Name: identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta
Uploaded: 2017-08-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

For manglen plads, vi citerede det meste review artikler, og vi undskylde over for vores kolleger, hvis oprindelige arbejde ikke blev nævnt. Arbejde i V.C. laboratorium understøttes af tilskud fra NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD og BSF til V.C., og S.G.L. laboratoriet understøttes af NIH og midler fra afdelinger for Plantepatologi og plante-mikrobe biologi til S.G.L.

1. plantematerialet
<ol><li>Valg af plantearter</li>
	<li>Bruge native til protein plantearter af interesse, dvs., der koder dette protein for endogene proteiner eller som repræsenterer den naturlige vært for patogen for virale proteiner. Derudover skal de valgte plantearter imødekommenhed over for den valgte metode til forbigående genetiske transformation. Bemærk: Undersøgelserne, der rutinemæssigt beskæftiger Nicotiana benthamiana, som repræsenterer en god vært for TMV og omdannes effek...

Denne protokol har fire centrale bestanddele: koncept for at identificere en sekvens, der er både nødvendige og tilstrækkelige for målretning til Pd, systematisk inddeling af protein af interesse i fragmenter, der er gradvist reduceret i længden, fusing de testede brudstykker til en autofluorescent protein, der fungerer både som tag og som makromolekylære last og funktionelle assay for Pd målretning i levende plante væv efter forbigående udtryk for de testede fusion proteiner. Bemærk at Agrobacterium-medieret ...

Plasmodesmata (Pd) fungere som kanaler for intercellulære transport af centrale regulatorer af plante udvikling og morfogenese, lige fra transkriptionsfaktorer til mRNA og små RNA-molekyler. Desuden, denne makromolekylære transportkapaciteten PD er udnyttet af de fleste plante vira til deres intercellulære udbredelse under infektion; for at flytte gennem Pd, plante virus har udviklet sig specialiserede proteiner, betegnes bevægelse proteiner (MPs), der er specifikt målrettet til Pd1,2,3,4,5,6 , 7. molekylære veje af Pd transport sandsynligvis er tæt forbundet med specifikke sekvenser, der er målrettet de transporterede proteiner i disse veje. Identifikation af disse Pd lokalisering signaler (PLSs) kan således diagnosticering af den tilsvarende Pd transport pathway. Dette er analogt Pd transport8, for eksempel, at forskellige nukleare import veje, som kan være specifikke for forskellige nukleare lokalisering signal (NLS) sekvenser9,10. Begrebsmæssigt, repræsenterer både NLSs og PLSs ikke-cleavable subcellulært målretning sekvenser, der er nødvendige og tilstrækkelige for målretning. Men i modsætning til NLSs11, sekvens oplysninger om PLSs er stærkt begrænset. Specifikt, er kun fire protein sekvenser involveret i Pd målretning blevet rapporteret, med alle dem afledt af endogene vegetabilske proteiner. Den første er repræsenteret af et HOXD domæne KN112 – en transkriptionsfaktor, der flytter fra indre cellelag til epidermis af plante blad13 – og dens KNOX homologs14. Den other sig er også fra en transkriptionsfaktor, Dof, som indeholder en formodede PLS beskrevet som intercellulære handel (IT) motiv15. Den tredje sekvens er fra PDLP1 plasmodesmata-resident type 1 membran protein, og den er repræsenteret ved en transmembrane domæne16. Endelig den fjerde Pd målretning sekvens blev for nylig rapporteret til glycosylphosphatidylinositol (GPI)-forankrede proteiner, og det er repræsenteret ved glycosylphosphatidylinositol (GPI) ændring signal17.
Interessant, indtil for ganske nylig, ingen PLSs er blevet rapporteret til viral MPs. Tidligere undersøgelser vist tilstedeværelse af formodede PLS sekvenser i anlægget viral MPs18,19, men ingen sand PLS, dvs, en minimal aminosyresekvens, både nødvendige og tilstrækkelige for Pd målretning af en ikke-forretningsmæssigt forbundne cargo molekyle ( fx., fælles fiskeripolitik) er blevet identificeret i en viral MP. Endnu var en af disse proteiner, MP af tobak mosaik virus (TMV), den første, for hvilke Pd lokalisering og transport har været demonstreret20.
For at løse dette hul, udviklede vi en eksperimentel strategi for at identificere TMV MP PLS. Denne strategi byggede på tre begreber. (i) vi defineret PLS som en minimal aminosyresekvens, der er både nødvendige og tilstrækkelige for protein målretning til Pd21. (ii) fordi TMV MP første mål Pd og derefter translocates gennem disse kanaler22, sigter vi mod frakobling disse to aktiviteter og at identificere bona fide PLS, der fungerer kun for Pd målretning og ikke for den efterfølgende transport. (iii) vi analyseret de identificerede PLS for aminosyrerester vigtig for dens Pd målrettet aktivitet, uanset om strukturelt eller funktionelt. Brug denne fremgangsmåde, afgrænset vi en 50-amino syre rester sekvens på amino endestation TMV MP, der fungerer som bona fide PLS. Dette blev gjort ved at producere en serie af TMV MP fragmenter, der mættede hele længden af proteinet, tagging deres carboxyl-termini med den fælles fiskeripolitik og forbigående at udtrykke dem i plantevæv. PD lokalisering af hver af de testede fragmenter blev fastsat ved at coexpressing dem med en Pd markør protein, PDCB1 (Pd callose bindende protein 1)23. Det mindste fragment, der stadig er lokaliseret til Pd, men ikke krydse Pd, blev anset for at repræsentere PLS. Endelig var PLS alanin-scannet til at bestemme de vigtigste aminosyrerester kræves for dens struktur og/eller funktion.
Mens her vi illustrere denne tilgang ved at beskrive identifikation af TMV MP PLS, kan det være ansat til at opdage PLSs i nogen andre Pd-målrettet proteiner, om kodet af plante patogener eller planterne selv; Dette skyldes, at vores metode ikke drage fordel af eventuelle unikke funktioner af viral parlamentsmedlemmer med hensyn til deres evne til at målrette til Pd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1086">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td>
			<td style="width:176px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">LSM5</td>
			<td style="width:349px;">Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zen software for confocal microscope imaging</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2009 version</td>
			<td>The software should be compatible with the CLSM used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quickchange II site-directed mutagenesis kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes without needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectinomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

