstrinnet som fører til intern kalsiumfrigivelse har også vist seg å være den kritiske prosessvariabel som påvirker celleoverlevelse 32 . Betingelsene som fører til intern gelering er d...

Mammalcelleinnkapsling har blitt bredt studert som et middel for å beskytte transplanterte celler fra immunavstøtning 1 eller for å gi en tredimensjonal støtte for immobilisert cellekultur 2 , 3 , 4 . Bukspyttkjertelinnkapsling i alginatperler har blitt brukt til å reversere diabetes i allogene 5 , 6 eller xenogene 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 gnagere. Prækliniske og kliniske studier av innkapslet pankreas-øktransplantasjon for å behandle type 1-diabetes pågår 13 , 14 , 15 . For transplantasjonsapplikasjoner eller større skalEn in vitro immobilisert celleproduksjon, dysebaserte perlegeneratorer, blir generelt brukt. Vanligvis pumpes en blanding av alginat og celler gjennom en dyse for å danne dråper som faller i en omrørt oppløsning inneholdende divalente kationer, noe som resulterer i den eksterne gelering av dråpene. Koaksialgasstrømmen 16 , 17 , dysevibrering 18 , elektrostatisk avstøtning 19 eller roterende ledninger 20 letter dråpedannelse ved dysespissen. De viktigste ulempene ved konvensjonelle vulstgeneratorer er deres begrensede gjennomstrømning og det begrensede området av løsningsviskositeter som vil resultere i tilstrekkelig perleformasjon 21 . Ved høye strømningshastigheter bryter væsken som kommer ut av dysen opp i dråper som er mindre enn dysediameteren, og reduserer størrelsesreguleringen. Multi-nozzle bead generatorer kan brukes til å øke gjennomstrømningen, menDen ensartede fordeling av strømmen mellom dysene og bruken av løsninger&gt; 0.2 Pas er problematisk 22 . Til slutt forventes alle dysebaserte enheter å forårsake noen skade på øyer, siden diameteren av dysene som brukes er mellom 100 μm og 500 μm, mens ~ 15% av menneskelige øyer kan være større enn 200 μm 23 . I denne videoen beskriver vi en alternativ metode for innkapsling av pattedyrceller ved å danne dråper i et enkelt emulgeringstrinn i stedet for drop-by-drop. Siden beadproduksjonen utføres i et enkelt omrørt kar, er metoden egnet for liten (~ 1 ml) til storskala (10 3 L-serie) perleproduksjon med lave utstyrskostnader 24 . Denne metoden tillater fremstilling av perler med høy sfærisk form ved bruk av et bredt spekter av alginatviskositeter med korte ( f.eks. 20 min) perlegenereringstider. Denne metoden ble opprinnelig utviklet av Poncelet et al. 25 , 26 og pleide å immobilisere DNA 27 , proteiner 28 innbefattende insulin 29 og bakterier 30 . Vi har nylig tilpasset disse metodene til innkapslingen av pattedyrceller ved bruk av pankreas-betacellelinjer 31 , 32 og primær pankreasvev 32 . Prinsippet med metoden er å danne en vann-i-olje emulsjon bestående av alginatdråper i mineralolje, etterfulgt av intern gelering av alginatdråper ( figur 1 ). Først blir inkapslingsmiddelet ( f.eks. Celler) dispergert i en alginatoppløsning inneholdende et fint kornkalsiumsalt med lav oppløselighet ved den første prosess-pH. Alginatblandingen blir så tilsatt til en omrørt organisk fase for å danne en emulsjon, vanligvis i nærvær av aoverflateaktivt middel. I tilfelle av pattedyrcellekapsling kan komponenter som er tilstede i serum virke som overflateaktive midler. Deretter reduseres pH for å oppløseliggjøre kalsiumsaltet ved å tilsette en oljeoppløselig syre som skiller seg i vannfasen. Eddiksyre, med en mineralolje / vann-partisjonskoeffisient &lt;0,005 33 , bør foroppløses i olje, deretter tilsatt emulsjonen hvor den blandes i oljefasen og skiller seg raskt i vannfasen 34 . Figur 2 illustrerer de kjemiske reaksjonene og diffusjonen som finner sted under forsurende og indre geleringstrinn. Til slutt utvinnes de innkapslede celler ved faseinversjon, faseseparasjon akselerert ved sentrifugering, gjentatte vaske-trinn og filtrering. Disse trinnene kan deretter følges av perle- og celleprøvetaking for kvalitetskontrollanalyser, in vitro- cellekultur og / eller transplantasjon av de innkapslede celler. Figur 1: Skjematisk av emulgeringsbasert prosess for innkapsling av pattedyrceller. Perler fremstilles først ved å emulgere en alginat, celle og CaCO3-blanding i mineralolje (trinn 1 og 2 i skjematisk), utløsende intern gelering ved å tilsette eddiksyre (trinn 3). De gelerte perler separeres deretter fra oljen ved å tilsette en vandig buffer for å utløse faseinversjon (trinn 4), etterfulgt av sentrifugering og olje-aspirering (trinn 5) og deretter filtrering (trinn 6). Til slutt overføres perlene oppsamlet på filteret til cellekulturmedium for in vitro- kultur eller transplantasjon. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <imgAlt = &quot;Figur 2&quot; class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55280 / 55280fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2: Reaksjoner og diffusjonstrinn som oppstår under intern gelering. (1) Eddiksyre tilsettes til den organiske fasen og transporteres til alginatdråpene ved konveksjon. (2) Eddiksyre fordeler seg i vannfasen. (3) I nærvær av vann dissocierer og diffuserer syren for å nå CaCO 3- kornene som er avbildet i mørk blå. (4) H + -jonene utveksles med Ca2 + -ioner i CaCO3, frigjør Ca2 + -ioner. (5) Kalsiumioner diffunderer til de møter uomsatt alginat, som fører til ionotrop kryssbinding av alginatkjedene. