Name: identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta
Uploaded: 2017-08-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

Per la mancanza di spazio, abbiamo citato principalmente articoli di recensione e ci scusiamo con i nostri colleghi cui lavoro originale non è stato citato. Il lavoro in laboratorio V.C. è supportato da sovvenzioni dal NIH, NSF, USDA/catino, BARD e BSF a V.C., e il laboratorio S.G.L è supportato da NIH e fondi dai dipartimenti di patologia vegetale e biologia vegetale-microbo a S.G.L

1. il materiale vegetale
<ol><li>Scelta delle specie vegetali</li>
	<li>Utilizzare le specie vegetali autoctone alla proteina di interesse, vale a dire, uno che codifica questa proteina per proteine endogene o che rappresenta l'ospite naturale per l'agente patogeno per proteine virali. Inoltre, le specie vegetali selezionati devono essere suscettibili del metodo scelto di trasformazione genetica transitoria. Nota: Gli studi utilizzano abitualmente Nicotiana benthamiana, che rappresenta un buon padr...

Questo protocollo ha quattro componenti principali: il concetto di identificazione di una sequenza che è necessario e sufficiente per il targeting al Pd, divisione sistematica della proteina di interesse in frammenti che sono progressivamente ridotti in lunghezza, fondendo il collaudato frammenti di una proteina di autofluorescent che serve sia come tag e come cargo macromolecolare e analisi funzionale per il Pd targeting in vita pianta tessuti dopo l'espressione transitoria delle proteine di fusione testata. Si noti ch...

I Plasmodesmi (Pd) funzionano come condotti per trasporto intercellulare di regolatori chiave di sviluppo di pianta e morfogenesi, che vanno da fattori di trascrizione di mRNA e piccole molecole di RNA. Inoltre, questa capacità di trasporto macromolecolare del Pd è utilizzata dalla maggior parte dei virus vegetali per la loro diffusione intercellulare durante l'infezione; per spostarsi tra Pd, virus vegetali si sono evolute proteine specializzate, chiamate proteine di movimento (MPs), che si rivolgono specificamente a Pd1,2,3,4,5,6 , 7. vie molecolari di trasporto Pd molto probabilmente sono intimamente interconnesse con le sequenze specifiche che mirano le proteine trasportate in queste vie. Così, identificazione di questi segnali di localizzazione di Pd (PLSs) può essere diagnostica del pathway di trasporto corrispondente di Pd. Questo è per analogia di Pd trasporto8, ad esempio, alle vie di importazione nucleare differenti, che possono essere specifiche per differenti localizzazione nucleare (NLS) di segnale sequenze9,10. Concettualmente, sia NLSs e PLSs rappresentare non liberabili sequenze di targeting subcellulare che sono necessarie e sufficienti per il targeting. Tuttavia, a differenza di NLSs11, le informazioni di sequenza PLSs sono severamente limitate. In particolare, sono state segnalate solo quattro sequenze di proteine coinvolte nel Pd targeting, con tutti i loro derivati da proteine vegetali endogeni. Il primo è rappresentato da un dominio homeobox di KN112 – un fattore di trascrizione che si muove da strati di cellule interne all'epidermide della pianta foglia13 – e i suoi omologhi di KNOX14. Quello secondo è anche da un fattore di trascrizione, Dof, che contiene un putativo PLS descritto come la tratta intercellulare (IT) motivo15. La terza sequenza è dalla proteina della membrana i plasmodesmi residente tipo 1 PDLP1, ed è rappresentato da un dominio transmembrana16. Infine, il quarto Pd sequenza di targeting recentemente è stato segnalato per glicosilfosfatidilinositolo (GPI)-proteine ancorate ed esso è rappresentato dal segnale di modificazione glicosilfosfatidilinositolo (GPI)17.
È interessante notare che, fino a poco tempo fa, nessun PLSs sono stati segnalati per MPs virale. Gli studi precedenti hanno indicato la presenza di presunti PLS sequenze in pianta virale MPs18,19, ma nessun vero PLS, vale a dire, una sequenza di amminoacido minimo necessaria e sufficiente per il Pd targeting di un carico indipendenti molecola ( ad es., PCP) è stata identificata in un MP virali. Ancora una di queste proteine, MP del virus del mosaico del tabacco (TMV), era il primo per cui Pd localizzazione e trasporti sono stati dimostrati20.
Per colmare questa lacuna, abbiamo sviluppato una strategia sperimentale per identificare TMV MP PLS. Questa strategia si basa su tre concetti. (i) abbiamo definito PLS come una sequenza di amminoacido minimo che è necessario e sufficiente per il targeting di proteina a Pd21. (ii) perché TMV MP in primo luogo destinato a Pd e poi trasloca attraverso questi canali22, abbiamo mirato a disgiungere queste due attività e identificare il PLS buona fede, che funziona solo per il targeting del Pd e non per il successivo trasporto. (iii) abbiamo analizzato il PLS identificato per residui dell'aminoacido importante per suo Pd targeting attività, sia strutturalmente che funzionalmente. Utilizzando questo approccio, abbiamo delineato una sequenza di 50-ammino acido residuo dell'estremità amminica di TMV MP che funge da PLS buona fede. Questo è stato fatto da producendo una serie di frammenti di TMV MP che satura l'intera lunghezza della proteina, tagging loro carbossilico-termini con PCP e transitoriamente esprimerli nei tessuti vegetali. Localizzazione del PD di ciascuno dei frammenti testati è stato determinato che li coexpressing con una proteina marker Pd, PDCB1 (Pd callosio proteina obbligatoria 1)23. Il frammento più piccolo che ancora localizzato al Pd, ma non ha fatto attraversare il Pd, è stato considerato per rappresentare PLS. Infine, il PLS era alanina-analizzati per determinare i residui dell'aminoacido chiave necessari per la sua struttura e/o funzione.
Considerando che qui illustriamo questo approccio descrivendo identificazione di TMV MP PLS, può essere impiegato per scoprire PLSs in qualsiasi altre proteine Pd-mirati, se codificato da patogeni vegetali o da impianti stessi; Questo è perché il nostro metodo non approfittare di eventuali caratteristiche uniche di MPs virale per quanto riguarda la loro capacità di destinazione al Pd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1086">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td>
			<td style="width:176px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">LSM5</td>
			<td style="width:349px;">Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zen software for confocal microscope imaging</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2009 version</td>
			<td>The software should be compatible with the CLSM used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quickchange II site-directed mutagenesis kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes without needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectinomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

