Name: mammalian cell encapsulation in alginate beads using a simple stirred vessel
Uploaded: 2017-06-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel at JoVE.com

Vi tackar Jill Osborne för sitt grundläggningsarbete på emulgeringsprocessen och Lauren Wilkinson för teknisk support. Vi tackar Dr. Igor Laçik, Dr. Timothy J. Kieffer och Dr. James D. Johnson för deras inmatning och samarbete. Vi tackar Diabète Québec, JDRF, ThéCell, Centre québécois sur les matériaux fonctionnels (CQMF), Forskningsrådet för naturvetenskap och teknik (NSERC), Centret för mänsklig isetransplantation och beta-cellregenerering, det kanadensiska stamcellsnätverket, Michael Smith Foundation för hälsoforskning, le Fonds québécois de la recherche sur la nature et les technologies och COST 865 för ekonomiskt stöd.

1. Förbered Alginatlösningen, CaCO3-suspensionen och den sura oljan <ol><li> Förbered processen buffert och medium. <ol><li> Förbered den typiska processbufferten som användes för att generera alginatpärlor med hög koncentration med användning av 10 mM HEPES, 170 mM NaCl. Justera pH till 7,4. </li><li> Förbered det typiska odlingsmediet med användning av Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), 6 mM glutamin, 100 U / ml penicillin och 100 mg /...

Olika steg (avbildat i figur 2 ) under den inre geleringsreaktionen kan begränsa den totala kinetiken. För kalciumkarbonatkorn större än ~ 2,5 μm har upplösningshastigheten för karbonat visat sig vara begränsningsbegränsande 26 , 44 . Syrringssteget som leder till inre kalciumfrisättning har också visat sig vara den kritiska processvariabel som påverkar cellöverlevnad 32 . De förhållanden som leder till inr...

