Name: mammalian cell encapsulation in alginate beads using a simple stirred vessel
Uploaded: 2017-06-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel at JoVE.com

Agradecemos a Jill Osborne por seu trabalho de colocação no processo de emulsão e Lauren Wilkinson para suporte técnico. Agradecemos ao Dr. Igor Laçik, ao Dr. Timothy J. Kieffer e ao Dr. James D. Johnson por sua contribuição e colaboração. Agradecemos ao Diabète Québec, à JDRF, à ThéCell, ao Centro Quebécois sobre os Materiais Funais (CQMF), ao Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (CRSNG), ao Centro de Transplante de Ilhotas Humanas e à Regeneração de Células Beta, a Rede Canadense de Células-Tronco, a Fundação Michael Smith para Pesquisa em Saúde, os Fundos de pesquisa da pesquisa e a tecnologia e o COST 865 para apoio financeiro.

1. Prepare a solução de alginato, a suspensão de CaCO 3 e o óleo acidificado <ol><li> Prepare o buffer de processo e o meio. <ol><li> Prepare o tampão de processo típico usado para gerar esferas de alginato de alta concentração usando HEPES 10 mM, NaCl 170 mM. Ajuste o pH para 7,4. </li><li> Prepare o meio de cultura típico usando o Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS), 6 mM de glutamina, 100 U / mL de penicilina e 100 mg / mL de estre...

Várias etapas (representadas na Figura 2 ) durante a reação de gelificação interna podem limitar a cinética geral. Para grãos de carbonato de cálcio maiores do que ~ 2,5 μm, a taxa de dissolução do carbonato mostrou ser de 26 , 44 de limitação de taxa. O passo de acidificação que leva à liberação interna de cálcio também mostrou ser a variável do processo crítico que afeta a sobrevivência celular <s...

