Name: identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta
Uploaded: 2017-08-15T12:30:00
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Für den Mangel an Raum meist Review-Artikel haben wir angeführt, und wir entschuldigen uns bei unseren Kollegen, deren ursprüngliche Arbeit nicht zitiert wurde. Die Arbeit im Labor V.C. wird unterstützt durch Zuschüsse aus NIH, NSF, USDA/NIFA, BARDEN und BSF, V.C. und das S.G.L. Labor wird unterstützt von NIH und Fonds aus den Abteilungen der Pflanzenpathologie und Pflanze-Mikroben Biologie, S.G.L.

(1) Pflanzenmaterial
<ol><li>Wahl der Pflanzenarten</li>
	<li>Verwenden Sie die Pflanzenarten heimisch in das Protein von Interesse, d. h., die dieses Protein für körpereigene Proteine kodiert oder der natürliche Wirt für den Erreger für virale Proteine darstellt. Darüber hinaus müssen die ausgewählten Pflanzenarten der gewählten Methode der Transienten genetische Transformation zugänglich sein. Hinweis: Die Studien beschäftigen routinemäßig Nicotiana Benthamiana, die einen guten Gastg...

Dieses Protokoll hat vier Kern-Bestandteile: das Konzept der Identifizierung einer Sequenz, die notwendig und ausreichend für die Zielgruppenadressierung auf Pd, systematische Einteilung des Proteins des Interesses der Fragmente, die in der Länge, degressiv sind Absicherung der getesteten Fragmente, ein Autofluorescent Protein, die dient sowohl als Tag als makromolekulare Fracht- und funktionelle Assay für Pd-targeting in lebenden Pflanzen Gewebe nach transiente Expression von den getesteten Fusionsproteinen. Beachten...

Plasmodesmata (Pd) Funktion als Kanäle für den interzellulären Transport der wichtigsten Regulatoren der Pflanzenentwicklung und Morphogenese von Transkriptionsfaktoren bis hin zu mRNA und kleine RNA-Moleküle. Darüber hinaus ist dieser makromolekularen Transport Pd durch die meisten Pflanzenviren für ihre interzellulären Ausbreitung während der Infektion ausgelastet; um Pd zu durchlaufen, entstanden Pflanzenviren spezialisierte Proteinen bezeichnet Bewegung Proteine (MPs), die gezielt auf Pd1,2,3,4,5,6 , 7. molekulare Signalwege Pd Transportmittel sind höchstwahrscheinlich mit spezifischen Sequenzen, die auf die transportierten Proteine in diese Bahnen eng verbunden. So kann Identifikation dieser Pd Lokalisierung Signale (PLSs) Diagnose der entsprechenden Pd Transport Weg sein. Dies ist analog der Pd Transport8, z. B. zu verschiedenen nuklearen Import Pathways, die spezifisch für verschiedene nukleare Lokalisierung Signal (NLS) Sequenzen9,10sein kann. Im Prinzip stehen für NLSs und PLSs nicht spaltbaren subzelluläre targeting-Sequenzen, die notwendig und ausreichend für die Ausrichtung sind. Im Gegensatz zu NLSs11ist jedoch die Reihenfolge Informationen über PLSs stark eingeschränkt. Insbesondere wurden nur vier Proteinsequenzen beteiligt bei der Ausrichtung der Pd mit allen von ihnen abgeleitet von endogenen pflanzlichen Proteinen beschrieben. Ersteres wird durch ein Homeobox-Domäne der KN112 – einen Transkriptionsfaktor, der Epidermis der Pflanze Blatt13 aus inneren Zellschichten bewegt – und seine KNOX homologe14dargestellt. Das zweite ist auch aus einen Transkriptionsfaktor, Dof, enthält eine vermeintliche PLS beschrieben als der interzellulären Handel (IT) Motiv15. Die dritte Sequenz ist aus das Membranprotein PDLP1 Plasmodesmata ansässige Typ 1, und es wird durch eine transmembrane Domäne16dargestellt. Schließlich die vierte Pd targeting Sequenz wurde kürzlich berichtet, für Glycosylphosphatidylinositole (GPI)-verankerte Proteine und es wird durch die Glycosylphosphatidylinositole (GPI) Änderung Signal17dargestellt.
Interessant ist, bis vor kurzem keine PLSs gemeldet wurden für virale MPs. Frühere Studien gezeigt das Vorhandensein von vermeintlichen PLS Sequenzen im Werk virale MPs18,19, aber keine wahre PLS, d. h., eine minimale Aminosäure-Sequenz notwendig und ausreichend für Pd Angriffe auf eine unabhängige Ladung Molekül ( zB., GFP) in eine virale MP identifiziert worden. Noch war eines dieser Proteine, MP das Tabakmosaikvirus (TMV), das erste für die Pd Lokalisierung und Transport demonstrierten20gewesen sein.
Um diese Lücke zu begegnen, entwickelten wir eine experimentelle Strategie um TMV MP PLS zu identifizieren. Diese Strategie basierte auf drei Konzepte. (i) Wir haben PLS als eine minimale Aminosäure-Sequenz, die notwendig und ausreichend für das Protein targeting auf Pd21ist definiert. (Ii) weil TMV MP richtet sich zunächst an Pd und dann durch diese Kanäle22translocates, wollten wir Entkopplung diese beiden Tätigkeiten und der Ausarbeitung der bona-fide PLS, welche Funktionen nur für Pd targeting und nicht für den nachfolgenden Verkehr. (Iii) wir analysiert die identifizierten PLS für Aminosäurereste wichtig für seine Pd targeting Aktivität, ob strukturell oder funktional. Mithilfe dieses Ansatzes abgegrenzt wir eine 50-amino Acid Rückstände Sequenz am amino-Terminus des TMV MP, die als bona fide PLS dient. Dies geschah durch produziert eine Reihe von TMV MP-Fragmente, die die gesamte Länge des Proteins gesättigt, tagging ihre Carboxylgruppen-Termini mit GFP und vorübergehend in Pflanzengewebe auszudrücken. PD-Lokalisierung aller getesteten Fragmente wurde durch coexpressing sie mit einem Pd Marker Protein, PDCB1 (Pd Zellstress bindendes Protein 1)23bestimmt. Die kleinsten Fragment, das nach wie vor auf Pd lokalisiert, aber nicht durchqueren, Pd, galt als PLS darstellen. Schließlich war die PLS Alanin gescannt, die wichtige Aminosäurereste benötigt für seine Struktur und/oder Funktion zu bestimmen.
Während hier wir diesen Ansatz mit der Kennung des TMV MP PLS Beschreibung veranschaulichen, können verwendet werden PLSs in jeder anderen Pd-bezogenen Proteinen zu entdecken ob Pflanzenpathogene oder die Pflanzen selbst kodiert; und zwar deshalb, weil unsere Methode keine Besonderheiten des viralen MPs in Bezug auf ihre Fähigkeit zum Ziel Pd nutzen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1086">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td>
			<td style="width:176px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">LSM5</td>
			<td style="width:349px;">Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zen software for confocal microscope imaging</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2009 version</td>
			<td>The software should be compatible with the CLSM used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quickchange II site-directed mutagenesis kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes without needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectinomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