Däggdjurscellinkapsling har studerats i stor utsträckning som ett medel för att skydda transplanterade celler från immunavstötning 1 eller för att tillhandahålla ett tredimensionellt stöd för immobiliserad cellodling 2 , 3 , 4 . Pankreasöppning i alginatpärlor har använts för att reversera diabetes i allogena 5 , 6 eller xenogena 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 gnagare. Prækliniska och kliniska prövningar av inkapslad öltransplantation i pankreatisk öre för att behandla typ 1-diabetes är pågående 13 , 14 , 15 . För transplantationsapplikationer eller större skalE- in vitro- immobiliserad cellproduktion används i allmänhet munstycksbaserade pärlgeneratorer. Typiskt pumpas en blandning av alginat och celler genom ett munstycke för att bilda droppar som faller i en omrörd lösning innehållande divalenta katjoner, vilket resulterar i dropparnas yttre gelning. Koaxialgasflödet 16 , 17 , munstycksvibration 18 , elektrostatisk avstängning 19 eller roterande ledningar 20 underlättar droppbildning vid munstyckspetsen. De huvudsakliga nackdelarna med konventionella pärlgeneratorer är deras begränsade genomströmning och det begränsade intervallet av lösningsviskositeter som kommer att resultera i tillräcklig pärlbildning 21 . Vid höga flödeshastigheter bryter vätskan från munstycket upp i droppar som är mindre än munstyckets diameter, minskande storlekskontroll. Multi-nozzle pearl generatorer kan användas för att öka genomströmningen, menDen enhetliga fördelningen av flödet mellan munstyckena och användningen av lösningar&gt; 0.2 Pas är problematisk 22 . Slutligen förväntas alla munstycksbaserade anordningar ge viss skada på holmar, eftersom diametern hos de använda munstyckena är mellan 100 | im och 500 | im, medan ~ 15% av mänskliga holmar kan vara större än 200 | im 23 . I denna video beskriver vi en alternativ metod för inkapsling av däggdjursceller genom att bilda droppar i ett enda emulgeringssteg istället för droppe. Eftersom pärlproduktionen utförs i ett enkelt rört kärl, är metoden lämplig för små (~ 1 ml) till storskalig (10 3 L-serie) pärlproduktion med låga utrustningskostnader 24 . Denna metod möjliggör produktion av pärlor med hög sfäricitet med användning av ett brett spektrum av alginatviskositeter med korta ( t.ex. 20 min) pärlgenereringstider. Denna metod har ursprungligen utvecklats av Poncelet et al. 25 , 26 och användes för att immobilisera DNA 27 , proteiner 28 innefattande insulin 29 och bakterier 30 . Vi har nyligen anpassat dessa metoder till inkapslingen av däggdjursceller med användning av pankreatiska beta-cellinjer 31 , 32 och primär pankreatisk vävnad 32 . Metoden är att generera en vatten-i-oljemulsion bestående av alginatdroppar i mineralolja, följt av intern gelering av alginatdropparna ( Figur 1 ). Först dispergeras inkapslingsmedlet (t ex celler) i en alginatlösning innehållande ett finkornigt kalciumsalt med låg löslighet vid det ursprungliga process-pH. Alginatblandningen tillsättes därefter till en omrörd organisk fas för att skapa en emulsion, vanligen i närvaro av atensid. I fallet med däggdjurscellinkapsling kan komponenter närvarande i serum fungera som ytaktiva ämnen. Därefter reduceras pH för att solubilisera kalciumsaltet genom att tillsätta en oljelöslig syra som skiljer sig in i vattenfasen. Ättiksyra, med en partikelkoefficient av mineralolja / vatten &lt;0,005 33 , bör förupplösas i olja, sedan tillsättas till emulsionen, där den blandas i oljefasen och skiljer sig snabbt i vattenfasen 34 . Figur 2 illustrerar de kemiska reaktionerna och diffusionen som äger rum under försurningen och det inre geleringssteget. Slutligen utvinns de inkapslade cellerna genom fasinversion, fasseparation accelererad genom centrifugering, upprepade tvättsteg och filtrering. Dessa steg kan sedan följas av pärl- och cellprovtagning för kvalitetskontrollanalyser, in vitro- cellodling och / eller transplantation av de inkapslade cellerna. Figur 1: Schematisk av emulgeringsbaserad process för inkapsling av däggdjursceller. Pärlor framställs först genom att emulgera en alginat-, cell- och CaCO3-blandning i mineralolja (steg 1 och 2 i schematisk), vilket utlöser intern gelning genom tillsats av ättiksyra (steg 3). De gelerade pärlorna separeras sedan från oljan genom tillsats av en vattenhaltig buffert för att trigga fasinversion (steg 4), följt av centrifugering och oljepåvirkning (steg 5) och därefter filtrering (steg 6). Slutligen överförs de pärlor som samlas på filtret till cellodlingsmedium för in vitro- odling eller för transplantation. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <imgAlt = &quot;Figur 2&quot; class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55280 / 55280fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2: Reaktioner och diffusionssteg som uppstår under intern gelning. (1) ättiksyra sätts till den organiska fasen och transporteras till alginatdropparna genom konvektion. (2) ättiksyra skiljer sig in i vattenfasen. (3) I närvaro av vatten dissocierar och diffunderar syran för att nå CaCO 3- kornen som avbildas i mörkblå. (4) H + -jonerna utbyts med Ca2 + joner i CaCO3, vilket frigör Ca2 + joner. (5) Kalciumjonerna diffunderar tills de möter oreagerat alginat, vilket leder till jonotropa tvärbindningen av alginatkedjorna. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> I motsats till konventionella munstycksbaserade cellinkapslare är en bred pärlstorleksfördelning expeCted från denna process på grund av mekanismen för droppbildning i omrörd emulgering. För en delmängd av program kan den här pärlstorleksfördelningen vara problematisk. Till exempel kan en större fraktion av celler exponeras vid vulstytan i mindre pärlor. Om begränsningar av näringsämnen ( t.ex. syre) är ett problem kan dessa begränsningar förvärras i större pärlor. En fördel med det omrörda emulgeringsförfarandet är att medelstrålstorleken lätt kan justeras genom att ändra omröringshastigheten under emulgeringssteget. Den breda pärlstorleksfördelningen kan också utnyttjas för att studera effekten av pärlstorleken på inkapslad cellprestanda. Däggdjurscellinkapsling genom emulgering och inre gelering är ett intressant alternativ för laboratorier som inte är utrustade med en pärlagenerator. Vidare ger denna metod användarna möjlighet att minska behandlingstiden eller generera pärlor vid mycket låg eller mycket hög alginatkoncentrations. Protokollet som beskrivs nedan beskriver hur man kapslar celler i 10,5 ml 5% alginatlösning framställd i 10 mM 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) buffert. Alginatet består av en 50:50 blandning av LVM (låg viskositet med hög viskositetshalt) och MGG (medelviskositet med hög guluronsyrahalt) alginat. Kalciumkarbonat vid en slutlig koncentration av 24 mM användes som det fysikaliska tvärbindningsmedlet. Lätt mineralolja utgör den organiska fasen, medan ättiksyra används för att surgöra emulsionen och utlösa inre gelering. Emellertid beror alginatypen och -kompositionen, liksom den utvalda processbufferten, på den önskade applikationen 32 . En mängd olika alginattyper (se tabell över material) har använts för att framställa pärlor med detta protokoll.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="990">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Reagents and consumables</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">LVM alginate (transplantation-grade)</td>
			<td style="width:164px;">Novamatrix</td>
			<td style="width:223px;">Non-applicable</td>
			<td style="width:348px;">Referred to as &#34;alginate #1&#34; in the results.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">MVG alginate (transplantation-grade)</td>
			<td style="width:164px;">Novamatrix</td>
			<td style="width:223px;">Non-applicable</td>
			<td style="width:348px;">Referred to as &#34;alginate #2&#34; in the results.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Alginate (cell culture-grade)</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity)</td>
			<td style="width:348px;">A2033 is referred to as &#34;alginate #3&#34; in the results.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">DMEM</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:223px;">11995-065</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">SH3039603</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Glutamine</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:223px;">25030</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Penicillin and streptomycin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">P4333-100ML</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">HEPES, cell culture tested</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">H4034-100G</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">NaCl</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">S271-1</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:256px;">Fine-grain CaCO3</td>
			<td style="width:164px;">Avantor Materials</td>
			<td style="width:223px;">1301-01</td>
			<td style="width:348px;">After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Light mineral oil</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">O121-4</td>
			<td style="width:348px;">Sterile filter through a 0.22 &#956;m pore size membrane prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">A38-500</td>
			<td style="width:348px;">Handle with caution: refer to MSDS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Sterile spatulas</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">CLS3004-100EA</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Sterile nylon cell strainers, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">08-771-1</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)</td>
			<td style="width:164px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:223px;">86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:223px;">14673-043</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Toluidine Blue-O</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:223px;">T3260</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Equipment</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:256px;">100 mL microcarrier spinner flasks</td>
			<td style="width:164px;">Bellco</td>
			<td style="width:223px;">1965-00100</td>
			<td style="width:348px;">The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Magnetic stir plate with adjustable speed</td>
			<td style="width:164px;">Bellco</td>
			<td style="width:223px;">7760-06005</td>
			<td style="width:348px;">The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:256px;">Cell counter</td>
			<td style="width:164px;">Innovatis</td>
			<td style="width:223px;">Cedex AS20</td>
			<td style="width:348px;">This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">LED light box</td>
			<td style="width:164px;">Artograph</td>
			<td style="width:223px;">LightPad&#174; PRO</td>
			<td style="width:348px;">This item can be replaced by other types of illuminators.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:256px;">Handheld camera</td>
			<td style="width:164px;">Canon</td>
			<td style="width:223px;">PowerShot A590 IS</td>
			<td style="width:348px;">A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:256px;">Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters</td>
			<td style="width:164px;">Olympus</td>
			<td style="width:223px;">IX81</td>
			<td style="width:348px;">Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Image aquisition software</td>
			<td style="width:164px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:223px;">Metamorph</td>
			<td style="width:348px;">A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Image analysis freeware</td>
			<td style="width:164px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:223px;">Non-applicable</td>
			<td style="width:348px;">A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammalian cell encapsulation in alginate beads using a simple stirred vessel

