Name: identification of plant ice-binding proteins through assessment of ice-recrystallization inhibition and isolation using ice-affinity purification
Uploaded: 2017-05-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von einem NSERC (Kanada) Zuschuss VKW finanziert.

1. Splat Vorrichtungsaufbau <ol><li> Füllen ein temperaturprogrammierbaren zirkulierendes Wasserbad mit Ethylenglykol (50% v / v in Wasser). HINWEIS: Grün Automobilethylenglykol verwendet werden. </li><li> Um die Außenkammer zubauen, verwenden isolierten Kunststoffschlauch in das Wasserbad zu einem doppelwandigen Glasschale zu befestigen. Isolieren der Glasschale mit Polystyrolschaum und die Abdeckung mit einer Kunststoff-Petrischale mit Deckel. Geschnitten, um ein 3-4 Zoll-Loch in der Unterseite der Polysty...

<ol>
	<li>Sidebottom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-stable+antifreeze+protein+from+grass.">Heat-stable antifreeze protein from grass.</a> Nature. 406 (6793), 256 (2000).</li><li>Duman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+and+ice+nucleator+proteins+in+terrestrial+arthropods.">Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods.</a> Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).</li><li>Davies, P. L., Hew, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+fish+antifreeze+proteins.">Biochemistry of fish antifreeze proteins.</a> FASEB J. 4 (8), 2460-2468 (1990).</li><li>Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine-rich+antifreeze+proteins+from+snow+fleas.">Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas.</a> Science. 310 (5747), 461 (2005).</li><li>Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+proteins+in+the+Antarctic+springtail,+Gressittacantha+terranova.">Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova.</a> J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).</li><li>Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+expand+the+repertoire+of+protein+structures+that+bind+ice.">Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).</li><li>Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+a+Bacterial+Antifreeze+Protein+as+an+Adhesin+with+Ice-Binding+Activity.">Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity.</a> PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).</li><li>Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+antifreeze+protein+in+a+fish.">Hyperactive antifreeze protein in a fish.</a> Nature. 429 (6988), 153 (2004).</li><li>Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification+and+antifreeze+activity+of+carrot+antifreeze+protein+and+its+mutants.">Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants.</a> Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).</li><li>Gupta, R., Dreswal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+stress+modulated+secretome+analysis+and+purification+of+antifreeze+protein+from+Hippophae+rhamnoides,+a+Himalayan+wonder+plant.">Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant.</a> Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).</li><li>Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+antifreeze+proteins+by+adsorption+to+ice.">Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice.</a> Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).</li><li>Middleton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+ice-binding+proteins+from+higher+plants.">Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants.</a> Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).</li><li>Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+proteins+confer+freezing+tolerance+in+transgenic+Arabidopsis+thaliana.">Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.</a> Plant Biotechnol. J. , (2016).</li><li>Olijve, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+rapid+ice+crystal+growth+through+nonbasal+plane+adsorption+of+antifreeze+proteins.">Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).</li><li>Zakharov, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice+Recrystallization+in+a+Solution+of+a+Cryoprotector+and+Its+inhibition+by+a+Protein:+Synchrotron+X-Ray+Diffraction+Study.">Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study.</a> J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).</li><li>Capicciotti, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+ice+recrystallization+inhibitors+enable+freezing+of+human+red+blood+cells+with+reduced+glycerol+concentrations.">Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations.</a> Sci. Rep. 5, 9692 (2015).</li><li>Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal+surface+planes.">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes.</a> Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).</li><li>Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiourea:+the+antioxidant+of+choice+for+the+purification+of+proteins+from+phenol+rich+plant+tissues.">Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues.</a> Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).</li><li>Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-shell+purification+of+ice-binding+proteins.">Ice-shell purification of ice-binding proteins.</a> Cryobiology. 72 (3), 258-263 (2016).</li><li>Basu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+ice-binding+planes+of+antifreeze+proteins+by+fluorescence-based+ice+plane+affinity.">Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity.</a> J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).</li><li>Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+evolution+of+a+cold+stress+associated+gene+family+in+cold+tolerant+grasses.">Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses.</a> BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).</li><li>Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+ice-binding+face+of+a+plant+antifreeze+protein.">Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).</li></ol>

Für die erfolgreiche Analyse und Reinigung von IBPs, ist es wichtig, die temperaturempfindlichen Natur einige dieser Proteine ​​zu verstehen. Bestimmte Pflanzen IBPs instabil bei Temperaturen über 0 ° C, was zu einer Entfaltung, Niederschlags- und Inaktivität. Um aktive IBPs zu erhalten, ist es oft wichtig, dass Pflanzen in einem kalten Raum verarbeitet werden (~ 4 ° C) und die Proben werden auf Eis gehalten, während der Experimente. Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor bei der Rohlysate Ganzzell verwend...

