Name: identification of plant ice-binding proteins through assessment of ice-recrystallization inhibition and isolation using ice-affinity purification
Uploaded: 2017-05-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification at JoVE.com

Bu çalışma VKW bir NSERC (Kanada) hibe ile finanse edildi.

1. Splat tertibat Ayar <ol><li> etilen glikol (% 50 v / su içinde hacim) olan bir sıcaklığa programlanabilir dolaşan su banyosu doldurun. Not: Yeşil otomotiv etilen glikol kullanılabilir. </li><li> Harici odasını monte etmek için, bir çift duvarlı cam kaseye su banyosu takmak için yalıtılmış plastik boru kullanılmalıdır. polistiren köpük cam kase izole ve bir plastik petri kabı bir kapak ile kaplayın. Işık kaynağı, cam odasının içinden görülebilir ve böylece polistiren bölmeni...

<ol>
	<li>Sidebottom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-stable+antifreeze+protein+from+grass.">Heat-stable antifreeze protein from grass.</a> Nature. 406 (6793), 256 (2000).</li><li>Duman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+and+ice+nucleator+proteins+in+terrestrial+arthropods.">Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods.</a> Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).</li><li>Davies, P. L., Hew, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+fish+antifreeze+proteins.">Biochemistry of fish antifreeze proteins.</a> FASEB J. 4 (8), 2460-2468 (1990).</li><li>Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+antifreeze+protein+activity+in+Antarctic+lake+bacteria.">Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria.</a> Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).</li><li>Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal+surface+planes.">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes.</a> Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).</li><li>Yeh, Y., Feeney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+proteins:+structures+and+mechanisms+of+function.">Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function.</a> Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).</li><li>Smolin, N., Daggett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+ice-like+water+structure+on+the+surface+of+an+antifreeze+protein.">Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein.</a> J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).</li><li>Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine-rich+antifreeze+proteins+from+snow+fleas.">Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas.</a> Science. 310 (5747), 461 (2005).</li><li>Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+proteins+in+the+Antarctic+springtail,+Gressittacantha+terranova.">Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova.</a> J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).</li><li>Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+expand+the+repertoire+of+protein+structures+that+bind+ice.">Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).</li><li>Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+a+Bacterial+Antifreeze+Protein+as+an+Adhesin+with+Ice-Binding+Activity.">Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity.</a> PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).</li><li>Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+antifreeze+protein+in+a+fish.">Hyperactive antifreeze protein in a fish.</a> Nature. 429 (6988), 153 (2004).</li><li>Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification+and+antifreeze+activity+of+carrot+antifreeze+protein+and+its+mutants.">Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants.</a> Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).</li><li>Gupta, R., Dreswal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+stress+modulated+secretome+analysis+and+purification+of+antifreeze+protein+from+Hippophae+rhamnoides,+a+Himalayan+wonder+plant.">Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant.</a> Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).</li><li>Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+antifreeze+proteins+by+adsorption+to+ice.">Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice.</a> Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).</li><li>Middleton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+ice-binding+proteins+from+higher+plants.">Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants.</a> Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).</li><li>Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+proteins+confer+freezing+tolerance+in+transgenic+Arabidopsis+thaliana.">Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.</a> Plant Biotechnol. J. , (2016).</li><li>Olijve, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+rapid+ice+crystal+growth+through+nonbasal+plane+adsorption+of+antifreeze+proteins.">Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).</li><li>Zakharov, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice+Recrystallization+in+a+Solution+of+a+Cryoprotector+and+Its+inhibition+by+a+Protein:+Synchrotron+X-Ray+Diffraction+Study.">Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study.</a> J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).</li><li>Capicciotti, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+ice+recrystallization+inhibitors+enable+freezing+of+human+red+blood+cells+with+reduced+glycerol+concentrations.">Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations.</a> Sci. Rep. 5, 9692 (2015).</li><li>Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal+surface+planes.">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes.</a> Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).</li><li>Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiourea:+the+antioxidant+of+choice+for+the+purification+of+proteins+from+phenol+rich+plant+tissues.">Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues.</a> Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).</li><li>Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-shell+purification+of+ice-binding+proteins.">Ice-shell purification of ice-binding proteins.</a> Cryobiology. 72 (3), 258-263 (2016).</li><li>Basu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+ice-binding+planes+of+antifreeze+proteins+by+fluorescence-based+ice+plane+affinity.">Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity.</a> J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).</li><li>Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+evolution+of+a+cold+stress+associated+gene+family+in+cold+tolerant+grasses.">Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses.</a> BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).</li><li>Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+ice-binding+face+of+a+plant+antifreeze+protein.">Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).</li></ol>

