Name: identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta
Uploaded: 2017-08-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

Vi sitert det meste oversiktsartikler av mangel på plass, og vi beklager til våre kolleger som originale arbeider ikke ble nevnt. Arbeidet i V.C. laboratorium støttes av tilskudd fra NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD og BSF til V.C. og delefilter laboratoriet støttes av NIH og midler fra avdelinger av anlegget patologi og plante-mikrobe biologi til delefilter

1. plantemateriale
<ol><li>Valg av plantearter</li>
	<li>Bruk plantearter innfødt til protein av interesse, dvs., som kodes dette proteinet for endogene proteiner eller som representerer naturlig vert for patogen for virale proteiner. Valgte plantearter må i tillegg være mottakelig for den valgte metoden forbigående genetisk transformasjon. Merk: Studier rutinemessig ansette Nicotiana benthamiana, som representerer en god vert for TMV og omdannes effektivt ved Agrobacterium-mediert genetisk tra...

Denne protokollen har fire core bestanddeler: begrepet identifisere en sekvens som er både nødvendig og tilstrekkelig for målretting for Pd, systematisk arbeidsdeling protein av interesse i fragmenter som gradvis reduseres i lengde, blander den testet fragmenter til en autofluorescent protein som tjener både som koden og macromolecular Last og funksjonelle analysen for Pd målretting i levende plante vev etter forbigående uttrykk for testet fusion proteiner. Merk at Agrobacterium-mediert forbigående uttrykk generer...

Plasmodesmata (Pd) fungere som kanaler for intercellulære transport av viktige regulatorer anlegget og morphogenesis, alt fra transkripsjonsfaktorer mRNA og små RNA molekyler. Videre er benyttes denne macromolecular kapasitet av Pd av de fleste plante virus for deres intercellulære spredning under infeksjon; Hvis du vil flytte Pd, har plante virus utviklet spesialiserte proteiner, kalt bevegelse proteiner (MPs), som spesifikt mål Pd1,2,3,4,5,6 , 7. molekylær veier av Pd transport sannsynligvis er nært sammen med bestemte sekvensene som mål transportert proteiner i disse veiene. Identifikasjon av disse Pd lokalisering signaler (PLSs) kan dermed være diagnostiske av den tilsvarende Pd transport veien. Dette er ved analogi Pd transport8, for eksempel å forskjellige kjernefysiske import trasé, som kan være spesifikke for ulike kjernefysiske lokalisering signal (NLS) sekvenser9,10. Konseptuelt, representerer både NLSs og PLSs ikke-cleavable subcellular målretting sekvenser som er nødvendig og tilstrekkelig for målretting. Men i motsetning til NLSs11er sekvens informasjon om PLSs sterkt begrenset. Spesielt, er bare fire protein sekvenser involvert i Pd målretting rapportert, med alle av dem fra endogene anlegget proteiner. Den første som representeres av et homeobox-domene KN112 -en transkripsjon faktor som flytter fra indre lag til overhuden anlegg blad13 -og dens KNOX homologs14. Andre er også fra en transkripsjon faktor, Dof, som inneholder en antatte PLS beskrevet som intercellulære smugling (IT) motiv15. Den tredje sekvensen er fra PDLP1 plasmodesmata-bolig type 1 membran protein, og det er representert ved en transmembrane domene16. Til slutt, fjerde Pd målretting sekvensen ble nylig rapportert for glycosylphosphatidylinositol (GPI)-forankret proteiner og det er representert ved glycosylphosphatidylinositol (GPI) endring signal17.
Interessant, har ingen PLSs inntil ganske nylig, er rapportert for viral MPs. Tidligere studier angitt tilstedeværelsen av antatte PLS sekvenser i anlegget viral MPs18,19, men ingen sanne PLS, dvsen minimal aminosyresekvens både nødvendig og tilstrekkelig for Pd målretting av en urelaterte Last molekyl ( f.eks., CFP) har blitt identifisert i en viral MP. Enda var en av disse proteinene, MP av tobakk mosaikk virus (TMV), først som Pd lokalisering og transport har vært demonstrert20.
For å dekke dette gapet, utviklet vi en eksperimentell strategi for å identifisere TMV MP PLS. Denne strategien var basert på tre konsepter. (i) vi definert PLS som en minimal aminosyresekvens som er både nødvendig og tilstrekkelig for protein målretting til Pd21. (ii) fordi TMV MP først mål Pd og deretter translocates gjennom disse kanalene22, rettet vi mot uncoupling disse to aktivitetene og identifisere bona fide PLS, som fungerer bare for Pd målretting, og ikke for påfølgende transport. (iii) vi analysert de identifiserte PLS for aminosyre rester viktig for sin Pd målretting aktivitet, enten strukturelt eller funksjonelt. Bruker denne tilnærmingen, avgrenset vi en 50-amino acid rester sekvens på amino-terminus av TMV MP som fungerer som bona fide PLS. Dette ble gjort ved å produsere en rekke TMV MP fragmenter som mettet hele lengden av protein, merking deres carboxyl-termini med CFP og transiently uttrykker dem i anlegget vev. PD lokalisering av testet fragmenter ble bestemt av coexpressing dem med en Pd markør protein, PDCB1 (Pd callose binding protein 1)23. Minste fragmentet som fortsatt lokalisert til Pd, men ikke går Pd, ble ansett som representerer PLS. Endelig var PLS alanin skannet å finne viktig aminosyre rester kreves for sin struktur og funksjon.
Mens her vi illustrere denne tilnærmingen ved å beskrive identifikasjon av TMV MP PLS, kan det brukes å oppdage PLSs i noen andre Pd-målrettet proteiner, om kodet av plante-patogener eller planter selv; Dette er fordi vår metode ikke dra nytte av viral MPs med hensyn til deres evne til å målrette unike funksjoner Pd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1086">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td>
			<td style="width:176px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">LSM5</td>
			<td style="width:349px;">Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zen software for confocal microscope imaging</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2009 version</td>
			<td>The software should be compatible with the CLSM used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quickchange II site-directed mutagenesis kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes without needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectinomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

