Name: methods to study epithelial transport protein function and expression in native intestine and caco-2 cells grown in 3d
Uploaded: 2017-03-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D at JoVE.com

We thank Mr. Christopher Manzella, MD/PhD student in the RKG laboratory, for helping to edit and proofread our manuscript.

מחקר 1. של מסועי מעיים בתוך מערכת תרבות 3D של קאקו-2: קאקו-2 3D גידול תרבית תאים על תערובת חלבון דביקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גורם גדילת הפשרה מופחת תערובת חלבונים דביקה על קרח למשך 8 שעות (או O / N) בשעה 4 מעלות צלזיוס. לאחר מופשר, להפוך 1 מ&quot;ל או 500 ali...

<ol>
	<li>Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+intestinal+epithelial+cell+differentiation.">In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation.</a> Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).</li><li>Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+3D+printed+insert+for+hanging+culture+of+Caco-2+cells.">Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells.</a> Biofabrication. 7 (1), 015003 (2014).</li><li>Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+controls+spindle+orientation+to+position+the+apical+surface+during+epithelial+morphogenesis.">Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis.</a> J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).</li><li>Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+serotonin+at+the+apical+and+basolateral+membranes+of+human+intestinal+epithelial+(Caco-2)+cells+occurs+through+the+neuronal+serotonin+transporter+(SERT).">Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT).</a> J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).</li><li>Gill, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function,+expression,+and+characterization+of+the+serotonin+transporter+in+the+native+human+intestine.">Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).</li><li>Esmaili, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteropathogenic+Escherichia+coli+infection+inhibits+intestinal+serotonin+transporter+function+and+expression.">Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression.</a> Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).</li><li>Wade, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+function+of+a+5-HT+transporter+in+crypt+epithelia+of+the+gastrointestinal+tract.">Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract.</a> J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).</li><li>Clarke, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+Ussing+chamber+studies+of+mouse+intestine.">A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+induces+changes+in+the+subcellular+distribution+of+actin+and+5'-nucleotidase.">Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5'-nucleotidase.</a> Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).</li><li>Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Detection+of+rabies+virus+antibodies+in+human+blood+serum+by+an+immunoenzyme+method].">[Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method].</a> Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).</li><li>Woods, G. L., Mills, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+dexamethasone+on+detection+of+herpes+simplex+virus+in+clinical+specimens+by+conventional+cell+culture+and+rapid+24-well+plate+centrifugation.">Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation.</a> J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).</li><li>Chase, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+for+shingles.">Acyclovir for shingles.</a> Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).</li><li>Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+rat+liver+cytochrome+P-450UT-H+cDNA+clone+and+comparison+of+mRNA+levels+with+catalytic+activity.">Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity.</a> Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).</li><li>Steiner, M., Tateishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+transport+of+calcium+in+human+platelets.">Distribution and transport of calcium in human platelets.</a> Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).</li><li>McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Mbo+II+methylase+(GAAGmA)+from+Moraxella+bovis:+site+specific+cleavage+of+DNA+at+nine+and+ten+base+pair+sequences.">Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences.</a> Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).</li><li>Chatterjee, I. s. h. i. t. a., K, A., Gill, R. a. v. i. n. d. e. r. . K., Alrefai, W. a. d. d. a. h. . A., Dudeja, P. r. a. d. e. e. p. . K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Cell+Culture+of+CaCo2:+A+Better+Model+to+Study+the+Functionality+and+Regulation+of+Intestinal+Ion+Transporters.">3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters.</a> Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654 (2014).</li><li>Fagg, R. H., Hyslop, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+variant+strain+of+foot-and-mouth+disease+virus+(type+O)+during+passage+in+partly+immunized+cattle.">Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle.</a> J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).</li><li>Shilkina, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[The+aspects+of+the+problem+of+systemic+vasculitis+open+to+discussion]).">[The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]).</a> Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).</li><li>Derichs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+current+measurement+for+diagnostic+classification+of+patients+with+questionable+cystic+fibrosis:+validation+and+reference+data.">Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data.</a> Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).</li></ol>

לגמרי תא בדיל קאקו-2 monolayers נעשה שימוש נרחב כמו מקוטב monolayers אפיתל ללמוד תחבורת מעיים 10, 11, 12, 13, 14, 15. עם זאת, כדי לחקות את הארגון הפיזיולוגי של תאי אפיתל במעי, חלה ?...

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/55304">Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D</a>.
One of the authors&#39; names was corrected from:
Arivarasu N. Anabazhagan
to:
Arivarasu N. Anbazhagan

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/55304">Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D</a>.

Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

אפיתל המעי מצויד חלבוני תחבורה שונים (ערוצים, ATPases, שיתוף מובילי מחליפים) המבצעים פונקציות רבות, החל קליטת חומרים מזינות, אלקטרוליטים, ותרופות הפרשת הנוזלים ויוני לומן. חלבונים התחבורה ליצור הדרגתיים אלקטרוכימיים לאפשר תנועה של יונים או מולקולות באופן וקטורי. זו מושגת על ידי החלוקה הסימטרית של מערכות התחבורה בממברנות הפסגה ו basolateral של תאי אפיתל מקוטבים. בנוסף, צומת הדוקים, אשר לקשור תאי אפיתל סמוכים, ממלא תפקיד חשוב בתהליך זה על ידי המשרת כמחסום דיפוזיה intramembrane של רכיבים בין תחומי קרום apical ו basolateral. מערכות דגם מתאימות מחקו תכונות אופייניות הבאות של מעי הילידים (קוטבי כלומר, בידול, ויושרת צומת חזקה) הם קריטיות עבור המחקר של functionality של מערכות תחבורה אפיתל. בנוגע למודלים, שורות התאים האופייניות בשימוש כיום במחקר תחבורת האפיתל במעי הם קאקו-2, מודל של בדיל באופן מלא, קליטה תא אפיתל מעי דק; ותאי T-84 או HT-29 subclones, מודלים של תאים אפיתל במעי גדול הנגזרות הקריפטה 1. כמקובל, שורות תאים אלה גדלים כמו monolayers ב משטחי פלסטיק או מוסיף transwell מצופה. חוצה גם תרבית תאים מוסיף במידה מסוימת דומה בסביבה vivo בכך שהוא מאפשר לתאים מקוטבים להאכיל basolaterally. עם זאת, מגבלת מערכות תרבות 2D המקובלות היא כי התאים נאלצים להסתגל משטח מלאכותי, שטוח, ונוקשה. לפיכך, את המורכבות הפיזיולוגיות של האפיטל היליד אינה משתקפות במדויק מערכת 2D. מגבלה זו כבר להתגבר על ידי שיטות לגדל תאי 3D בתוך המיקרו-סביבה ספציפית, כגון mixtur חלבון הדביקדואר, המכיל מגוון של רכיבים התאים מטריקס 2, 3. אף על פי כן, התרבויות במבחנה לא יכול לדמות את המורכבות של האפיתל במעי, אשר יש סוגי תאים מרובים ואדריכלות המיועד לאזור ספציפי במעי. לפיכך, המחקרים באמצעות מודלי תרבית תאים דורשים אימות נוספת במעי הילידים. באמצעות תרבית תאי 3D במבחנה רירית מעי עכבר, אנו מתארים כאן שיטות פשוטות כדי ללמוד את הרגולציה של טרנספורטר הסרוטונין במעיים (SLC6A4, בהלבשה). טרנספורטר בהלבשה מסדיר את הזמינויות התאיות של הורמון חשוב הנוירוטרנסמיטר, 5 hydroxytryptamine (5-HT), על ידי במהירות והובלתו באמצעות Na + / Cl - תהליך תלוי. בהלבשה היא מטרה ידועה של תרופות נגד דיכאון, התפתחה לאחרונה כמטרה טיפולית חדשנית של הפרעות במערכת עיכול, כמו שלשול ודלקת מעיים.שיטות לחקור ספיגת 5-HT בתאי האפיתל במעי תוארה בעבר. לדוגמא, תאי קאקו-2 גדלו על תומך פלסטיק או מוסיף חדיר הוכחו להפגין fluoxetine רגיש 3 H-5-HT ספיג הן תחומי פסגה ו basolateral 4. מדידת התפקוד בהלבשה ב מבודד מברשת גבול ממברנה שלפוחית (BBMVs) שהוכנה במעי דק תורם אנושי איבר אף תוארה על ידינו 5. ספיג 3 H-5-HT ב BBVMs האנושי הוצג להיות fluoxetine רגיש Na + / Cl - תלוי, וזה הציג קינטיקה רווי עם K m של 300 ננומטר 5. ניצול בשיטות דומות, אנחנו גם נמדדנו קודם לכן פונקציה בהלבשה כמו 3 ספיגת H-5-HT ב BBMVs עכבר מעי 6. עם זאת, הכנת שלפוחית ​​קרום פלזמה טהורה דורשת כמות גדולה של רירית רקמות. שיטות אחרות, כגון radiogלהדמית raphic של 3 אתרים ספיגים H-5-HT, גם הוכחה בעבר שרקן ומעי עכברוש קטנים 7. תא Ussing מספק מערכת פיזיולוגית יותר למדוד את התחבורה של יונים, חומרים מזינים, וסמים פני רקמות שונות אפיתל. היתרון העיקרי של הטכניקה קאמרית Ussing הוא שהיא מאפשרת מדידה מדויקת של פרמטרים חשמליים והובלה של שלם, אפיתל המעי מקוטב. יתר על כן, כדי למזער את ההשפעה של מערכת עצבית-שרירית מהותי, הפשטה seromuscular של רירית המעי ניתן לבצע כדי לחקור את הרגולציה של מובילי באפיתל 8. אנו מראים כי קאקו-2 תאים שגודלו ב -3 D על חלבון דביק יוצרים לומן חלול להביע סמני פסגה ו basolateral ברורים. תאים אלו מראים ביטוי גבוה של בהלבשה מאשר תאי 2D קאקו-2. שיטות לגדל תאי 3D וכדי peimmunostaining rform או מיצוי RNA והחלבון מתואר. בנוסף, אנו מתארים שיטות ללמוד לתפקד בהלבשה וויסות TGF-β1, ציטוקין pleiotropic, ב רירית המעי הדק בעזרת ניצול טכניקה קאמרית Ussing.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174; HTB&#173;37&#8482;</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microsope for confocal Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3[H]-5-HT&#160;</td>
			<td>LabtekII</td>
			<td>152453</td>
			<td>Culturing cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-HT&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2- 5%Co2 cylinder</td>
			<td>KPL</td>
			<td>71-00-27</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (for Agar plates)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Acute toxicity, Ora</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (for electrode)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126-1KG</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorPhalloidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Harmful if swallowed or if inhaled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>A12380</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCo2 Cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8806-5G</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis Buffer&#160;</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chabered slides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type-1Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td>Used as Extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoxetine</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Gentamicin</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td>Cell culture Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Cell Signaling, Danvers, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836145001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter&#160;</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>70013--032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710 Meta</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>EM-CSYS-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>P2304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>VCC MC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>DM MC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Voltage/current Clamp</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>P2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>P2023-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>BP1423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>P288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strp</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>10420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>MEDOX, Chicago, IL&#160;</td>
			<td>style G- 12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA easy Mini kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Electrode Input Module&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliders for snapwell Chambers</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>H9523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>F132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>T7039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Perkin-Elmer,Waltham, MA</td>
			<td>NFT1167250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Packard Instruments, Downers Grove, IL</td>
			<td>B1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ussing Chamber (chamber only)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>I7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ussing Chamber Systems</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to study epithelial transport protein function and expression in native intestine and caco-2 cells grown in 3d

