Name: identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta
Uploaded: 2017-08-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

Voor het gebrek aan ruimte, we meestal review artikelen genoemd, en wij verontschuldigen ons aan onze collega's wier oorspronkelijke werk werd niet genoemd. Het werk in het laboratorium V.C. wordt ondersteund door subsidies van NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD en BSF aan V.C., en het S.G.L. laboratorium wordt ondersteund door de NIH en middelen van de diensten van Plant Pathology en Plant-Microbe biologie naar S.G.L.

1. de plantmateriaal
<ol><li>Keuze van plantensoorten</li>
	<li>Gebruik de plantensoorten afkomstig uit de proteïne van belang, dat wil zeggen, één die codeert dit eiwit voor endogene eiwitten of waarmee de natuurlijke gastheer voor het pathogene agens voor virale eiwitten. Bovendien moet de geselecteerde plantensoorten vatbaar voor de gekozen methode van voorbijgaande genetische transformatie. Opmerking: De studies routinematig dienst Nicotiana benthamiana, die vertegenwoordigt een goede gasthe...

Dit protocol heeft vier kern bestanddelen: het concept van de identificatie van een reeks die noodzakelijk en voldoende voor targeting te Pd, systematische indeling van de proteïne van belang in fragmenten worden geleidelijk verlaagd in lengte, smelten de geteste fragmenten aan een autofluorescent eiwit, die fungeert als label én als macromoleculaire lading, en/of functionele assay voor Pd targeting in levende planten weefsels na voorbijgaande expressie van de geteste fusie-eiwitten. Merk op dat Agrobacterium-gemedieer...

Plasmodesmata (Pd) fungeren als leidingen voor intercellulaire vervoer van belangrijke regelgevende instanties van de ontwikkeling van planten en voedselproductie, variërend van transcriptiefactoren tot mRNA en kleine molecules van RNA. Bovendien, deze macromoleculaire transportcapaciteit van Pd wordt gebruikt door de meeste plantenvirussen voor hun intercellulaire verspreiding tijdens infectie; Als u wilt verplaatsen door middel van Pd, geëvolueerd plantenvirussen gespecialiseerde eiwitten, genoemd verkeer eiwitten (MPs), die specifiek gericht zijn op Pd1,2,3,4,5,6 , 7. moleculaire pathways van Pd vervoer waarschijnlijk zijn nauw met elkaar verbonden met de specifieke opeenvolgingen die gericht zijn op de vervoerde hoeveelheden eiwitten in deze trajecten. Dus, is identificatie van deze Pd lokalisatie signalen (PLSs) diagnose van het overeenkomstige Pd vervoer traject mogelijk. Dit wil analogie van Pd vervoer8, bijvoorbeeld verschillende nucleaire importeren trajecten, die kunnen wel specifiek voor verschillende nucleaire localisatie signaal (NLS) sequenties9,10. Conceptueel, vertegenwoordigen zowel NLSs als PLSs niet-cleavable subcellular targeting sequenties die noodzakelijk voldoende zijn voor targeting en. Echter, in tegenstelling tot de NLSs11, de opeenvolgingsinformatie over PLSs is zeer beperkt. Specifiek, zijn slechts vier proteïne sequenties die betrokken zijn bij de Pd gericht op gemeld, met allemaal afgeleid van endogene plantaardige eiwitten. De eerste die wordt vertegenwoordigd door een domein van de homeobox van KN112 – een transcriptiefactor waarmee wordt verplaatst van de cel van de binnenste lagen naar de opperhuid van de plant blad13 – en haar KNOX homologen14. In het tweede voorbeeld is ook van een transcriptiefactor, Dof, waarin een vermeende PLS beschreven als de intercellulaire handel (IT) motief15. De derde reeks is uit het PDLP1 plasmodesmata-ingezeten type 1 membraan eiwit, en het wordt vertegenwoordigd door een transmembraan domein16. Tot slot, de vierde Pd gericht op volgorde werd onlangs gemeld voor glycosylphosphatidylinositol (GPI)-verankerd eiwitten en het wordt vertegenwoordigd door de glycosylphosphatidylinositol (GPI) wijziging signaal17.
Interessant, tot voor kort geen PLSs gemeld voor virale MPs. Eerdere studies aangegeven de aanwezigheid van vermeende PLS sequenties in plant virale MPs18,19, maar geen echte PLS, dat wil zeggen, een minimale aminozuur reeks zowel noodzakelijk als voldoende voor Pd targeting van een ongerelateerde lading molecuul ( bijv., GVB) in een virale MP is geconstateerd. Nog was een van deze proteïnen, MP van het tabak mosaic virus (TMV), de eerste die Pd lokalisatie en vervoer al aangetoond dat20.
Om deze leemte, ontwikkelden we een experimentele strategie ter identificatie van TMV MP PLS. Deze strategie was gebaseerd op drie concepten. (i) we PLS gedefinieerd als een minimale aminozuur-reeks die noodzakelijk en voldoende zijn voor het targeten van eiwit Pd21. (ii) omdat TMV MP eerst Pd richt en vervolgens translocates via deze kanalen22, we gericht op het afkoppelen van deze twee activiteiten en het identificeren van de bonafide PLS, welke functies alleen voor Pd targeting, en niet voor het latere vervoer. (iii) we geanalyseerd de geïdentificeerde PLS voor aminozuurresidu's belangrijk voor haar Pd gerichte activiteit, structureel of functioneel. Met behulp van deze aanpak, we een 50-amino acid residu-reeks op de amino-terminus van TMV MP die als bonafide PLS fungeert afgebakend. Dit werd gedaan door de productie van een reeks van TMV MP fragmenten die verzadigd van de gehele lengte van het eiwit, tagging hun carboxyl-termini met GVB en Transient uiten ze in plantaardige weefsels. PD lokalisatie van elk van de geteste fragmenten werd bepaald door coexpressing hen met een Pd marker eiwit, PDCB1 (Pd callose bindende eiwitten 1)23. Het kleinste fragment dat nog steeds gelokaliseerd op Pd, maar deed niet doorkruisen Pd, werd beschouwd als PLS vertegenwoordigen. Ten slotte was het PLS alanine-gescand om te bepalen van de belangrijkste aminozuurresidu's nodig zijn voor de structuur en/of functie.
Overwegende dat hier we deze benadering illustreren door de identificatie van TMV MP PLS beschrijven, kan het worden gebruikt om te ontdekken PLSs in elke andere Pd-gerichte eiwitten, of gecodeerd door plant ziekteverwekkers of door de planten zelf; Dit is omdat onze werkwijze niet van eventuele unieke kenmerken van virale MPs met betrekking tot hun vermogen om doel te Pd profiteren doet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1086">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td>
			<td style="width:176px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">LSM5</td>
			<td style="width:349px;">Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zen software for confocal microscope imaging</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2009 version</td>
			<td>The software should be compatible with the CLSM used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quickchange II site-directed mutagenesis kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes without needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectinomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

