Name: identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta
Uploaded: 2017-08-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

För brist på utrymme, vi citerade mestadels översiktsartiklar och vi ber om ursäkt till våra kolleger vars ursprungliga arbetet inte nämndes. Arbetet i V.C. laboratoriet stöds genom bidrag från NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD och BSF till V.C. och S.G.L. laboratoriet stöds av NIH och medel från avdelningar i växtpatologi och växt-mikrob biologi till S.G.L.

1. växtmaterial
<ol><li>Val av växtarter</li>
	<li>Använd växtarterna som är infödda till proteinet av intresse, dvs, en som kodar detta protein för endogena proteiner eller som representerar de naturliga värdarna för patogen för virala proteiner. Dessutom måste den utvalda växtart vara mottagliga för den valda metoden för övergående genetisk transformation. Obs: Studierna rutinmässigt anställa Nicotiana benthamiana, som föreställer en god värd för TMV och omvandlas effektivt ...

Detta protokoll har fyra grundläggande beståndsdelar: begreppet att identifiera en sekvens som är både nödvändig och tillräcklig för inriktning till Pd, systematisk uppdelning av proteinet av intresse i fragment som successivt minskar i längd, fusing de testade fragmenten till ett autofluorescent protein som fungerar både som taggen och makromolekylär last och funktionella test för Pd inriktning i levande växt vävnader efter övergående uttryck för testade fusionsproteinerna. Observera att Agrobacterium-m...

Plasmodesmata (Pd) fungerar som transitländer för intercellulära transport av viktiga regulatorer av anläggningar utveckling och morfogenes, alltifrån transkriptionsfaktorer till mRNA och små RNA-molekyler. Dessutom utnyttjas detta makromolekylära transportkapaciteten hos Pd av de flesta växt virus för de intercellulära sprids under infektion; Om du vill flytta genom Pd, har plant virus utvecklats specialiserade proteiner, så kallade rörelse proteiner (MPs), som specifikt riktar sig till Pd1,2,3,4,5,6 , 7. molekylära vägar av Pd transporter troligtvis är intimt sammankopplade med de specifika sekvenser som riktar de transporterna proteinerna i dessa vägar. Identifiering av dessa Pd lokalisering signaler (PLSs) kan således vara diagnostiska av motsvarande Pd transport väg. Detta är analogt Pd transport8, till exempel att olika nukleära importera vägar, som kan vara specifika för olika cellkärnelokalisering signal (NLS) sekvenser9,10. Begreppsmässigt, representerar både NLSs och PLSs icke-cleavable subcellulär inriktning sekvenser som är nödvändig och tillräcklig för inriktning. Men till skillnad från NLSs11är sekvensinformation om PLSs starkt begränsad. Specifikt, har endast fyra proteinsekvenser som är inblandade i Pd inriktning rapporterats, alla av dem härrör från endogena vegetabiliska proteiner. Den första som representeras av en homeobox domän KN112 – en transkriptionsfaktor som flyttar från inre celllagrar till epidermis av växt blad13 – och dess KNOX homologs14. Den andra också är från en transkriptionsfaktor, Dof, som innehåller en förmodad PLS beskrivs som intercellulära människohandel (IT) motiv15. Den tredje sekvensen är från den PDLP1 plasmodesmata-resident typ 1 membranprotein, och är representerad med en transmembrana domän16. Slutligen, den fjärde Pd inriktning sekvens var nyligen rapporterat för glycosylphosphatidylinositol (GPI)-förankrade proteiner och det representeras av den glycosylphosphatidylinositol (GPI) modifiering signal17.
Tills helt nyligen, intressant, ingen PLSs rapporterats för viral MPs. Tidigare studier anges förekomsten av förmodad PLS sekvenser i växten viral MPs18,19, men ingen sann PLS, dvsen minimal aminosyrasekvens både nödvändig och tillräcklig för Pd inriktning av en icke-närstående Last molekyl ( t.ex., CFP) har upptäckts i en viral MP. Ännu var ett av dessa proteiner, MP av tobak mosaic virus (TMV), den första som Pd lokalisering och transport har varit påvisade20.
För att lösa denna lucka, utvecklade vi en experimentell strategi för att identifiera TMV MP PLS. Denna strategi baserades på tre begrepp. (i) vi definieras en minimal aminosyrasekvens som är både nödvändig och tillräcklig för proteinsekretion till Pd21PLS. (ii) eftersom TMV MP första mål Pd och sedan translocates genom dessa kanaler22, som vi syftar uncoupling dessa två aktiviteter och identifiera de bona fide PLS, som fungerar endast för Pd inriktning, och inte för efterföljande transport. (iii) Vi analyserade de identifierade PLS aminosyra restsubstanser viktigt för dess Pd inriktning aktivitet, oavsett om strukturellt eller funktionellt. Använder denna metod, avgränsad vi en 50-amino acid rester sekvens på amino-terminus av TMV MP som fungerar som bona fide PLS. Detta gjordes genom att producera en serie TMV MP fragment som mättade hela längden av proteinet, tagga deras karboxylgrupp-termini med GFP och övergående uttrycker dem i växt vävnader. PD lokalisering av var och en av de testa fragmenten bestämdes coexpressing dem med ett Pd markör protein, PDCB1 (Pd callose bindande protein 1)23. Den minsta fragment som fortfarande är lokaliserad till Pd, men inte färdas Pd, ansågs representera PLS. Slutligen var PLS alanin-skannade att fastställa de viktigaste aminosyra restsubstanser krävs för dess struktur eller funktion.
Medan här vi illustrera detta synsätt genom att beskriva identifiering av TMV MP PLS, kan det vara anställda att upptäcka PLSs i några andra Pd-riktade proteiner, oavsett om kodade av växten patogener eller växterna själva; Detta beror på att vår metod inte drar fördel av alla unika funktioner av viral MPs med avseende på deras förmåga att målet att Pd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1086">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td>
			<td style="width:176px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">LSM5</td>
			<td style="width:349px;">Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zen software for confocal microscope imaging</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2009 version</td>
			<td>The software should be compatible with the CLSM used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quickchange II site-directed mutagenesis kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes without needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectinomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