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> I motsetning til konvensjonelle dysebaserte celleinnkapslere er en bred perlestørrelsesfordeling eksponertCted fra denne prosessen på grunn av mekanismen for dråpedannelse i omrørt emulgering. For en delmengde av applikasjoner, kan denne perlestørrelsesfordelingen være problematisk. For eksempel kan en større brøkdel av celler bli eksponert ved vulstoverflaten i mindre perler. Hvis næringsstoffer ( f.eks. Oksygen) begrensninger er en bekymring, kan disse begrensningene forverres i større perler. En fordel ved den omrørte emulgeringsmetode er at gjennomsnittlig vulststørrelse lett kan justeres ved å endre omrøringshastigheten under emulgeringstrinnet. Breddistribusjonsfordelingen kan også utnyttes for å studere effekten av perlestørrelse på innkapslet celleytelse. Mammalisk celleinnkapsling ved emulgering og intern gelering er et interessant alternativ for laboratorier som ikke er utstyrt med en vulstgenerator. Videre gir denne metoden brukere muligheten til å redusere behandlingstiden eller generere perler ved svært lav eller meget høy alginatkoncentreringasjon. Protokollen beskrevet nedenfor beskriver hvordan man skal innkapslere celler i 10,5 ml 5% alginatløsning fremstilt i 10 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) buffer. Alginatet består av en 50:50 blanding av transplantasjonskvalitet LVM (lav viskositet høy mannuronsyreinnhold) og MVG (medium viskositet høy guluronsyreinnhold) alginat. Kalsiumkarbonat i en sluttkonsentrasjon på 24 mM brukes som det fysiske tverrbindingsmiddel. Lett mineralolje utgjør den organiske fasen, mens eddiksyre brukes til å syre emulsjonen og utløse intern gelering. Imidlertid er alginatypen og -blandingen, så vel som den valgte prosessbuffer, avhengig av den ønskede anvendelse 32 . En rekke alginattyper (se tabell over materialer) har blitt brukt til å produsere perler med denne protokollen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="990">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Reagents and consumables</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">LVM alginate (transplantation-grade)</td>
			<td style="width:164px;">Novamatrix</td>
			<td style="width:223px;">Non-applicable</td>
			<td style="width:348px;">Referred to as &#34;alginate #1&#34; in the results.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">MVG alginate (transplantation-grade)</td>
			<td style="width:164px;">Novamatrix</td>
			<td style="width:223px;">Non-applicable</td>
			<td style="width:348px;">Referred to as &#34;alginate #2&#34; in the results.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Alginate (cell culture-grade)</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity)</td>
			<td style="width:348px;">A2033 is referred to as &#34;alginate #3&#34; in the results.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">DMEM</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:223px;">11995-065</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">SH3039603</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Glutamine</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:223px;">25030</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">P4333-100ML</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">HEPES, cell culture tested</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">H4034-100G</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">NaCl</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">S271-1</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:256px;">Fine-grain CaCO3</td>
			<td style="width:164px;">Avantor Materials</td>
			<td style="width:223px;">1301-01</td>
			<td style="width:348px;">After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Light mineral oil</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">O121-4</td>
			<td style="width:348px;">Sterile filter through a 0.22 &#956;m pore size membrane prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">A38-500</td>
			<td style="width:348px;">Handle with caution: refer to MSDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Sterile spatulas</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">CLS3004-100EA</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sterile nylon cell strainers, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">08-771-1</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)</td>
			<td style="width:164px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:223px;">86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:223px;">14673-043</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Toluidine Blue-O</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">T3260</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Equipment</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:256px;">100 mL microcarrier spinner flasks</td>
			<td style="width:164px;">Bellco</td>
			<td style="width:223px;">1965-00100</td>
			<td style="width:348px;">The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Magnetic stir plate with adjustable speed</td>
			<td style="width:164px;">Bellco</td>
			<td style="width:223px;">7760-06005</td>
			<td style="width:348px;">The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:256px;">Cell counter</td>
			<td style="width:164px;">Innovatis</td>
			<td style="width:223px;">Cedex AS20</td>
			<td style="width:348px;">This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">LED light box</td>
			<td style="width:164px;">Artograph</td>
			<td style="width:223px;">LightPad&#174; PRO</td>
			<td style="width:348px;">This item can be replaced by other types of illuminators.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:256px;">Handheld camera</td>
			<td style="width:164px;">Canon</td>
			<td style="width:223px;">PowerShot A590 IS</td>
			<td style="width:348px;">A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:256px;">Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters</td>
			<td style="width:164px;">Olympus</td>
			<td style="width:223px;">IX81</td>
			<td style="width:348px;">Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Image aquisition software</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:223px;">Metamorph</td>
			<td style="width:348px;">A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Image analysis freeware</td>
			<td style="width:164px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:223px;">Non-applicable</td>
			<td style="width:348px;">A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammalian cell encapsulation in alginate beads using a simple stirred vessel

