Name: identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta
Uploaded: 2017-08-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

За неимением места мы упоминали главным образом обзор статей, и мы приносим извинения нашим коллегам, чьи оригинальные работы не упоминалась. Работа в лаборатории V.C. поддерживается грантов из низ, NSF, USDA/НИФА, Бард и ФСБ V.C., и S.G.L. Лаборатория поддерживается низ и средств от департаментов растений патологии и биологии растений-микробных S.G.L.

1. растительный материал
<ol><li>Выбор растений</li>
	<li>Используйте видов растений, родной белка интерес, то есть, один, который кодирует этот белок для эндогенного белки или которое представляет естественный хост для патогенных вирусных белков. Кроме того выбранные растения должны по?...

Этот протокол имеет четыре основных составляющих: концепция определения последовательности, которая является необходимым и достаточным для ориентации Pd, систематическое разделение протеина интереса на фрагменты, которые постепенно сокращается в длину, фьюзинг испытанные фрагменты ...

Plasmodesmata (Pd) функционировать в качестве каналов для межклеточных транспорта ключевых регуляторов развития растений и морфогенеза, начиная от факторов транскрипции мРНК и малых молекул РНК. Кроме того этот макромолекулярных транспортного потенциала Pd используется большинство вирусов растений для их межклеточных распространения во время инфекции; для перемещения по Pd, вирусов растений развивались специализированные белки, называются движения белки (MPs), которые специально направлены Pd1,,2,3,4,5,,6 , 7. молекулярные пути переноса Pd скорее тесно взаимосвязана с специфических последовательностей, которые предназначены перевозимые белков в эти пути. Таким образом идентификация этих сигналов локализации Pd (PLSs) может быть диагностических соответствующего пути транспорта Pd. Это по аналогии Pd транспорта8, например, различных ядерных импорт путей, которые могут быть специфическими для различных ядерной локализации сигнала (NLS) последовательности9,10. Концептуально ОУЖН и PLSs представления не горные субцеллюлярные таргетинга последовательностей, которые являются необходимыми и достаточными для ориентации. Однако в отличие от ОУЖН11, последовательностью информацию о PLSs крайне ограничена. В частности были зарегистрированы только четыре белковых последовательностей, участвующих в Pd ориентации, со всеми из них производные от эндогенных растительных белков. Первый из них представляет гомеобокс домен KN112 – транскрипционный фактор, который перемещается из внутренней ячейки слоев эпидермиса листа растений13 – и его Нокс гомолог14. Второй тоже от транскрипционный фактор, глубина резкости, который содержит предполагаемый PLS, описывается как межклеточных людьми, (она) мотив15. Третьего последовательности от PDLP1 plasmodesmata резидентов типа 1 Мембранный белок, и оно представлено трансмембранных доменов16. Наконец, четвертый Pd, ориентация последовательность недавно сообщалось за glycosylphosphatidylinositol (GPI)-якорь белков и он представлен сигнала модификации glycosylphosphatidylinositol (GPI)17.
Интересно, что до совсем недавнего времени, были зарегистрированы не PLSs для вирусных депутатов. Предыдущие исследования показали наличие предполагаемого PLS последовательностей в завод вирусных м/с18,19, но не верно PLS, т.е., минимальный аминокислотная последовательность необходимых и достаточных для Pd ориентации молекулы (не связанных грузовые например., CFP) была обнаружена в Вирусный MP. Еще один из этих белков, депутат вирус мозаики табака (ПДЦ), был первым, для которых Pd локализации и транспорта были показали20.
Чтобы устранить этот разрыв, мы разработали экспериментальный стратегию для выявления TMV MP PLS. Эта стратегия основана на трех концепций. (i) мы определили PLS как минимальный аминокислотной последовательности, которая является необходимым и достаточным для белка ориентации Pd21. (ii) потому что TMV MP впервые предназначено Pd и затем translocates через эти каналы22, мы нацелены на расцеплять эти два вида деятельности и выявления добросовестных PLS, который работает только для Pd ориентации и не для последующей перевозки. (iii) мы проанализировали выявленных PLS для аминокислотных остатков важное для его Pd, ориентация деятельности, будь то структурно и функционально. Используя этот подход, мы определены последовательность 50-амино кислоты вычетов в амино terminus TMV MP, который действует как bona fide PLS. Это было сделано путем подготовки серии TMV MP фрагментов, которые насыщенных по всей длине белка, пометки их карбоксильные Термини с CFP и временно выражая их в тканях растений. PD локализации каждого из протестированных фрагментов определяется coexpressing их с белками маркер Pd, PDCB1 (Pd callose белок, связывающий 1)23. Считается, что маленький фрагмент, который по-прежнему локализованы для Pd, но не передаются Pd, представляют PLS. Наконец PLS был аланин сканирования для определения ключевых аминокислотных остатков, необходимых для его структуры или функции.
Тогда как здесь мы иллюстрируют этот подход, описывая идентификации TMV MP PLS, он может использоваться для обнаружения PLSs в любой другой Pd целевых белков, ли закодированные патогенов растений или растения сами; Это потому, что наш метод не воспользоваться любой уникальные особенности вирусных депутатов в отношении их способности целевой Pd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1086">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td>
			<td style="width:176px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">LSM5</td>
			<td style="width:349px;">Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zen software for confocal microscope imaging</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2009 version</td>
			<td>The software should be compatible with the CLSM used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quickchange II site-directed mutagenesis kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes without needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectinomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

