Name: identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta
Uploaded: 2017-08-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

על חוסר מקום, בקידושין שהבאנו בעיקר סקירת מאמרים, אנו מתנצלים לעמיתים שלנו שעבודתם המקורי לא צוטט. העבודה במעבדה וייטקונג נתמך על ידי מענקים NIH, ה-NSF, משרד החקלאות/NIFA, ברד, BSF וייטקונג, המעבדה S.G.L. נתמך על ידי NIH כספים מן המחלקות של פתולוגיה ביולוגיה צמח-חיידק S.G.L.

1. חומר צמחי
<ol><li>הבחירה של מיני צמחים</li>
	<li>השתמש המין צמח ילידי החלבון של עניין, דהיינו, אחד אשר מקודד חלבון זה חלבונים אנדוגני, או המייצג המארחת הטבעי של המחלה חלבונים נגיפיים. בנוסף, המין הצמח הנבחר חייב להיות נוטה? בשיטה של שינוי גנטי ארעית. הערה: המחקרים באופן שגרתי להעסיק טבק be...

פרוטוקול זה יש ארבעה מרכיבי הליבה: הרעיון של זיהוי רצף הוא נחוץ וגם מספיק עבור מיקוד לתחנת משטרה, חטיבת שיטתית של החלבון עניין לחלקים שגודלם מצטמצם בהדרגה אורך, פיוזינג נבדק קטעים לחלבון autofluorescent המשמשת כתג והן מטען macromolecular, וכן assay פונקציונלי עבור משטרת פילוח חיים צמח רקמות בעקבות הביטוי ?...

הפונקציה plasmodesmata (Pd) כערוצים עבור תעבורה המערכת של הרגולטורים מפתח של התפתחות הצמח, מורפוגנזה, ועד גורמי שעתוק mRNA של מולקולות RNA קטנות. יתר על כן, יכולתו macromolecular התחבורה של המשטרה הוא מנוצל על ידי מרבית הווירוסים צמח על התפשטות המערכת שלהם במהלך זיהום; כדי לעבור בין Pd, וירוסים התפתחו חלבונים מיוחדים, כינה את התנועה חלבונים (MPs), שמתמקדים Pd1,2,3,4,5,6 , 7. מסלולים מולקולריים התחבורה Pd רוב הסיכויים הם מחוברים בצורה אינטימית עם הרצפים ספציפי שמכוון את החלבונים מועבר לתוך המסלולים הללו. לפיכך, זיהוי אותות לוקליזציה אלה Pd (PLSs) ייתכן אבחון של מסלול התחבורה Pd המתאימים. זאת על ידי השוואה של משטרת התעבורה8, לדוגמה, מסלולים שונים ייבוא גרעינית, אשר יכול להיות ספציפיות עבור שונה לוקליזציה גרעיני אות (שקל) רצפים9,10. מבחינה מושגית, הן NLSs והן PLSs מייצגים רצפים מיקוד subcellular-cleavable הכרחי ובלתי מספיק עבור מיקוד. אולם, בניגוד NLSs11, המידע רצף על PLSs היא מוגבלות מאוד. באופן ספציפי, רק ארבעה רצפים חלבון מעורב Pd מיקוד דווחו, עם כולן נגזר פרוטאינים צמחיים אנדוגני. הראשון מיוצג על ידי תחום גנים homeobox של KN112 – גורם שעתוק שזז משכבות התא הפנימי כדי אפידרמיס של עלה צמח13 – ו שלו homologs נוקס14. . השני גם הוא מפקטור שעתוק, Dof, אשר מכיל PLS בשם תיאר את הסחר המערכת (IT) מוטיב15. הרצף השלישי של החלבון ממברנה PDLP1 plasmodesmata תושב סוג 1, הוא מיוצג על ידי תחום transmembrane16. לבסוף, המשטרה הרביעי מיקוד רצף דווח לאחרונה על glycosylphosphatidylinositol (GPI)-חלבונים מעוגן וזה מיוצג על ידי האות השינוי17glycosylphosphatidylinositol (GPI).
מעניין, עד ממש לאחרונה, דווחו PLSs אין עבור MPs ויראלי. מחקרים קודמים מצביעות על הימצאות בשם רצפים PLS צמח-18,MPs-ויראלי-19, אך אין PLS אמיתי, דהיינו, רצף חומצת אמינו מינימלי הכרחי והן מספיקות עבור משטרת פילוח של (מולקולה מטענים לא קשורים למשל., CFP) זוהתה ב MP נגיפי. עוד אחד החלבונים האלה, MP של נגיף פסיפס הטבק (TMV), היה הראשון אשר Pd לוקליזציה ותעבורה כבר הפגינו20.
כדי לטפל פער זה, פיתחנו אסטרטגיית ניסיוני לזהות TMV MP PLS. אסטרטגיה זו התבססה על שלושה מושגים. (i) אנחנו מוגדרים PLS כרצף חומצת אמינו מינימלי הכרחי ולא מספיק חלבון המיקוד Pd21. (ii) כי TMV MP תחילה מטרות Pd, ואז translocates דרך ערוצים אלה22, אנחנו מכוונים uncoupling שתי פעילויות וזיהוי ביסקוויטים בתום לב, אשר מתפקד רק עבור משטרת מיקוד, ולא על הטרנספורט עוקבות. (iii). ניתחנו ביסקוויטים מזוהה עבור שאריות חומצה אמינית חשובה עבור שלה Pd מיקוד פעילות, בין אם מבחינה מבנית או פונקציונלית. באמצעות גישה זו, מאפשרת לנו רצף שאריות חומצה אמינו 50 התחנה הסופית-אמינו של MP TMV שפועל PLS בתום-לב. זה נעשה על ידי הפקת סדרת שברי TMV MP כי רווי לכל אורכה של החלבון, תיוג שלהם carboxyl-termini עם CFP transiently לבטא אותם ברקמות הצמח. משטרת לוקליזציה של כל אחד מהשברים שנבדקו נקבע על-ידי coexpressing אותם עם משטרת סמן חלבון, PDCB1 (משטרת callose מחייב חלבון 1)23. השבר הקטן עדיין מקומי לתחנת משטרה, אך לא לחצות Pd, נחשב לייצוג PLS. לבסוף, ביסקוויטים היה אלנין-סריקה כדי לקבוע את שאריות מפתח חומצת אמינו הדרושות עבור מבנה ו/או הפונקציה שלה.
ואילו כאן אנחנו להמחיש את גישה זו על-ידי תיאור זיהוי של MP TMV PLS, זה עשוי להיות מועסק לגלות PLSs בחלבונים כל אחרים, ממוקדות Pd, אם מקודד על ידי פתוגנים צמח או את הצמחים עצמם; זה בגלל השיטה שלנו לא לנצל את כל תכונות ייחודיות של MPs ויראלי לגבי יכולתם היעד לתחנת משטרה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1086">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td>
			<td style="width:176px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">LSM5</td>
			<td style="width:349px;">Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zen software for confocal microscope imaging</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2009 version</td>
			<td>The software should be compatible with the CLSM used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quickchange II site-directed mutagenesis kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes without needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectinomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

