Name: identification of plant ice-binding proteins through assessment of ice-recrystallization inhibition and isolation using ice-affinity purification
Uploaded: 2017-05-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification at JoVE.com

Ce travail a été financé par une subvention du CRSNG à VKW (Canada).

1. Appareil d&#39;installation Splat <ol><li> Remplir un bain à circulation d&#39;eau à température programmable avec l&#39;éthylène glycol (50% v / v dans l&#39;eau). REMARQUE: l&#39;éthylène glycol automobile vert peut être utilisé. </li><li> Pour assembler la chambre externe, utiliser un tube en plastique isolant pour fixer le bain d&#39;eau dans un bol en verre à double paroi. Isoler le bol en verre avec de la mousse de polystyrène et couvrir d&#39;un couvercle de boîte de Pétri en plastique. D...

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	<li>Sidebottom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-stable+antifreeze+protein+from+grass.">Heat-stable antifreeze protein from grass.</a> Nature. 406 (6793), 256 (2000).</li><li>Duman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+and+ice+nucleator+proteins+in+terrestrial+arthropods.">Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods.</a> Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).</li><li>Davies, P. L., Hew, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+fish+antifreeze+proteins.">Biochemistry of fish antifreeze proteins.</a> FASEB J. 4 (8), 2460-2468 (1990).</li><li>Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+proteins:+structures+and+mechanisms+of+function.">Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function.</a> Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).</li><li>Smolin, N., Daggett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+ice-like+water+structure+on+the+surface+of+an+antifreeze+protein.">Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein.</a> J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).</li><li>Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine-rich+antifreeze+proteins+from+snow+fleas.">Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas.</a> Science. 310 (5747), 461 (2005).</li><li>Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+proteins+in+the+Antarctic+springtail,+Gressittacantha+terranova.">Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova.</a> J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).</li><li>Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+expand+the+repertoire+of+protein+structures+that+bind+ice.">Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).</li><li>Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+a+Bacterial+Antifreeze+Protein+as+an+Adhesin+with+Ice-Binding+Activity.">Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity.</a> PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).</li><li>Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+antifreeze+protein+in+a+fish.">Hyperactive antifreeze protein in a fish.</a> Nature. 429 (6988), 153 (2004).</li><li>Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification+and+antifreeze+activity+of+carrot+antifreeze+protein+and+its+mutants.">Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants.</a> Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).</li><li>Gupta, R., Dreswal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+stress+modulated+secretome+analysis+and+purification+of+antifreeze+protein+from+Hippophae+rhamnoides,+a+Himalayan+wonder+plant.">Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant.</a> Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).</li><li>Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+antifreeze+proteins+by+adsorption+to+ice.">Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice.</a> Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).</li><li>Middleton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+ice-binding+proteins+from+higher+plants.">Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants.</a> Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).</li><li>Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+proteins+confer+freezing+tolerance+in+transgenic+Arabidopsis+thaliana.">Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.</a> Plant Biotechnol. J. , (2016).</li><li>Olijve, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+rapid+ice+crystal+growth+through+nonbasal+plane+adsorption+of+antifreeze+proteins.">Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).</li><li>Zakharov, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice+Recrystallization+in+a+Solution+of+a+Cryoprotector+and+Its+inhibition+by+a+Protein:+Synchrotron+X-Ray+Diffraction+Study.">Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study.</a> J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).</li><li>Capicciotti, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+ice+recrystallization+inhibitors+enable+freezing+of+human+red+blood+cells+with+reduced+glycerol+concentrations.">Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations.</a> Sci. Rep. 5, 9692 (2015).</li><li>Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal+surface+planes.">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes.</a> Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).</li><li>Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiourea:+the+antioxidant+of+choice+for+the+purification+of+proteins+from+phenol+rich+plant+tissues.">Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues.</a> Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).</li><li>Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-shell+purification+of+ice-binding+proteins.">Ice-shell purification of ice-binding proteins.</a> Cryobiology. 72 (3), 258-263 (2016).</li><li>Basu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+ice-binding+planes+of+antifreeze+proteins+by+fluorescence-based+ice+plane+affinity.">Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity.</a> J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).</li><li>Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+evolution+of+a+cold+stress+associated+gene+family+in+cold+tolerant+grasses.">Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses.</a> BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).</li><li>Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+ice-binding+face+of+a+plant+antifreeze+protein.">Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).</li></ol>