Plasmodesmata (Pd) er celle til celle tilkoblinger som fungerer som inngangsporter gjennom små og store molekyler transporteres mellom anlegget celler. Mens Pd transport av små molekyler, som ioner og vann, antas å oppstå passivt, celle-til-celle transport av biologiske makromolekyler, slik proteiner, sannsynligvis skjer via en aktiv mekanisme som involverer målretting sender på den transporteres molekylet. Knapphet på identifiserte plasmodesmata (Pd) lokalisering signaler (PLSs) har sterkt begrenset forståelse av protein-sortering trasé involvert i plante celle til celle macromolecular transport og kommunikasjon. Fra et vell av endogene og virale proteiner kjent trafikk gjennom Pd, bare tre PLSs er rapportert til dags dato, alle av dem fra endogene anlegget proteiner. Det er derfor viktig å utvikle en pålitelig og systematisk eksperimentelle strategi for å identifisere en funksjonell PLS sekvens, som er både nødvendig og tilstrekkelig for Pd målretting, direkte i levende anlegget celler. Her beskriver vi en slik strategi med som et paradigme celle til celle bevegelse protein (MP) av tobakk mosaikk virus (TMV). Disse eksperimentene, som identifisert og preget første anlegget viral PLS, kan tilpasses for oppdagelse av PLS sekvenser i mest Pd målrettede proteiner.

Representant dataene, som trofast illustrerer resultatene fra beskrevet protokollene og identifisere TMV MP PLS, er tilpasset fra Yuan et al. 21. figur 1A først summerer store konstruksjoner uttrykke full lengde TMV MP (1-268), TMV MP PLS (bestående av de første 50 aminosyre rester av protein, 1-50), og dens alanin skanning V4A derivater del CFP (generert som beskrevet i trinnene 2.2, 5.2 og 6) mens figur 1B oppsummerer...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Anlegget intercellulære tilkoblinger, plasmodesmata (Pd), spille sentrale roller i anlegget fysiologi og plante-virus interaksjoner. Kritisk til Pd transport sorterer signaler som direkte proteiner til Pd. Vår kunnskap om disse sekvensene er imidlertid fortsatt i sin barndom. Vi beskriver en strategi for å identifisere Pd lokalisering signaler i Pd-målrettet proteiner.

Identifikasjon av Plasmodesmal lokalisering sekvenser i proteiner i Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Dyrking Microglia fra Neonatal og voksne sentralnervesystemet

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridiser (FISH) for lokalisering av virus og Endosymbiotic Bakterier i plante-og insekt Vev

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Bruke Fluorescent Proteiner å visualisere og kvantifisere<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Vekst Dynamics i levende celler

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapid Identifikasjon av gramnegative bakterier fra blodkultur buljong Bruke MALDI-TOF massespektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Rensing av Viral DNA for identifikasjon av tilknyttet Viral og cellulær proteiner

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolasjon av Salmonella typhimurium-som inneholder Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identifikasjon av virulens markører av Mycobacterium abscessus for intracellulær replikering i Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...