Plasmodesmata (Pd) är cell-till-cell anslutningar som fungerar som gateways genom vilka små och stora molekyler transporteras mellan växtcellerna. Pd transport av små molekyler, som joner och vatten, antas uppstå passivt, cell-till-cell transport av biologiska makromolekyler, sådana proteiner, troligen sker via en aktiv mekanism som innebär särskilda inriktning signaler på den transporterade molekylen. Bristen på identifierade plasmodesmata (Pd) lokalisering signaler (PLSs) har stränga förståelsen av protein-sortering inblandade i plant cell till cell makromolekylär transport och kommunikation. Från en mängd växt endogena och virala proteiner kända trafik genom Pd, endast tre PLSs har rapporterats hittills, alla av dem från endogena vegetabiliska proteiner. Det är därför viktigt att utveckla en tillförlitlig och systematisk experimentell strategi för att identifiera en funktionell PLS sekvens, som är både nödvändig och tillräcklig för Pd inriktning, direkt i levande växtceller. Här beskriver vi en sådan strategi använder som ett paradigm proteinet cell till cell rörelse (MP) av tobak mosaic virus (TMV). Dessa experiment, som identifieras och karakteriseras först växt viral PLS, kan anpassas för upptäckten av PLS sekvenser i mest Pd-riktade proteiner.

De representativa uppgifter, som troget illustrera förväntade från protokollen beskrivs resultat och identifiera den TMV MP PLS, är anpassade från Yuan et al. 21. figur 1A summerar första stora konstruktioner uttrycker fullängds TMV MP (1-268), TMV MP PLS (som omfattar de första 50 aminosyra resterna av proteinet, 1-50), och dess alanin skanning V4A derivat smält till GFP (genereras som beskrivs i steg 2.2, 5.2 och 6) medan <stron...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plantera intercellulära anslutningar, plasmodesmata (Pd), spelar centrala roller i växt fysiologi och växt-virus interaktioner. Kritisk till Pd transporter sorterar signaler att direkt proteiner till Pd. Vår kunskap om dessa sekvenser är dock fortfarande i sin linda. Vi beskriver en strategi för att identifiera Pd lokalisering signaler i Pd-riktade proteiner.

Identifiering av Plasmodesmal lokalisering sekvenser i proteiner i Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypisk Inferens av HIV-1 Tropism Använda Befolkning-sekvensering av V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualisering Dengue genom Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Odling Mikroglia från neonatal och vuxna centrala nervsystemet

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridiseringar (FISH) för lokalisering av virus och endosymbiotiska Bakterier i växt-och insekts vävnader

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Använda fluorescerande proteiner för att visualisera och kvantifiera<em&gt; Klamydia</em&gt; Vacuole tillväxtdynamiken i levande celler

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snabb identifiering av gramnegativa bakterier från Blood Culture Broth Använda MALDI-TOF masspektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Rening av virus-DNA för identifiering av associerade Viral och cellulära proteiner

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering av Salmonella typhimurium-innehållande Phagosomes från makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identifiering av virulens markörer för Mycobacterium abscessus för intracellulär replikering i fagocyter

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...