Pour l&#39;analyse réussie et la purification de IBP, il est important de comprendre la nature sensible à la température de certaines de ces protéines. Certaines plantes IBP instable à des températures supérieures à 0 ° C, ce qui se déroule, les précipitations et l&#39;inactivité. Afin d&#39;obtenir IBP actifs, il est souvent indispensable que les plantes sont traitées dans une chambre froide (~ 4 ° C) et les échantillons sont maintenus sur de la glace pendant l&#39;expérimentation. Un autre facteur à c...

Des protéines de liaison glace (IBP) sont une famille diversifiée de protéines protectrices qui ont été découvertes dans un certain nombre d&#39;organismes , y compris les plantes, les insectes 1 2 3, les poissons et les microbes 4. La principale caractéristique de ces protéines est leur capacité unique à adsorber spécifiquement et efficacement aux cristaux de glace, modifiant leur croissance. IBP possède plusieurs propriétés documentées, avec les deux plus bien caractérisés étant hystérésis thermique (TH) et l&#39;inhibition de la recristallisation de la glace (IRI). l&#39;activité TH est plus facilement observée dans IBP chez les animaux de gel intolérants. Cette activité se traduit par abaissement du point de congélation des fluides circulatoires ou interstitiel organismes pour éviter le gel. En revanche, dans les organismes de gel tolérant, qui inévitablement geler à des températures inférieures à zéro, IBP semblent avoir une activité faible TH. En dépit de la faible activité TH, une forte activité IRI pour limiter le cri de la glacela croissance Stal est souvent observée avec ces protéines. Pour l&#39;organisme tolérant le gel, cette activité IRI permet vraisemblablement de protéger les cellules de la croissance incontrôlée de la glace dans les compartiments extracellulaires. Le modèle « bouton de matelas » peut être utilisé pour décrire le mécanisme par lequel IBP prévenir la croissance des cristaux de glace 5. Selon ce modèle, IBP adsorber spécifiquement à la surface des cristaux de glace à des intervalles, de telle sorte que les molécules d&#39;eau ne peuvent incorporer avec le réseau cristallin de la glace de plus en plus dans l&#39;espace entre IBP lié. Cela crée une courbure qui rend l&#39;incorporation de molécules d&#39;eau supplémentaires défavorables, un événement qui peut être décrit par l&#39;effet Gibbs-Thomson 6. L&#39;hypothèse ancrée de l&#39;eau de clathrate fournit un mécanisme pour la liaison spécifique de IBP à la surface des cristaux de glace de sorte que la présence de résidus chargés, en particulier placés sur le site de liaison de protéine de la glace, les résultats dans le reorganism des molécules d&#39;eau afin qu&#39;ils correspondent à un ou plusieurs plans du réseau cristallin de la glace 7. activité TH peut être quantifiée en mesurant la différence entre les températures de fusion et de congélation d&#39;un seul cristal de glace en présence d&#39;un IBP. Bien que l&#39;activité TH est une méthode d&#39;évaluation de l&#39;activité de IBP, le faible écart de TH largement acceptée produite par l&#39;usine IBP (typiquement seulement une fraction d&#39;un degré) exige normalement une concentration élevée en protéines, un équipement spécialisé et de l&#39;expérience de l&#39;opérateur. Bien que non-IBP peut limiter la croissance des cristaux de glace, il est une propriété partagée par tous IBP et tester ainsi l&#39;activité IRI est un écran initial efficace pour la présence de IBP, en particulier pour ceux qui ont une faible activité TH. La méthode utilisée pour tester cette activité est connu comme un « essai de floc », par lequel un échantillon de protéine est éclair congelée pour produire une monocouche de petits cristaux de glace, qui sont observées sur une période de temps pour déterminer sila croissance des cristaux de glace est limité. Contrairement à d&#39;autres méthodes utilisées pour cribler un échantillon de tissu source pour la présence d&#39;IBP, cette technique est applicable à de faibles concentrations de protéines dans l&#39;intervalle de 10 à 100 ng, utilise un équipement facilement fabriqué, et génère des données qui sont rapidement et facilement interprétée. Cependant, il est important de souligner que cette analyse fournit un écran initial pour IBP qui devrait être suivi par la détermination de la TH et mise en forme de cristaux de glace. L&#39;isolement des protéines natives est difficile, ce qui nécessite souvent des informations sur les propriétés structurales et biochimiques d&#39;une protéine d&#39;intérêt. L&#39;affinité des IBP pour la glace permet l&#39;isolement de ces protéines en utilisant de la glace en tant que substrat à des fins de purification. Etant donné que la majorité des molécules sont poussés en avant de la limite de l&#39;eau glacée pendant la croissance des cristaux de glace, la croissance lente d&#39;une hémisphère de la glace en présence d&#39;un échantillon des résultats d&#39;IBP dans un échantillon hautement purifié, exempt de grande quantits de protéines contaminantes et des solutés. Cette méthode a été utilisée pour identifier des insectes IBP 8, 9, 10, 11 les bactéries, les poissons et les plantes 12 13, 14. En outre, les fractions enrichies en IBP obtenus par ce procédé peuvent également être utilisés pour l&#39;analyse biochimique en aval. Le présent document décrit l&#39;identification de IBP dans les plantes par l&#39;induction et l&#39;extraction de IBP, l&#39;analyse de l&#39;activité IRI pour confirmer la présence de protéines, et l&#39;isolement des protéines en utilisant une purification par affinité de la glace.