O encapsulamento de células de mamíferos foi amplamente estudado como um meio para proteger as células transplantadas da rejeição imune 1 ou para fornecer um suporte tridimensional para cultura celular imobilizada 2 , 3 , 4 . O encapsulamento de ilhotas de pâncreas em esferas de alginato tem sido usado para reverter o diabetes em roedores 5 , 6 ou xenogênicos 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , xenogênicos. Ensaios pré-clínicos e clínicos de transplante de ilhotas pancreáticas encapsuladas para tratar diabetes tipo 1 estão em andamento 13 , 14 , 15 . Para aplicações de transplantes ou maioresProdução celular imobilizada in vitro , geradores de talões baseados em bico são geralmente utilizados. Tipicamente, uma mistura de alginato e células é bombeada através de um bico para formar gotículas que caem numa solução agitada contendo catiões divalentes, resultando na gelificação externa das gotículas. O fluxo de gás coaxial 16 , 17 , a vibração de bocal 18 , a repulsão eletrostática 19 ou os fios rotativos 20 facilitam a formação de gotículas na ponta do bocal. As principais desvantagens dos geradores de grânulos convencionais são a sua taxa de transferência limitada e a limitada gama de viscosidades da solução que resultarão na formação adequada de grânulos 21 . Em altas taxas de fluxo, o fluido que sai do bico quebra em gotículas menor do que o diâmetro do bocal, diminuindo o controle de tamanho. Os geradores de grânulos com vários bicos podem ser usados ​​para aumentar a produção, masA distribuição uniforme do fluxo entre as bocas e o uso de soluções&gt; 0,2 Pas é problemático 22 . Por fim, espera-se que todos os dispositivos baseados em bicos dêem algum dano aos islotes, uma vez que o diâmetro dos bicos usados ​​está entre 100 μm e 500 μm, enquanto que ~ 15% das ilhotas humanas podem ser maiores do que 200 μm 23 . Neste vídeo, descrevemos um método alternativo para encapsular células de mamíferos formando gotículas em um único passo de emulsão em vez de gota a gota. Uma vez que a produção de grânulos é realizada em um recipiente de agitação simples, o método é adequado para produção de grânulos pequenos (~ 1 mL) a grande escala (10 3 L) com baixos custos de equipamento 24 . Este método permite a produção de esferas com alta esfericidade usando uma ampla gama de viscosidades de alginato com tempos de geração de grânulos curtos ( por exemplo, 20 minutos). Este método foi desenvolvido originalmente por Poncelet et aeu. 25 , 26 e usado para imobilizar DNA 27 , proteínas 28 incluindo insulina 29 e bactérias 30 . Recorremos recentemente a estes métodos para o encapsulamento de células de mamíferos usando linhas de células pancreáticas beta 31 , 32 e tecido pancreático primário 32 . O princípio do método é gerar uma emulsão de água em óleo consistindo de gotículas de alginato em óleo mineral, seguido de gelificação interna das gotículas de alginato ( Figura 1 ). Primeiro, o encapsulante ( por exemplo, células) é disperso em uma solução de alginato contendo um sal de cálcio de grão fino com baixa solubilidade no pH do processo inicial. A mistura de alginato é então adicionada a uma fase orgânica agitada para criar uma emulsão, geralmente na presença de umaSurfactante. No caso do encapsulamento de células de mamíferos, os componentes presentes no soro podem atuar como surfactantes. Em seguida, o pH é reduzido de modo a solubilizar o sal de cálcio pela adição de um ácido solúvel em óleo que particiona na fase aquosa. O ácido acético, com um coeficiente de partição de óleo mineral / óleo &lt;0,005 33 , deve ser pré-dissolvido em óleo, depois adicionado à emulsão onde é misturado na fase oleosa e partições rápidas para a fase aquosa 34 . A Figura 2 ilustra as reações químicas e a difusão que ocorrem durante o passo de acidificação e gelificação interna. Finalmente, as células encapsuladas são recuperadas por inversão de fase, separação de fase acelerada por centrifugação, passos de lavagem repetidos e filtração. Essas etapas podem então ser seguidas por amostragem de contas e células para análises de controle de qualidade, cultura celular in vitro e / ou transplante de células encapsuladas. Figura 1: Esquema do processo à base de emulsão para encapsular células de mamíferos. As pérolas são primeiro produzidas por emulsão de uma mistura de alginato, célula e CaCO3 em óleo mineral (etapas 1 e 2 no esquema), desencadeando a gelificação interna por adição de ácido acético (passo 3). As pérolas gelificadas são então separadas do óleo adicionando um tampão aquoso para desencadear a inversão de fase (passo 4), seguida de centrifugação e aspiração de óleo (passo 5) e depois filtração (passo 6). Finalmente, as pérolas coletadas no filtro são transferidas para meio de cultura celular para cultura in vitro ou para transplante. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <imgAlt = &quot;Figura 2&quot; class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55280 / 55280fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2: Reações e etapas de difusão que ocorrem durante a gelificação interna. (1) O ácido acético é adicionado à fase orgânica e é transportado para as gotículas de alginato por convecção. (2) As partições de ácido acético na fase aquosa. (3) Na presença de água, o ácido dissocia e difunde para atingir os grãos de CaCO3 representados em azul escuro. (4) Os íons H + são trocados com os íons Ca 2 + em CaCO 3 , liberando íons Ca 2+ . (5) Os íons de cálcio difundem até encontrarem alginato não reagido, levando à reticulação ionotrópica das cadeias de alginato. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> Contrariamente aos encapsuladores de células convencionais baseados em bicos, uma ampla distribuição de tamanho de talão é expeCitado deste processo devido ao mecanismo de formação de gotículas em emulsificação agitada. Para um subconjunto de aplicativos, essa distribuição de tamanho de talão pode ser problemática. Por exemplo, uma maior fração de células pode ser exposta na superfície do talão em pérolas menores. Se as limitações de nutrientes ( por exemplo, oxigênio) são uma preocupação, essas limitações podem ser exacerbadas em grânulos maiores. Uma vantagem do método de emulsificação agitada é que o tamanho médio do talão pode ser facilmente ajustado alterando a taxa de agitação durante o passo de emulsão. A distribuição ampla do tamanho do talão também pode ser explorada para estudar o efeito do tamanho do talão no desempenho da célula encapsulada. O encapsulamento de células de mamíferos por emulsificação e gelificação interna é uma alternativa interessante para laboratórios que não estão equipados com um gerador de notas. Além disso, este método oferece aos usuários a opção de reduzir o tempo de processamento ou gerar grânulos com concentrado de alginato muito baixo ou muito altoAções. O protocolo descrito abaixo descreve como encapsular células em 10,5 mL de solução de alginato a 5% preparada em tampão de ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanosulfónico 10 mM (HEPES) 10 mM. O alginato consiste em uma mistura 50:50 de LVM de grau de transplante (teor de ácido manurônico de baixa viscosidade e alto teor de ácido gulurônico com viscosidade média). O carbonato de cálcio na concentração final de 24 mM é utilizado como agente de reticulação física. O óleo mineral leve constitui a fase orgânica, enquanto o ácido acético é usado para acidificar a emulsão e desencadear a gelificação interna. No entanto, o tipo e composição de alginato, bem como o buffer de processo selecionado dependem da aplicação desejada 32 . Uma variedade de tipos de alginato (ver Tabela de materiais) foram utilizados para produzir esferas com este protocolo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="990">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Reagents and consumables</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">LVM alginate (transplantation-grade)</td>
			<td style="width:164px;">Novamatrix</td>
			<td style="width:223px;">Non-applicable</td>
			<td style="width:348px;">Referred to as &#34;alginate #1&#34; in the results.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">MVG alginate (transplantation-grade)</td>
			<td style="width:164px;">Novamatrix</td>
			<td style="width:223px;">Non-applicable</td>
			<td style="width:348px;">Referred to as &#34;alginate #2&#34; in the results.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Alginate (cell culture-grade)</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity)</td>
			<td style="width:348px;">A2033 is referred to as &#34;alginate #3&#34; in the results.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">DMEM</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:223px;">11995-065</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">SH3039603</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Glutamine</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:223px;">25030</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">P4333-100ML</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">HEPES, cell culture tested</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">H4034-100G</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">NaCl</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">S271-1</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:256px;">Fine-grain CaCO3</td>
			<td style="width:164px;">Avantor Materials</td>
			<td style="width:223px;">1301-01</td>
			<td style="width:348px;">After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Light mineral oil</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">O121-4</td>
			<td style="width:348px;">Sterile filter through a 0.22 &#956;m pore size membrane prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">A38-500</td>
			<td style="width:348px;">Handle with caution: refer to MSDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Sterile spatulas</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">CLS3004-100EA</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sterile nylon cell strainers, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">08-771-1</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)</td>
			<td style="width:164px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:223px;">86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:223px;">14673-043</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Toluidine Blue-O</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">T3260</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Equipment</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:256px;">100 mL microcarrier spinner flasks</td>
			<td style="width:164px;">Bellco</td>
			<td style="width:223px;">1965-00100</td>
			<td style="width:348px;">The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Magnetic stir plate with adjustable speed</td>
			<td style="width:164px;">Bellco</td>
			<td style="width:223px;">7760-06005</td>
			<td style="width:348px;">The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:256px;">Cell counter</td>
			<td style="width:164px;">Innovatis</td>
			<td style="width:223px;">Cedex AS20</td>
			<td style="width:348px;">This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">LED light box</td>
			<td style="width:164px;">Artograph</td>
			<td style="width:223px;">LightPad&#174; PRO</td>
			<td style="width:348px;">This item can be replaced by other types of illuminators.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:256px;">Handheld camera</td>
			<td style="width:164px;">Canon</td>
			<td style="width:223px;">PowerShot A590 IS</td>
			<td style="width:348px;">A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:256px;">Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters</td>
			<td style="width:164px;">Olympus</td>
			<td style="width:223px;">IX81</td>
			<td style="width:348px;">Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Image aquisition software</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:223px;">Metamorph</td>
			<td style="width:348px;">A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Image analysis freeware</td>
			<td style="width:164px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:223px;">Non-applicable</td>
			<td style="width:348px;">A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammalian cell encapsulation in alginate beads using a simple stirred vessel