Plasmodesmata (Pd) er celle til celle-forbindelser, der fungerer som gateways, som små og store molekyler transporteres mellem planteceller. Pd transport af små molekyler, som ioner og vand, antages at forekomme passivt, celle til celle transport af biologiske makromolekyler, sådanne proteiner, højst sandsynligt sker via en aktiv mekanisme, der involverer specifikke målretning signaler på den transporteres molekyle. Knaphed på identificerede plasmodesmata (Pd) lokalisering signaler (PLSs) har stærkt begrænset forståelse af protein-sortering veje involveret i plante celle til celle makromolekylære transport og kommunikation. Fra et væld af plante endogene og virale proteiner kendt trafik gennem Pd, kun tre PLSs er blevet rapporteret til dato, alle dem fra endogene vegetabilske proteiner. Det er således vigtigt at udvikle en pålidelig og systematisk eksperimentelle strategi for at identificere en funktionel PLS sekvens, der er både nødvendige og tilstrækkelige for Pd målretning, direkte i levende plante celler. Her beskriver vi en sådan strategi bruge som et paradigme celle-til-celle bevægelse protein (MP) af tobak mosaik virus (TMV). Disse eksperimenter, der identificeret og karakteriseret først plante viral PLS, kan være tilpasset til opdagelsen af PLS sekvenser i mest Pd-målrettet proteiner.

De repræsentative data, som trofast illustrerer resultaterne forventes fra de beskrevne protokoller og identificere TMV MP PLS, er tilpasset fra Yuan et al. 21. figur 1A først opsummerer store konstruktioner at udtrykke den fuld længde TMV MP (1-268), TMV MP PLS (bestående af de første 50 aminosyrerester protein, 1-50), og dens alanin scanning V4A derivater smeltet til den fælles fiskeripolitik (genereres som beskrevet i trin 2.2, 5....

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plante intercellulære forbindelser, plasmodesmata (Pd), spiller en central rolle i plante fysiologi og plante-virus interaktioner. Kritisk til Pd transport sortering signaler, der direkte proteiner til Pd. Vores viden om disse sekvenser er imidlertid stadig i sin vorden. Vi beskriver en strategi for at identificere Pd lokalisering signaler i Pd-målrettet proteiner.

Identifikation af Plasmodesmal lokalisering sekvenser i proteiner i Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Dyrkning Mikroglia fra Neonatal og Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridiseringer (FISH) til lokalisering af vira og Endosymbiotic Bakterier i plante-og insektliv Væv

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Brug fluorescerende proteiner til at visualisere og kvantificere<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Vækst Dynamics i levende celler

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapid Identifikation af Gram-negative bakterier fra Blood kulturvæsken Brug MALDI-TOF-massespektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Rensning af Viral DNA til identifikation af tilknyttede Viral og cellulær proteiner

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identifikation af virulens markører af Mycobacterium abscessus intracellulære replikering i fagocytter

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...