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1117">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 mL microcentrifugetubes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td style="width:631px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adjustable lab jack</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S63080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge</td>
			<td style="width:152px;">Desaga MC2</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brass probe</td>
			<td style="width:152px;">Custom built</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Camera/ camera port</td>
			<td style="width:152px;">Canon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cheesecloth</td>
			<td style="width:152px;">Purewipe/Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-665-25A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Concentration tubes (0.5 mL)</td>
			<td style="width:152px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC501008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Concentration tubes (15 mL)</td>
			<td style="width:152px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical tubes (50 mL)</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">AM12502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cooling block</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">13259</td>
			<td>Use a metal heating block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dehumidifier</td>
			<td style="width:152px;">Whirlpool</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dessciation beads</td>
			<td style="width:152px;">t.h.e. Dessicant/VWR</td>
			<td style="width:119px;">EM-DX0017-2</td>
			<td>6-8 mesh size; 100% indicating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:152px;">Olympus Tokyo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Double walled glass bowl</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Purchase from local lab glassware supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry ice</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Use local supplier; hazardous&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA-protease inhibitor tablets</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Roche cOmplete mini</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hexane</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">296090</td>
			<td>Anhydrous, 95%; hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Immersion oil</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">56822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">JA10/20 centrifuge</td>
			<td style="width:152px;">Beckman</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Large plastic petri dish</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Use local supplier; hazardous&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnetic stir plate</td>
			<td style="width:152px;">Hanna Instruments</td>
			<td style="width:119px;">HI190M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope cover slides</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic tube</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Purchase PVC pipe from local hardware store</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polarized film</td>
			<td style="width:152px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">43-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polystyrene foam</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Can be constructed from polystyrene shipping boxes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poreclain mortar and pestle</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVPP</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">77627</td>
			<td>110 &#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retort Stand</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small stir bar</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">14-513-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Temperature-programmable water bath</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">13271-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vacuum grease</td>
			<td style="width:152px;">Dow Corning/Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinyl tubing</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plant ice-binding proteins through assessment of ice-recrystallization inhibition and isolation using ice-affinity purification