Plasmodesmata (Pd) являются соединения к ячейке, которые функционируют как шлюзы, через которые перевозятся мелких и крупных молекул между растительных клеток. Pd транспорта малых молекул, ионов и воды, предположительно происходит пассивно, в то время как к ячейке транспорт биологических макромолекул, такие белки, наиболее вероятно происходит через активный механизм, который включает в себя конкретные определения сигналов на перевозимых молекулы. Нехватка выявленных plasmodesmata (Pd) локализация сигналов (PLSs) строго ограниченных понимание белка сортировка пути, участвующие в завод в ячейке макромолекулярных транспорта и связи. С обилием растений эндогенного и вирусные белки, известный трафик через Pd, только три PLSs поступили на сегодняшний день, все из них от эндогенных растительных белков. Таким образом, она имеет важное значение для разработки надежных и систематических экспериментальной стратегии для выявления функциональных PLS последовательности, что является необходимым и достаточным для Pd ориентации, непосредственно в живых растительных клеток. Здесь мы описываем одной такой стратегии, используя в качестве парадигмы к ячейке движение белка (МП) вирус мозаики табака (ПДЦ). Эти эксперименты, которые выявлены и охарактеризованы первый завод вирусный PLS, могут быть приспособлены для обнаружения последовательностей PLS в наиболее Pd целевых белков.

Репрезентативных данных, которые добросовестно иллюстрируют результаты, ожидаемые от описанные протоколы и идентифицировать TMV MP PLS, взяты из Юань и др. 21. на рисунке 1A сначала кратко основные конструкции, выражая полнометражного TMV MP (1-268), ВТ?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Завод межклеточных соединений, plasmodesmata (Pd), играют центральную роль в заводе физиологии и завод вирус взаимодействий. Важнейшее значение для Pd транспорта производится сортировка сигналы, которые направляют белки для Pd. Однако, наши знания об этих последовательностей все еще находится в зачаточном состоянии. Мы описываем стратегию для выявления локализации сигналы Pd Pd целевых белков.

Выявление Plasmodesmal локализации последовательностей белков в Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Генотипическая вывода ВИЧ-1 тропизм Использование Популяционные Секвенирование V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Визуализация вируса денге через Alexa Fluor маркировки

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Культивирование Микроглии от новорожденных и взрослых центральной нервной системы

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Флуоресценция<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизации (FISH) для локализации вирусов и эндосимбиотических бактерий в растений и насекомых тканей

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Использование флуоресцентных белков для визуализации и количественной<em&gt; Хламидиоз</em&gt; Вакуоли Динамика роста в живых клетках

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Быстрое выявление грамотрицательных бактерий из крови культуральной жидкости Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Очистка вирусной ДНК для идентификации связанных вирусных и клеточных белков

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Определение маркеров вирулентность микобактерий abscessus для внутриклеточного репликации в фагоцитов

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...