Plasmodesmata (Pd) sind Zell-Zell-Verbindungen, die als Gateways fungieren durch die kleine und große Molekülen zwischen den Pflanzenzellen transportiert werden. Während Pd Transport von kleinen Molekülen, wie Ionen und Wasser, angenommen wird, dass passiv auftreten, Zell-Zell-Transport von biologischen Makromolekülen, solche Proteine am ehesten erfolgt über einen aktiven Mechanismus, spezifische targeting Signale auf der Molekül transportiert. Die Knappheit der identifizierten Plasmodesmata (Pd) Lokalisierung Signale (PLSs) hat stark eingeschränkt, das Verständnis der Protein-Sortierung Bahnen beteiligt zu Pflanzen, makromolekulare Transport von Zelle zu Zelle und Kommunikation. Aus einer Fülle von Pflanzen endogene und virale Proteine bekannt für den Verkehr durch Pd, nur drei PLSs gemeldet wurden bis heute wurden alle von endogenen pflanzlichen Proteinen. So ist es wichtig, eine zuverlässige und systematische experimentelle Strategie um einen Funktionsablauf PLS zu identifizieren, die sowohl notwendig und ausreichend für Pd-targeting, direkt im Wohnzimmer zu entwickeln Pflanzenzellen. Hier beschreiben wir eine solche Strategie verwenden als Paradigma der Zelle zu Zelle Bewegung Protein (MP) das Tabakmosaikvirus (TMV). Diese Experimente, die identifiziert und charakterisiert die erste virale PLS plant, kann für Entdeckung der PLS-Sequenzen in den Pd-bezogenen Proteinen angepasst werden.

Die repräsentativen Daten, die treu illustrieren die beschriebenen Protokolle erwarteten Ergebnisse und der TMV MP PLS zu identifizieren, werden angepasst von Yuan Et al. 21. Abbildung 1A zuerst fasst wichtige Konstrukte, die mit dem Ausdruck der Full-length TMV MP (1-268), TMV MP PLS (bestehend aus den ersten 50 Aminosäurereste des Proteins, 1-50), und seine Alanin Scannen V4A Derivate mit GFP (generiert als verschmolzen beschriebenen S...

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Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Pflanze interzelluläre Verbindungen, die Plasmodesmata (Pd), spielen zentrale Rollen im Werk Physiologie und Pflanzenvirus Interaktionen. Entscheidend für den Pd-Transport sind Signale, die Proteine zu Pd direkte sortieren. Unser Wissen über diese Sequenzen ist jedoch noch in den Kinderschuhen. Wir beschreiben eine Strategie zur te-Lokalisierung-Signalen in Pd gezielt Proteine zu identifizieren.

Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

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Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Forschung

Immunologie und Infektion

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The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

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What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...