Cellinkapsling i alginatpärlor har använts för immobiliserad cellodling in vitro såväl som för immunoisolering in vivo . Inkapsling av bukspottskörtel har studerats i stor utsträckning som ett medel för att öka överlevnad av öl i allogena eller xenogena transplantationer. Alginatinkapsling uppnås vanligen genom munstycksexstrudering och yttre gelning. Med hjälp av denna metod faller cellhaltiga alginatdroppar bildade vid munstyckets spets i en lösning innehållande divalenta katjoner som orsakar jonotrop alginatgelering när de diffunderar i dropparna. Kravet på droppbildning vid munstyckspetsen begränsar den volymetriska genomströmningen och alginatkoncentrationen som kan uppnås. Denna video beskriver en skalbar emulgeringsmetod för inkapsling av däggdjursceller i 0,5% till 10% alginat med 70% till 90% cellöverlevnad. Genom denna alternativa metod emulgeras alginatdroppar innehållande celler och kalciumkarbonat i mineralolja, folSänkt av en minskning av pH vilket leder till inre kalciumfrigöring och jonotrop alginat gelering. Den nuvarande metoden möjliggör framställning av alginatpärlor inom 20 min emulgering. Den utrustning som krävs för inkapslingssteget består av enkla rörda kärl som är tillgängliga för de flesta laboratorier.