Öğren başarıyla analiz ve saflaştırma için, proteinlerin bazı sıcaklığa duyarlı doğasını anlamak önemlidir. Bazı bitki öğren açılması, çökeltme ve işlem içinde elde edilen, 0 ° C&#39;nin üzerindeki sıcaklıklarda stabil hale gelir. Aktif öğren elde etmek için, bitkiler, soğuk bir odada (~ 4 ° C) içinde işlenir ve numuneler, deney sırasında buz üzerinde tutulur, çok daha önemlidir. Bütün hücreli ham lizatları kullanılarak endojen proteazlar tarafından proteinlerinin parçala...

Buz-bağlayan proteinler (öğren) bitkilerde 1, böcekler 2, balık 3 ve mikroplar 4 de dahil olmak üzere bir organizma sayısı tespit edilmiştir koruyucu proteinlerin farklı bir familyasıdır. Bu proteinlerin önemli bir özelliği, özellikle ve verimli bir şekilde büyümesini düzenleme, buz kristallerine adsorbe için kendi benzersiz yeteneğidir. Öğren birkaç belgelenmiş özelliklere sahip iki en iyi karakterize edilmiş olan termal histerezis (TH) ve buzlu rekristalizasyon inhibisyon (IRI) ile yıkanmıştır. TH aktivitesi daha kolay dondurularak tolere hayvanlarda üretilen öğren gözlenir. donmayı önlemek için organizmaların dolaşım veya geçiş sıvıların donma noktası düşürmede Bu etki gösterir. Buna karşılık, kaçınılmaz olarak sıfırın altındaki sıcaklıklarda donacak dondurularak toleranslı organizmalar, içinde, öğren düşük TH aktivitesine sahip görünmektedir. Düşük TH aktivite rağmen yüksek bir IRI aktivite buz ağlama kısıtlamak içinStal büyüme genellikle bu proteinlerle görülmektedir. Dondurularak toleranslı organizma için bu IRI aktivitesi muhtemelen dışı bölümlerde buz kontrolsüz büyümesi hücreleri korumaya yardımcı olur. &quot;Yatak düğmesi&quot; modeli öğren buz kristallerinin 5 büyümesini önlemek mekanizmayı tarif etmek için kullanılabilir. Bu modelde, öğren özellikle su molekülleri bağlı öğren arasındaki boşlukta gelişen buz kristal kafesi ile birleştirmek için bu şekilde aralıklarla buz kristali yüzeyine adsorbe eder. Bu ilave su moleküllerinin eklenmesi elverişsiz kılan bir eğrilik Gibbs-Thompson etkisiyle 6 ile tarif edilebilir bir olay oluşturur. Bağlantılı klatrat suları hipotez buz kristali yüzeyine öğren spesifik bağlanmasını için bir mekanizma sağlar; reo spesifik olarak, protein buz bağlanma alanı üzerine yerleştirilmiş yüklü kalıntıların varlığı, sonuçSu moleküllerinin rganization böylece buz kristal kafes 7&#39;nin bir ya da daha fazla uçak eşleşir. TH aktivite erime arasındaki fark ölçülerek ve bir IBP mevcudiyetinde bir tek buz kristali donma sıcaklığının ile kantifiye edilebilir. TH aktivitesi öğren (a derece, tipik olarak sadece bir kısmı), bitki öğren tarafından üretilen düşük GAP etkinliğini değerlendirmek için yaygın olarak kabul edilen yöntem olsa da, normal olarak yüksek bir protein konsantrasyonu, özel ekipman ve operatör deneyimi gerektirir. olmayan öğren buz kristali büyümesinin sınırlamak olsa da, tüm öğren ve böylece IRI aktivitesi için test edilmesi ile paylaşılan bir özellik, özellikle düşük TH aktivitesine sahip olanlar için, öğren mevcudiyeti için etkili bir başlangıç ​​ekran. Bu aktiviteyi test etmek için kullanılan yöntem, bir protein numunesi flaş olmadığını belirlemek için belirli bir süre boyunca gözlenir küçük buz kristallerinin, bir tek tabaka üretmek için dondurulur ve böylece, bir &#39;splat tahlili&#39; olarak bilinirbuz kristali büyümesi ile sınırlıdır. Öğren varlığı için bir kaynak doku örneği taramak için kullanılan diğer yöntemlerin aksine, bu yöntem 10-100 ng aralığında düşük protein konsantrasyonları için geçerlidir, kolayca imal teçhizatı kullanmaktadır ve hızlı ve kolay bir yorumlanır verileri üretir. Bununla birlikte, deneyin, TH belirlenmesi ve buz kristali şekillendirme ile takip edilmelidir öğren için bir başlangıç ​​ekranını sağladığını vurgulamak önemlidir. doğal proteinlerin izolasyonu genellikle ilgi konusu bir proteinin yapısal ve biyokimyasal özellikleri ile ilgili bilgi gerektiren zor bir iştir. buz öğren afınite saflaştırma amaçları için bir alt-tabaka olarak buz kullanılarak bu proteinlerin izolasyonu sağlar. moleküllerin büyük çoğunluğu, buz kristali büyümesi, yüksek saflaştırılmış örnekteki bir IBP örnek sonuçlarının mevcudiyetinde bir buz yarıkürenin düşük büyüme, büyük quantit yoksun esnasında öncesinde buz-su sınır itilir yanaproteinler ve çözünmüş kontamine ler. Bu yöntem, böcek 8, 9, 10, bakteriler 11, balık 12 ve bitkiler 13, 14 öğren tanımlamak için kullanılmıştır. Buna ek olarak, bu yöntem sayesinde elde edilen IBP zenginleştirilmiş kısımlar, aynı zamanda aşağı biyokimyasal analiz için kullanılabilir. Bu kağıt öğren indüksiyonu ve ekstraksiyon yoluyla bitkilerde öğren tanımlanmasını açıklar, IRI faaliyeti analizi proteinlerin, ve buz afinite saflaştırması kullanılarak proteinlerin izolasyonunu doğrulamak için.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1117">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 mL microcentrifugetubes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td style="width:631px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adjustable lab jack</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S63080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge</td>