Celleinnkapsling i alginatperler har vært brukt for immobilisert cellekultur in vitro, så vel som for immunoisolering in vivo . Innkapsling av bukspyttkjertelen er studert omfattende som et middel for å øke isletes overlevelse i allogene eller xenogene transplantasjoner. Algininkapsling oppnås vanligvis ved dyseekstrudering og ekstern gelering. Ved hjelp av denne metoden faller celleholdige alginatdråper dannet ved spissen av dyser inn i en løsning som inneholder divalente kationer som forårsaker ionotrop alginat gelering som de diffunderer i dråpene. Kravet på dråpeformasjon ved dysespissen begrenser volumetrisk gjennomstrømning og alginatkonsentrasjon som kan oppnås. Denne video beskriver en skalerbar emulgeringsmetode for å inkapslere pattedyrceller i 0,5% til 10% alginat med 70% til 90% celleoverlevelse. Ved denne alternative metode emulgeres alginatdråper inneholdende celler og kalsiumkarbonat i mineralolje, folSenket av en reduksjon i pH som fører til intern kalsiumfrigivelse og ionotrop alginat gelering. Den nåværende metoden tillater fremstilling av alginatperler innen 20 minutter av emulgering. Utstyret som kreves for innkapslingstrinnet, består i enkle omrørte kar som er tilgjengelige for de fleste laboratorier.

<html> Ved slutten av emulgerings-og intern geleringsprosessen, bør et vulstvolum lik det innledende alginat og celleblandingsvolumet utvinnes. Perlene bør være svært sfæriske med få feil ( figur 3 ). Perlene skal være tilstrekkelig sterke til å tåle pipettering gjennom storboringspipetter. Ved høye alginatkonsentrasjoner kan innkapslede olje- eller luftdråper observeres i perlene. Dette oppstår sannsynligvis på grunn av innfesting av olje i algi...

Watch this Scientific Journal Video about Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel at JoVE.com

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Denne videoen og manuskriptet beskriver en emulsjonsbasert metode for innkapsling av pattedyrceller i 0,5% til 10% alginatperler som kan fremstilles i store batcher ved bruk av en enkel omrørt beholder. De innkapslede celler kan dyrkes in vitro eller transplanteres for cellulære terapiapplikasjoner.

Mammalcellekapsling i alginatperler ved hjelp av et enkelt omrørt fartøy

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat Microcapsule som en 3D-plattform for Formering og Differensiering av humane embryonale stamceller (hESC) til ulike linjene

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Overvåking veggen Mechanics Under Stent Deployment i en Vessel

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Høy gjennomstrømning encellede og Multiple-celle Micro-innkapsling

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

En ny metode for lokalisering Reporter fluoriserende perler Nær Cell Culture Surface for trekkraft Mikros

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Dyrking av pattedyrceller med en enkelt-bruk Pneumatisk Bioreaktor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Lagdelte Alginat konstruksjoner: En plattform for Co-kultur av heterogene cellepopulasjoner

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Makt inn mål i rørt Bioreactors på laboratoriet skala

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...