Name: identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta
Uploaded: 2017-08-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

لعدم وجود مساحة، استشهدنا الغالب استعراض المواد، ونعتذر لزملائنا واستشهد بعدم عملها الأصلي. العمل في مختبر لالح معتمد من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، وجبهة الخلاص الوطني، ووزارة الزراعة/NIFA، بارد، وقوات حرس الحدود إلى الخامس، ومختبر S.G.L. معتمد من قبل المعهد الوطني للصحة والأموال من أقسام أمراض النبات والأحياء النباتية-ميكروب S.G.L.

1-مصنع المواد
<ol><li>اختيار أنواع النباتات</li>
	<li>استخدام الأنواع النباتية الأصلية للبروتين من الفائدة، أي، والذي يقوم بترميز هذا البروتين للبروتينات الذاتية أو الذي يمثل المضيفة الطبيعية لمسببات المرض للبروتينات الفيروسية. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون الأنواع النباتية المحددة قاب...

هذا البروتوكول له أربعة مكونات أساسية: مفهوم تحديد تسلسل ضروري وكاف لاستهداف Pd، تقسيم منهجي من بروتين الفائدة إلى الشظايا التي تنخفض تدريجيا في الطول، والصمامات تم اختبارها الشظايا إلى بروتين أوتوفلوريسسينت الذي يخدم كعلامة وشحن الجزيئات، والتحليل الوظيفي لاستهداف Pd في المعيشة زرع الأ?...

Plasmodesmata (Pd) تعمل كقنوات لنقل المنظمين مفتاح التنمية النباتية و morphogenesis، بدءاً من عوامل النسخ مرناً وجزيئات الحمض النووي الريبي صغيرة بين الخلايا. وعلاوة على ذلك، تستخدم هذا قدرة النقل الجزيئات Pd معظم الفيروسات النباتية لانتشارها بين الخلايا أثناء العدوى؛ للانتقال عبر Pd، تطورت فيروسات النباتات البروتينات المتخصصة، ووصف حركة البروتينات (MPs)، التي تستهدف على وجه التحديد إلى Pd1،2،3،4،،من56 , 7-الجزيئية مسارات النقل Pd على الأرجح ترابطاً وثيقا مع تسلسل معين التي تستهدف نقل البروتينات في هذه المسارات. وهكذا، قد يكون تحديد هذه الإشارات التعريب Pd (PLSs) التشخيص لمسار النقل Pd المقابلة. وهذا قياسا ل النقل Pd8، على سبيل المثال، إلى مسارات مختلفة استيراد النووية، التي يمكن أن تكون محددة للتعريب النووية المختلفة إشارة (NLS) تسلسل9،10. من الناحية المفاهيمية، نلس و PLSs تمثل تسلسل استهداف سوبسيلولار غير كليفابل التي ضرورية وكافية لاستهداف. ولكن، خلافا نلس11، تسلسل المعلومات حول PLSs محدودة للغاية. على وجه التحديد، سجلت أربعة فقط تسلسل البروتين المتورطين في استهداف Pd، مع كل منهم المستمدة من البروتينات النباتية الذاتية. ويمثل أول واحد مجال هوميوبوكس KN112 – عامل نسخ الذي ينتقل من طبقات الخلايا الداخلية للبشرة من أوراق النبات13 – وبه نوكس هومولوجس14. أيضا هو ثانية واحدة من عامل نسخ، شعبة الشؤون المالية، التي تتضمن الثابتة والمتنقلة المفترضة وصفه الاتجار بين الخلايا (IT) عزر15. التسلسل الثالث من بروتين غشائي نوع plasmodesmata المقيم 1 PDLP1، ويتم تمثيله بواسطة مجال transmembrane16. وأخيراً، Pd الرابعة استهداف تسلسل أبلغ مؤخرا عن جليكوسيلفوسفاتيديلينوسيتول (GPI)-البروتينات المرتبطة، وأنه يمثل إشارة التعديل جليكوسيلفوسفاتيديلينوسيتول (GPI)17.
من المثير للاهتمام، وحتى وقت قريب جداً، لا PLSs أبلغ النواب الفيروسي. أشارت الدراسات السابقة إلى وجود تسلسل الثابتة والمتنقلة المفترضة في النبات الفيروسية MPs18،19، ولكن ليس صحيحاً الثابتة والمتنقلة، أيتسلسل الأحماض الأمينية الحد أدنى الضروري والكافي لاستهداف Pd (جزيء بضائع لا علاقة لها كل على سبيل المثال-، الحراجية المعتمدة) قد حددت في النائب فيروسية. بعد واحدة من هذه البروتينات، النائب من فيروس تبرقش التبغ (TMV)، كان الأول للمشتريات التي تم التعريب والنقل تبين20.
ولسد هذه الفجوة، قمنا بتطوير استراتيجية تجريبية لتحديد "تمف النائب الثابتة والمتنقلة". استندت هذه الاستراتيجية على ثلاثة مفاهيم. (ط) وحددنا الثابتة والمتنقلة كتسلسل الحد أدنى من الأحماض الأمينية التي ضرورية وكافية لاستهداف البروتين إلى Pd21. (ثانيا) لأن النائب تمف يستهدف أولاً Pd وثم ترانسلوكاتيس من خلال هذه القنوات22، نحن تهدف إلى فصل هذين النشاطين والتعرف الثابتة والمتنقلة حسنة النية، التي تعمل فقط من أجل استهداف Pd، وليس للنقل اللاحقة. (ثالثا) قمنا بتحليل الثابتة والمتنقلة التي تم تحديدها للمخلفات من الأحماض الأمينية الهامة للمشتريات استهداف نشاط، سواء هيكلياً أو وظيفيا. باستخدام هذا النهج، نحن تحديد تسلسل بقايا الأحماض أمينية 50 في الأمينية المحطة "النائب تمف" بمثابة النية الثابتة والمتنقلة. وكان ذلك بإنتاج سلسلة من الشظايا "تمف النائب" أن مشبعة على طول من البروتين، ووضع علامات على الكربوكسيل تيرميني مع الحركة وعابر إذ تعرب عن لهم في الأنسجة النباتية. تعريب Pd كل أجزاء اختبار تحددها كوكسبريسينج لهم مع بروتين علامة Pd، PDCB1 (Pd كلوس ملزمة البروتين 1)23. واعتبر الجزء الأصغر التي لا تزال المترجمة إلى شعبة المشتريات، ولكن عدم اجتياز Pd، لتمثيل الثابتة والمتنقلة. وأخيراً، كان الثابتة والمتنقلة ألانين الممسوحة ضوئياً لتحديد بقايا الأحماض الأمينية الأساسية اللازمة لهيكل و/أو وظيفة.
بينما نحن هنا لتوضيح هذا النهج بوصف تحديد "تمف النائب الثابتة والمتنقلة"، فإنه يجوز لاكتشاف PLSs في أي البروتينات المستهدفة لشعبة المشتريات الأخرى، سواء ترميز بمسببات الأمراض النباتية أو النباتات أنفسهم؛ وهذا لأن لدينا أسلوب عدم الاستفادة من أي ميزات فريدة من نوعها الفيروسية من أعضاء البرلمان فيما يتعلق بقدرتهم على الهدف إلى Pd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1086">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td>
			<td style="width:176px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">LSM5</td>
			<td style="width:349px;">Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zen software for confocal microscope imaging</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2009 version</td>
			<td>The software should be compatible with the CLSM used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quickchange II site-directed mutagenesis kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes without needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectinomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