			<td style="width:152px;">Desaga MC2</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brass probe</td>
			<td style="width:152px;">Custom built</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Camera/ camera port</td>
			<td style="width:152px;">Canon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cheesecloth</td>
			<td style="width:152px;">Purewipe/Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-665-25A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Concentration tubes (0.5 mL)</td>
			<td style="width:152px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC501008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Concentration tubes (15 mL)</td>
			<td style="width:152px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC900308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical tubes (50 mL)</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">AM12502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cooling block</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">13259</td>
			<td>Use a metal heating block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dehumidifier</td>
			<td style="width:152px;">Whirlpool</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dessciation beads</td>
			<td style="width:152px;">t.h.e. Dessicant/VWR</td>
			<td style="width:119px;">EM-DX0017-2</td>
			<td>6-8 mesh size; 100% indicating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:152px;">Olympus Tokyo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Double walled glass bowl</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Purchase from local lab glassware supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry ice</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Use local supplier; hazardous&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA-protease inhibitor tablets</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Roche cOmplete mini</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hexane</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">296090</td>
			<td>Anhydrous, 95%; hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Immersion oil</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">56822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">JA10/20 centrifuge</td>
			<td style="width:152px;">Beckman</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Large plastic petri dish</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Use local supplier; hazardous&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnetic stir plate</td>
			<td style="width:152px;">Hanna Instruments</td>
			<td style="width:119px;">HI190M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope cover slides</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic tube</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Purchase PVC pipe from local hardware store</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polarized film</td>
			<td style="width:152px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">43-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polystyrene foam</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Can be constructed from polystyrene shipping boxes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poreclain mortar and pestle</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVPP</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">77627</td>
			<td>110 &#181;m particle size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retort Stand</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small stir bar</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">14-513-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Temperature-programmable water bath</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">13271-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vacuum grease</td>
			<td style="width:152px;">Dow Corning/Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinyl tubing</td>
			<td style="width:152px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plant ice-binding proteins through assessment of ice-recrystallization inhibition and isolation using ice-affinity purification