I Plasmodesmi (Pd) sono connessioni cellula--cellula che fungono da gateway attraverso cui piccole e grandi molecole sono trasportate tra cellule vegetali. Considerando che il trasporto del Pd di piccole molecole, quali gli ioni ed acqua, è presunta per accadere passivamente, cellula--cellula trasporto di macromolecole biologiche, tali proteine, si verifica molto probabilmente attraverso un meccanismo attivo che coinvolge specifici segnali di targeting sul trasportato della molecola. La scarsità di segnali di localizzazione identificati i Plasmodesmi (Pd) (PLSs) ha limitato severamente la comprensione della proteina-ordinamento pathways coinvolti nella pianta cellula--cellula macromolecolari trasporti e comunicazioni. Da una ricchezza di pianta proteine endogene e virale conosciute al traffico attraverso Pd, PLSs solo tre sono stati segnalati fin qui, tutti loro da proteine vegetali endogeni. Quindi, è importante sviluppare una strategia sperimentale sistematica e affidabile per identificare una sequenza PLS funzionale, che è necessario e sufficiente per il Pd targeting, direttamente nel soggiorno cellule vegetali. Qui, descriviamo una tale strategia utilizzando come paradigma della proteina della cellula--cellula movimento (MP) del virus del mosaico del tabacco (TMV). Questi esperimenti, che identificato e caratterizzato il primo impianto PLS virale, può essere adattati per l'individuazione di sequenze PLS in proteine più Pd-mirati.

I dati rappresentativi, che fedelmente illustrano i risultati attesi dai protocolli descritti e identificano il TMV MP PLS, sono adattati da Yuan et al. 21. Figura 1A prima vengono riepilogate le principali costrutti esprimendo il full-length TMV MP (1-268), TMV MP PLS (comprendente i primi 50 residui dell'amminoacido della proteina, 1-50), e sua alanina scansione V4A derivati fusa per PCP (generata come descritte al punto 2.2 passaggi, 5....

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Connessioni intercellulari di pianta, la Plasmodesmi (Pd), giocano un ruolo centrale nella pianta interazioni pianta-virus e di fisiologia. Critica ai trasporti Pd sono smistamento segnali che indirizzano proteine al Pd. Tuttavia, la nostra conoscenza di queste sequenze è ancora nella sua infanzia. Descriviamo una strategia per identificare i segnali di localizzazione di Pd in proteine Pd-mirati.

Identificazione di sequenze di localizzazione Plasmodesmal in proteine In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualizzazione virus Dengue attraverso Alexa Fluor Etichettatura

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Coltura Microglia dal Sistema Nervoso Centrale neonatale e adulti

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazioni (FISH) per la localizzazione di virus e batteri endosimbiontica a Plant e Insetti tessuti

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per visualizzare e Quantificazione<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuolo crescita dinamica in cellule viventi

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapida identificazione dei batteri Gram-negativi dal sangue brodo di coltura Uso MALDI-TOF

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Purificazione di DNA virale per l'identificazione delle proteine virali e cellulari associate

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identificazione di fattori di virulenza di Mycobacterium abscessus per replica intracellulare nei fagociti

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...