protéines se liant à glace (IBP) appartiennent à une famille de protéines de stress induit qui sont synthétisés par certains organismes exposés à des températures inférieures à zéro. Chez les plantes, les dommages se produit lorsque le gel des cristaux de glace extracellulaire se développent, entraînant la rupture des membranes plasmiques et la mort cellulaire possible. Adsorption de IBP à des cristaux de glace limite la croissance par un procédé connu sous le nom d&#39;inhibition de la glace recristallisation (IRI), réduisant ainsi les dommages cellulaires. IBP démontrent également la capacité d&#39;abaisser le point de congélation d&#39;une solution en dessous du point de fusion d&#39;équilibre, une propriété connue sous le nom de l&#39;activité hystérésis thermique (TH). Ces propriétés protectrices ont suscité un intérêt dans l&#39;identification de nouveaux IBP en raison de leur utilisation potentielle dans des applications industrielles, médicales et agricoles. Ce document décrit l&#39;identification de la plante IBP par 1) l&#39;induction et l&#39;extraction de IBP dans le tissu végétal, 2) le criblage d&#39;extraits pour l&#39;activité IRI, et 3) l&#39;isolement et la purification de IBP. Suite à l&#39;induction de l&#39;IBP par exposition à basse température, les extraits sont testés pour l&#39;activité IRI en utilisant un « test de splat », qui permet l&#39;observation de la croissance des cristaux de glace à l&#39;aide d&#39;un microscope optique standard. Ce test nécessite une faible concentration en protéine et génère des résultats qui sont obtenus rapidement et facilement interprétables, en fournissant un écran initial de l&#39;activité de liaison de la glace. IBP peut ensuite être isolé à partir de protéines contaminantes en utilisant la propriété de IBP pour adsorber à la glace, par une technique appelée «purification par affinité de la glace. L&#39;utilisation lysats de cellules recueillies à partir d&#39;extraits de plantes, un hémisphère de glace peut être cultivé lentement sur une sonde en laiton. Celui-ci incorpore IBP dans la structure cristalline de la glace polycristallin. Ne nécessitant aucune connaissance biochimique ou structurelle a priori de l&#39;IBP, ce procédé permet la récupération de la protéine active. fractions protéiques de glace purifiés peuvent être utilisés pour des applications en aval, y compris l&#39;identification des pepséquences de marées par spectrométrie de masse et l&#39;analyse biochimique des protéines natives.

Pour faciliter l&#39;installation, la figure 1 et Figure 2 sont inclus comme des représentations visuelles de l&#39;équipement utilisé pour l&#39; analyse et la purification IRI glace-affinité, respectivement. Résultats de l&#39; analyse IRI en utilisant des extraits recueillis à partir des mauvaises herbes de moutarde avec et sans IBP sont représentés sur la figure 3. Ces...

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Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Le présent document décrit l&#39;identification des protéines de liaison à la glace à partir de plantes tolérantes au gel grâce à l&#39;évaluation de l&#39;activité d&#39;inhibition de la recristallisation de la glace et l&#39;isolement subséquent de IBP natives en utilisant une purification par affinité de la glace.

Identification des protéines végétales se liant à glace par l&#39;évaluation de l&#39;inhibition de recristallisation de glace et isolement utilisant purification Ice-affinité

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

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Isolement et mesures respiratoire des mitochondries d’Arabidopsis thaliana

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Biochimie

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 en 1 : en une seule étape de Purification d’affinité pour l’analyse parallèle de protéine-protéine et protéine-métabolite Complexes

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Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

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Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

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Isolement des glomérules et In Vivo , marquage des protéines de Surface de cellules glomérulaire

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

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Capture et Identification des protéines de liaison à l’ARN à l’aide de Click chimie assistée par ARN-interactome Capture stratégie (CARIC)

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Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expression, Purification, Cristallisation et Essais enzymatiques des protéines contenant du domaine de l'hydrolase fumarylacetoacetate

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A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Une approche personnalisable pour la production et la purification enzymatiques des produits naturels Diterpenoid

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...