Plasmodesmata (Pd) הם חיבורים לתא לתפקד כשערי שדרכו מולקולות קטנות וגדולות מועברים בין תאי הצמח. ואילו משטרת התעבורה של מולקולות קטנות, כגון יונים, מים, יש להניח להתרחש באופן. פסיבי, תחבורה לתא של מקרומולקולות ביולוגיות, כגון חלבונים, קרוב לוודאי מתרחשת דרך מנגנון פעיל המערבת אותות מיקוד ספציפי על מועבר מולקולה. המחסור אותות לוקליזציה מזוהה plasmodesmata (Pd) (PLSs) הגבלות קשות על ההבנה של מיון חלבונים המעורבים בצמח-לתא macromolecular תחבורה ותקשורת. מתוך שפע של הצמח חלבונים אנדוגני וויראליים ידועים תעבורה דרך Pd, PLSs רק שלושה דווחו עד היום, כולם בעלי פרוטאינים צמחיים אנדוגני. לכן, חשוב לפתח אסטרטגיה שיטתית ואמין ניסיוני לזהות את רצף PLS פונקציונלי, הוא הצורך וגם מספיק עבור מיקוד Pd, ישירות בסלון לשתול תאים. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה אחת כזו באמצעות כמו פרדיגמה החלבון-לתא התנועה (MP) של נגיף פסיפס הטבק (TMV). ניסויים אלו, מזוהה, מאופיין הראשון לשתול PLS ויראלי, ניתן להתאים עבור גילוי PLS רצפי חלבונים ביותר, ממוקדות Pd.

הנתונים נציג, בנאמנות להמחיש את התוצאות צפוי מן הפרוטוקולים שתואר ולזהות את TMV MP PLS, המותאמים מ יואן. et al. 21. איור 1A מסכם ראשון המבנים העיקריים לבטא את באורך מלא TMV MP (1-268), TMV MP PLS (הכוללת את שאריות חומצה אמינית קודם 50 של החלבון, 1-50), ו שלה אלנין סריקה V4A ...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

צמח חיבורי המערכת, plasmodesmata (Pd), ממלאים תפקידים מרכזי במפעל אינטראקציות פיזיולוגיה של הצמח-וירוס. קריטי להעביר Pd המיון מתבצע אותות ישיר חלבונים לתחנת משטרה. עם זאת, הידע שלנו על רצפי אלה הוא עדיין בחיתוליו. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות Pd אותות לוקליזציה בחלבונים Pd, ממוקדות.

זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

פלואורסצנציה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאות (דגים) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים Endosymbiotic בצמח ורקמות חרקים

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת<em&gt; כלמידיה</em&gt; חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

זיהוי סמנים התקפה אלימה של Mycobacterium abscessus עבור שכפול תאיים ב Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...