Buz-bağlayan proteinler (öğren) sıfırın altındaki sıcaklıklara maruz belirli organizmalar tarafından sentezlenir stres kaynaklı bir protein ailesine aittir. Hücre dışı buz kristalleri büyüdükçe bitkilere, dondurarak hasar plazma membranları ve olası hücre ölümünün yırtılması sonuçlanır. Buz kristallerine öğren adsorpsiyonu, böylece, hücresel hasarı düşürerek, buz yeniden kristalleşme engelleme (IRI) olarak bilinen bir süreç ile daha fazla büyümesini kısıtlar. Öğren, denge erime noktasının altında bir çözeltisine, termal histerezis (T-H) aktivitesi olarak bilinen bir özelliği, donma noktasını düşürmek için yeteneğini göstermektedir. Bu koruyucu özellikler nedeniyle, endüstriyel, tıbbi ve tarımsal uygulamalarda potansiyel kullanımlarına yeni öğren belirlenmesinde çekmektedirler. Bu çalışma, 1 ile bitki öğren belirlenmesini) indüksiyonu ve çıkarma öğren bitki dokusunda, 2) IRI aktivitesi için özleri tarama, ve 3) izolasyon ve Purif tarifÖğren ait ication. Düşük sıcaklık maruz öğren sağlanmasının ardından, özü ve standart bir ışık mikroskobu kullanılarak, buz kristali büyümesinin gözlem sağlayan bir &#39;splat tahlili&#39; kullanılarak IRI aktivitesi için test edilir. Bu deney, düşük protein konsantrasyonu gerektirir ve hızlı bir şekilde elde edilebilir ve kolayca buz bağlayıcı aktivitesi için bir başlangıç ​​ekranını sağlayan yorumlanır sonuçlar üretir. Öğren sonra &#39;buz-afinite saflaştırma&#39; adı verilen bir teknikle, buz adsorbe etmek öğren özelliğini kullanarak kirletici proteinler izole edilebilir. Bitki özlerinden derlenen hücre lizatları kullanılarak, bir buz yarımküre yavaş yavaş bir pirinç sonda üzerinde yetiştirilebilir. Bu polikristal buz kristal yapısına öğren içermektedir. Bir IBP önsel biyokimyasal ya da yapısal bilgiye gerektiren bu yöntem, aktif proteinin geri kazanımını sağlar. Buz ile saflaştırılmış protein fraksiyonları moral tanımlanması da dahil olmak üzere alt uygulamalar için kullanılabilirkütle spektrometrisi ve doğal proteinlerin biyokimyasal analizi ile başlıktaki dizileri.

Kurulum kolaylığı için, Şekil 1 ve Şekil 2, sırasıyla IRI analizi ve buzlu afinite temizliği için kullanılan ekipman, görsel bir gösterge olarak dahil edilmiştir. Öğren olan ve olmayan hardal otu toplanan özler kullanılarak IRI analiz sonuçları Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Bu sonuçlar, dondurularak dayanıklı değildir hardal otu, toplanan ekstraktlar ba...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification at JoVE.com

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Bu çalışma, buz yeniden kristalleşme engelleme etkinliği ve buzlu afinite saflaştırmasını kullanarak yerel öğren daha sonra tecrit değerlendirme yoluyla dondurularak dayanıklı bitkiler buz bağlayıcı proteinin tanımlanmasını açıklar.

Bitki Buz yakınlık Arıtma kullanma Buz yeniden kristalleşme İnhibisyon ve İzolasyonu Değerlendirilmesi sayesinde Proteinler Buz bağlayıcı tanımlanması

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobik Protein Saflaştırma ve DesB Dioxygenase etkinliği ve inhibisyon çalışmak için oksijen elektrodu ile kinetik Analizi

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Kloroplast Translocon Protein kompleksleri dokunun etiketini kullanarak benzeşme arıtma

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Yalıtım Glomeruli ve Glomerular hücre yüzey proteinleri Vivo etiketleme

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Fonksiyonel Protein bölgeleri Chimeric Protein inşaat aracılığıyla tanımlaması

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Dışa bakıyor: Siyanobacterial serbest karbonhidrat polimerleri ve proteinleri Izolasyonu

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoid Doğal Ürünlerin Enzimatik Üretimi ve Saflaştırılması için Özelleştirilebilir Bir Yaklaşım

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...