Plasmodesmata (Pd) هي خلية إلى الاتصالات التي تعمل كبوابات تنقل من خلالها الجزيئات الصغيرة والكبيرة بين الخلايا النباتية. بينما النقل Pd من جزيئات صغيرة، مثل الأيونات والماء، المفترض أن يحدث مكتوفي الأيدي، نقل خلية إلى خلية من الجزيئات البيولوجية الكبرى، مثل البروتينات، يحدث على الأرجح عبر إليه نشطة تتضمن إشارات محددة تستهدف في نقل جزيء. ندرة plasmodesmata التي تم تحديدها (Pd) ترجمة الإشارات (PLSs) قد مقيدة بشدة فهم الفرز البروتين مسارات تشارك في زرع خلية إلى خلية الجزيئات النقل والاتصالات. من ثروة النباتات البروتينات الذاتية والفيروسية المعروفة لحركة المرور من خلال Pd، PLSs ثلاثة فقط أبلغ حتى الآن، كل منهم من البروتينات النباتية الذاتية. وبالتالي، من المهم وضع استراتيجية تجريبية موثوقة ومنهجية لتحديد تسلسل الثابتة والمتنقلة فنية، التي ضرورية وكافية لاستهداف Pd، مباشرة في المعيشة الخلايا النباتية. هنا، يمكننا وصف واحد مثل هذه الاستراتيجية كنموذج باستخدام حركة الخلية للخلية البروتين (MP) فيروس تبرقش التبغ (TMV). هذه التجارب، التي حددت ووصفت الأول النباتية الثابتة والمتنقلة الفيروسية، ويمكن تكييفها لاكتشاف تسلسل الثابتة والمتنقلة في البروتينات الأكثر استهدافاً Pd.

بيانات تمثيلية، إخلاص توضح النتائج المتوقعة من البروتوكولات وصف وتحديد "النائب تمف المتنقلة"، مقتبسة من يوان et al. 21-ويوجز الشكل 1A أولاً ثوابت رئيسية معربا عن كامل طول "تمف النائب" (1-268)، تمف النائب الثابتة والمتنقلة (التي تضم بقايا الأحماض الأمين...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

الاتصالات بين الخلايا النباتية، plasmodesmata (Pd)، تلعب الأدوار المركزية في مصنع التفاعلات فسيولوجيا ومصنع للفيروسات. يتم فرز الحرجة للنقل Pd الإشارات التي توجه البروتينات للمشتريات. غير معرفتنا في تسلسل هذه لا تزال في مهدها. يصف لنا استراتيجية لتحديد إشارات التعريب Pd في البروتينات المستهدفة Pd.

تحديد تسلسل التعريب بلاسموديسمال في البروتينات في بﻻنتا

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

تصور فيروس حمى الضنك من خلال وصفها اليكسا فلور

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

الخلايا الدبقية الصغيرة زراعة من الجهاز العصبي المركزي حديثي الولادة والكبار

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

مضان<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH) لتوطين الفيروسات والبكتيريا Endosymbiotic في النبات والحشرات مناديل

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

باستخدام نيون البروتينات إلى تصور وQuantitate<em&gt; الكلاميديا</em&gt; فجوة النمو حيوية في الخلايا الحية

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

التعرف السريع على البكتيريا سالبة الجرام من ثقافة الدم في مرق عن طريق MALDI-TOF الطيف الكتلي

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

تنقية الحمض النووي الفيروسي للتعرف على البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة بها

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

تحديد "علامات الفوعة" بكتريا أبسسيسوس "النسخ المتماثل داخل الخلايا" في البالعات

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...