Eis-bindenden Proteine (IBPs) sind eine mannigfaltige Familie von Schutzproteinen , die in einer Reihe von Organismen , einschließlich Pflanzen , 1, 2 Insekten, Fischen 3 und 4 Mikroben entdeckt wurden. Das Hauptmerkmal dieser Proteine ​​ist ihre einzigartige Fähigkeit, gezielt und effizient zu Eiskristallen, zu modifizieren ihr Wachstum zu adsorbieren. IBPs haben mehrere dokumentierten Eigenschaften, mit den beiden am besten charakterisierten sind thermische Hysterese (TH) und Eis-Rekristallisation Hemmung (IRI). TH-Aktivität wird leichter in IBPs beobachtet in gefrier intolerant Tieren. Diese Aktivität führt zu einer Absenkung des Gefrierpunktes von Organismen Kreislauf- oder interstitiellen Flüssigkeiten Einfrieren zu verhindern. Im Gegensatz dazu in gefriertoleranten Organismen, die bei Temperaturen unter Null zwangsläufig einfriert, erscheint IBPs niedrig TH-Aktivität zu haben. Trotz der geringen TH-Aktivität, eine hohe Aktivität IRI Eis Schrei zu beschränkenStal Wachstum wird oft mit diesen Proteinen beobachtet. Für die Gefrieren tolerant Organismus, dies vermutlich IRI Aktivität hilft Zellen aus dem unkontrollierten Wachstum von Eis in extrazellulären Kompartimenten zu schützen. Das „Matratze Schaltfläche“ Modell kann verwendet werden , um den Mechanismus zu beschreiben , durch die IBPs das Wachstum von Eiskristallen zu verhindern 5. Nach diesem Modell adsorbieren IBPs spezifisch an die Oberfläche von Eiskristallen in Intervallen, so dass Wassermoleküle nur mit den wachsenden Eiskristallen Gittern in dem Raum zwischen gebundener IBPs integrieren. Dadurch entsteht eine Krümmung auf, die der Einbau von zusätzlichen Wassermolekülen ungünstig, ein Ereignis macht, die von dem Gibbs-Thomson - Effekt 6 beschrieben werden kann. Die verankerte Clathrat Wasser Hypothese stellt einen Mechanismus für die spezifische Bindung von IBPs zur Eiskristall Oberfläche, wobei die Anwesenheit von geladenen Resten, insbesondere auf der Protein-Bindungsstelle Eis positioniert ist, ergibt die REOrganisation von Wassermolekülen , so passen sie einer oder mehreren Ebenen des Eises Kristallgitter 7. TH-Aktivität kann durch Messen der Differenz zwischen dem Schmelz- und Gefriertemperaturen eines einzelnen Eiskristall in Gegenwart eines IBP quantifiziert werden. Während TH-Aktivität ein weithin akzeptiertes Verfahren zum Bewerten der Aktivität von IBPs, der niedrigen TH Spalte durch Pflanzen IBPs hergestellt (in der Regel nur einen Bruchteil eines Grades), die normalerweise erfordert eine hohe Proteinkonzentration, spezialisierte Ausrüstung und Erfahrung des Bedieners. Obwohl nicht-IBPs Eiskristallwachstum beschränken kann, ist es eine Eigenschaft von allen IBPs geteilt und damit für IRI Aktivitätstest wird ein effektiver Anfangsbildschirm für die Anwesenheit von IBPs, insbesondere für diejenigen mit geringer TH-Aktivität. Das verwendete Verfahren, diese Aktivität zu testen, wird als ‚Splat-Tests‘ bekannt, wobei eine Proteinprobe schockgefroren wird eine Monoschicht von kleinen Eiskristallen zu erzeugen, die sie über einen Zeitraum beobachtet werden, um zu bestimmen, obEiskristallwachstums eingeschränkt. Im Gegensatz zu anderen Methoden verwendet, um eine Quelle Gewebeprobe auf das Vorhandensein von IBPs zu screenen, diese Technik zu geringen Proteinkonzentrationen im Bereich von 10-100 ng anwendbar ist, nutzt leicht fabrizierten Ausrüstung, und erzeugt Daten, die schnell und einfach interpretiert wird. Jedoch ist es wichtig zu betonen, dass dieser Test eine Anfangsbildschirm für IBPs bereitstellt, die durch die Bestimmung von TH und Eiskristall Formgebung gefolgt werden soll. Die Isolierung von nativen Proteinen ist eine Herausforderung und erfordert häufig Informationen über die strukturellen und biochemischen Eigenschaften eines Proteins von Interesse. Die Affinität von IBPs für Eis ermöglicht die Isolierung dieser Proteine ​​Eis als Substrat für Reinigungszwecke verwendet wird. Da die Mehrzahl der Moleküle vor der Eis-Wasser-Grenze während des Wachstums von Eiskristallen, langsamem Wachstum einer Eis-Hemisphäre in Gegenwart einer IBP Probe ergibt eine hochgereinigte Probe geschoben, ohne großen quantities von Proteinen und gelöste Stoffe zu kontaminieren. Diese Methode wurde verwendet IBPs von Insekten 8 zu identifizieren, 9, 10, 11 Bakterien, Fisch und Pflanzen 12 13, 14. Zusätzlich können die IBP-angereicherten Fraktionen durch diese Methode erreicht auch für nachgelagerte biochemische Analyse verwendet werden. Dieses Papier beschreibt die Identifizierung von IBPs in Pflanzen durch die Induktion und Extraktion von IBPs, die Analyse von IRI Aktivität die Anwesenheit von Proteinen und die Isolierung von Proteinen unter Verwendung von Eis Affinitätsreinigung zu bestätigen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1117">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 mL microcentrifugetubes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td style="width:631px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adjustable lab jack</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S63080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge</td>
			<td style="width:152px;">Desaga MC2</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brass probe</td>
			<td style="width:152px;">Custom built</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Camera/ camera port</td>
			<td style="width:152px;">Canon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cheesecloth</td>
			<td style="width:152px;">Purewipe/Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-665-25A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Concentration tubes (0.5 mL)</td>
			<td style="width:152px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC501008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Concentration tubes (15 mL)</td>
			<td style="width:152px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical tubes (50 mL)</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">AM12502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cooling block</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">13259</td>
			<td>Use a metal heating block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dehumidifier</td>
			<td style="width:152px;">Whirlpool</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dessciation beads</td>
			<td style="width:152px;">t.h.e. Dessicant/VWR</td>
			<td style="width:119px;">EM-DX0017-2</td>
			<td>6-8 mesh size; 100% indicating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:152px;">Olympus Tokyo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Double walled glass bowl</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Purchase from local lab glassware supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry ice</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Use local supplier; hazardous&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA-protease inhibitor tablets</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Roche cOmplete mini</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hexane</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">296090</td>
			<td>Anhydrous, 95%; hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Immersion oil</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">56822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">JA10/20 centrifuge</td>
			<td style="width:152px;">Beckman</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Large plastic petri dish</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Use local supplier; hazardous&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnetic stir plate</td>
			<td style="width:152px;">Hanna Instruments</td>
			<td style="width:119px;">HI190M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope cover slides</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic tube</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Purchase PVC pipe from local hardware store</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polarized film</td>
			<td style="width:152px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">43-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polystyrene foam</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Can be constructed from polystyrene shipping boxes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poreclain mortar and pestle</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVPP</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">77627</td>
			<td>110 &#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retort Stand</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small stir bar</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">14-513-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Temperature-programmable water bath</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">13271-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vacuum grease</td>
			<td style="width:152px;">Dow Corning/Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinyl tubing</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
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identification of plant ice-binding proteins through assessment of ice-recrystallization inhibition and isolation using ice-affinity purification