Plasmodesmata (Pd) zijn cel-naar-cel verbindingen die functioneren als gateways waarmee kleine en grote moleculen worden vervoerd tussen plantencellen. Overwegende dat Pd vervoer van kleine molecules, zoals ionen en water, wordt verondersteld te passief optreden, cel-naar-cel vervoer van biologische macromoleculen, dergelijke eiwitten bevatten, meest waarschijnlijk gebeurt via een actief mechanisme waarbij specifieke targeting signalen op de vervoerde molecuul. De schaarste van geïdentificeerde plasmodesmata (Pd) lokalisatie signalen (PLSs) heeft strenge beperkingen op het begrijpen van de eiwit-sorteren trajecten die betrokken zijn bij plant cel-naar-cel macromoleculaire vervoer en communicatie. Van een rijkdom aan plant endogene en virale eiwitten bekend om verkeer via Pd, slechts drie PLSs hebben gemeld tot op heden, allemaal van endogene plantaardige eiwitten. Dus, is het belangrijk een betrouwbare en systematische experimentele strategie ter identificatie van een functioneel PLS-reeks, die zowel noodzakelijk als voldoende voor Pd targeting, direct in de woonkamer te ontwikkelen plantaardige cellen. Hier beschrijven we een dergelijke strategie als een paradigma met behulp van de cel-naar-cel verkeer proteïne (MP) van de tabak mosaic virus (TMV). Deze experimenten, die geïdentificeerd en gekenmerkt de eerste plant virale PLS, kunnen worden aangepast voor de ontdekking van PLS sequenties in meest Pd-gerichte eiwitten.

De representatieve gegevens, die getrouw illustreren de verwachte resultaten van de beschreven protocollen en de TMV MP PLS te identificeren, zijn aangepast van Yuan et al. 21. figuur 1A eerste geeft een overzicht van belangrijke constructies uiten de full-length TMV MP (1-268), TMV MP PLS (bestaande uit de eerste 50 aminozuurresidu's van het eiwit, 1-50), en haar alanine scannen V4A derivaten gesmolten GVB (gegenereerd als beschreven in s...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellulaire verbindingen, de plasmodesmata (Pd), spelen een centrale rol in plant fysiologie en plant-virus interacties. Kritische Pd vervoer zijn signalen dat rechtstreekse eiwitten aan Pd sorteren. Onze kennis over deze sequenties is echter nog in de kinderschoenen. Beschrijven we een strategie om te identificeren Pd lokalisatie signalen in Pd-gerichte eiwitten.

Identificatie van Plasmodesmal lokalisatie sequenties in eiwitten In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualiseren van Dengue Virus via Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Kweken Microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisaties (FISH) voor de lokalisatie van Virussen en Endosymbiotic Bacteriën in Plant en Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Met behulp van fluorescerende eiwitten te visualiseren en te kwantificeren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuole groeidynamiek in levende cellen

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Zuivering van viraal DNA voor de identificatie van geassocieerde virale en cellulaire eiwitten

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identificatie van merkers van de virulentie van Mycobacterium abscessus voor intracellulaire replicatie in fagocyten

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...