<html> Vid slutet av emulgerings-och inre geleringsprocessen bör en kulvolym som liknar den initiala alginat- och cellblandningsvolymen utvinnas. Pärlorna ska vara mycket sfäriska med få defekter ( Figur 3 ). Pärlorna ska vara tillräckligt starka för att motstå pipettering genom storborrpipetter. Vid höga alginatkoncentrationer kan inkapslad olja eller luftdroppar observeras i pärlorna. Detta uppstår troligen på grund av att olja sitter i alginatd...

Watch this Scientific Journal Video about Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel at JoVE.com

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Denna video och manuskript beskriver en emulsionsbaserad metod för inkapsling av däggdjursceller i 0,5% till 10% alginatpärlor som kan framställas i stora satser med användning av en enkel omrörd kärl. De inkapslade cellerna kan odlas in vitro eller transplanteras för cellterapiapplikationer.

Mammalcellsinkapsling i alginatpärlor med hjälp av ett enkelt omrörat fartyg

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Separera Pärlor och celler i flera kanaler mikroflödessystem enheter Använda Dielectrophoresis och laminär strömning

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

En metod för äggblåsa Inkapsling och kultur i ett Proteolytically Nedbrytbara 3 dimensionellt system

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Att skapa två-dimensionell Mönstrad substrat för Protein och Cell inneslutning

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat mikrokapselkomposition som en 3D-plattform för förökning och differentiering av mänskliga embryonala stamceller (hESC) till olika linjer

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Övervakning av Wall Mechanics Under stentutveckling i ett kärl

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Hög genomströmning Single-cell och flera celler mikroinkapsling

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

En ny metod för att lokalisera Reporter Fluorescent Pärlor Nära Cell Culture Yta för Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Odling av däggdjursceller med en enda användning Pneumatic bioreaktorsystem

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Layered alginat Konstruktioner: En plattform för Co-kultur av heterogena cellpopulationer

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Power Input mätningar i rörs bioreaktorer på laboratorieskala

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...