Eis-bindende Proteine ​​(IBPs) gehören zu einer Familie von Stress-induzierten Proteine, die durch bestimmte Organismen Temperaturen unter Null ausgesetzt synthetisiert werden. In Pflanzen treten Frostschäden, wenn extrazelluläre Eiskristalle wachsen, was zu dem Bruch von Plasmamembranen und möglichem Zelltod. Adsorption von IBPs Eiskristalle beschränkt weiteres Wachstum durch ein Verfahren, wie Eis-Rekristallisation Hemmung (IRI) bekannt ist, um dadurch eine Zellschädigung zu verringern. IBPs zeigt auch die Fähigkeit, den Gefrierpunkt eine Lösung unter dem Gleichgewichtsschmelzpunkt, eine Eigenschaft bekannt als thermische Hysterese (TH) -Aktivität zu drücken. Diese Schutzeigenschaften haben Interesse an der Identifizierung neuer IBPs erhöhten aufgrund ihrer möglichen Verwendung in industriellen, medizinischen und landwirtschaftlichen Anwendungen. Dieses Papier beschreibt die Identifizierung von Pflanzen IBPs durch 1) die Induktion und Extraktion von IBPs in Pflanzengeweben, 2), um das Screening von Extrakten für IRI-Aktivität, und 3) die Isolierung und purification von IBPs. Im Anschluss an die Induktion der IBPs durch geringe Temperaturbelastung, sind Extrakte für IRI Aktivität getestet einen ‚Splat-Tests‘ verwendet, die die Beobachtung von Eiskristallwachstum erlaubt eine Standard-Lichtmikroskop. Dieser Test erfordert eine niedrige Proteinkonzentration und erzeugt Ergebnisse, die erhalten schnell und einfach interpretiert werden, Eis-Bindungsaktivität ein Einstiegsbild bereitzustellen. IBPs Proteine ​​kann dann isoliert werden, verunreinigt durch die Eigenschaft IBPs Verwendung auf Eis, durch eine Technik, ‚ice-Affinitätsreinigung‘ zu adsorbieren genannt. Mit Zelllysaten aus Pflanzenextrakten gesammelt, kann ein Eis Hemisphäre langsam auf einer Messingsonde angebaut werden. Dies beinhaltet IBPs in die kristalline Struktur des polykristallinen Eis. Erfordern a priori keine biochemische oder strukturelle Kenntnis des IBP ermöglicht dieses Verfahren zur Gewinnung von aktivem Protein. Eis-gereinigter Proteinfraktionen können für Downstream-Anwendungen, einschließlich der Identifizierung von pep verwendet werden,tide Sequenzen durch Massenspektrometrie und die biochemische Analyse der nativen Proteine.