O encapsulamento celular em pérolas de alginato foi utilizado para cultura celular imobilizada in vitro , bem como para imuno-isolação in vivo . O encapsulamento de ilhotas pancreáticas tem sido amplamente estudado como meio de aumentar a sobrevivência de ilhotas em transplantes alogênicos ou xenogênicos. O encapsulamento de alginato é geralmente alcançado por extrusão de bicos e gelificação externa. Usando este método, as gotículas de alginato contendo células formadas na ponta dos bocais caem em uma solução contendo catiões divalentes que causam a gelificação ionotrópica de alginato à medida que se difundem nas gotículas. O requisito para a formação de gotículas na ponta do bico limita o rendimento volumétrico e a concentração de alginato que podem ser alcançados. Este vídeo descreve um método de emulsificação escalável para encapsular células de mamífero em alginato de 0,5% a 10% com sobrevivência celular de 70% a 90%. Por este método alternativo, as gotículas de alginato contendo células e carbonato de cálcio são emulsionadas em óleo mineral, folBaixada por uma diminuição do pH, levando à liberação interna de cálcio e à gelação de alginato ionotrópico. O método atual permite a produção de pérolas de alginato dentro de 20 min de emulsificação. O equipamento necessário para o passo de encapsulação consiste em recipientes de agitação simples disponíveis para a maioria dos laboratórios.

<html> No final do processo de emulsão e gelificação interna, um volume de talão semelhante ao volume inicial da mistura de alginato e célula deve ser recuperado. As contas devem ser altamente esféricas com alguns defeitos ( Figura 3 ). As pérolas devem ser suficientemente resistentes para resistir a pipetagem através de pipetas de grande diâmetro. A altas concentrações de alginato, gotas de óleo ou ar encapsuladas podem ser observadas nas pérola...

Watch this Scientific Journal Video about Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel at JoVE.com

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Este vídeo e manuscrito descrevem um método baseado em emulsão para encapsular células de mamífero em pérolas de alginato de 0,5% a 10% que podem ser produzidas em grandes lotes usando um vaso de agitação simples. As células encapsuladas podem ser cultivadas in vitro ou transplantadas para aplicações de terapia celular.

Encapsulamento de células de mamífero em grânulos de alginato usando um recipiente agitado simples

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Beads separação e Células em dispositivos multi-canal microfluídicos Usando dieletroforese e Fluxo Laminar

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Bioengenharia

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

Um método para Encapsulation ovário folículo e Cultura em um proteoliticamente Degradáveis ​​3 Sistema Dimensional

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Microcápsulas de alginato como uma plataforma 3D para Propagação e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias (hESC) para diferentes linhagens

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Monitorização da Mecânica de parede durante a implantação de stent em um vaso

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Alta taxa de transferência de célula única e múltipla de células Micro-encapsulamento

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Um novo método para localizar Repórter fluorescentes Beads perto da superfície de cultivo celular para Tração Microscopia de Força

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

O cultivo de células de mamíferos utilizando um uso único sistema pneumático Bioreactor

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Em camadas de alginato Constrói: Uma Plataforma para Co-cultura de populações de células heterogéneas

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Entrada de poder de medições em biorreatores mexidas em escala de laboratório

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...