Für eine einfache Set-up, Abbildung 1 und Abbildung 2 als visuelle Darstellungen der Ausrüstung für die Analyse IRI und Eis-Affinitätsreinigung bzw. verwendet eingeschlossen. Die Ergebnisse der IRI Analyse Auszüge aus Senf Unkraut mit und ohne IBPs gesammelt verwenden , sind in Abbildung 3 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Extrakte aus Senf Unkraut gesammelt, die nic...

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Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Dieses Papier beschreibt die Identifizierung von Eis-bindenden Proteinen aus gefriertoleranten Pflanzen durch die Beurteilung von Eis-Umkristallisation hemmende Aktivität und die anschließende Isolierung von nativem IBPs ice-Affinitätsreinigung verwendet wird.

Identifizierung von Pflanzenproteinen durch die Bewertung der Eis-Rekristallisation Hemmung und Isolation Mit Ice-Affinitätsreinigung Ice-Bindung

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Forschung

Biochemie

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitätsreinigung der Chloroplasten Translocon Proteinkomplexe mit dem TAP-Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolierung der Glomeruli und In Vivo Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Festlegung der funktionellen Protein Regionen durch chimäres Protein Aufbau

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Blick nach außen: Isolierung von cyanobakteriellen freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expression, Reinigung, Kristallisation und Enzym-Assays von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Ein anpassbarer Ansatz für die enzymatische Produktion und Reinigung von Diterpenoid Naturprodukten

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...