אפיתל המעי יש פונקציות תחבורת מחסום חשובות לשחק תפקיד מפתח פונקציות פיסיולוגיות של הגוף תוך מתן מחסום חלקיקים זרים. תחבורת אפיתל פגומה (יון, מזין, או תרופות) נמצאת קשורה למחלות רבות ויכולה להיות שלכות מרחיבות מעבר הפונקציות הפיזיולוגיות של מובילים, כגון באמצעות השפעה על שלמות אפיתל ואת Microbiome הבטן. הבנת הפונקציה והרגולציה של חלבוני תחבורה היא קריטית להתפתחות של התערבויות טיפוליות השתפרו. האתגר הגדול ביותר בחקר תחבורת אפיתל מפתחת מערכת מודל מתאימה כי משחזרת תכונות חשובות של תאי האפיתל במעי הילידים. כמה במבחנה מודלים תרבית תאים, כגון קאקו-2, T-84, ותאי HT-29-Cl.19A משמשים בדרך כלל במחקר תחבורה אפיתל. שורות תאים אלה מייצגות גישת רדוקציוני דוגמנות הדוארpithelium שמש במחקרים מכניסטית רבים, כולל ובדיקתם של אינטראקציות אפיתל-מיקרוביאלי. עם זאת, monolayers התא אינו משקף במדויק תאי תאי אינטראקציות ואת microenvironment vivo. תאים שגודלו 3D הראו להיות מבטיח מודלים ללימודי חדירות התרופה. אנו מראים כי תאי קאקו-2 ב -3 D יכול לשמש כדי לחקור מובילי אפיתל. כמו כן, חשוב כי מחקרים בתאי קאקו-2 הם השלימו עם מודלים אחרים כדי לשלול תופעות תא ספציפיות לקחת בחשבון את המורכבות של מעי הילידים. כמה שיטות שמשו בעבר על מנת להעריך את הפונקציונליות של מובילים, כגון צק ספיג כלפי חוץ בתאי אפיתל מבודדים או שלפוחית ​​הממברנה מבודדת. אם ניקח בחשבון את האתגרים בתחום ביחס למודלים ומדידת פונקציה תחבורה, אנחנו מדגימים כאן פרוטוקול לגדל תאים קאקו-2 ב 3D ולתאר את השימוש בתא Ussing כקובץגישה יעילה למדידת תחבורה סרוטונין, כגון ב epithelia מעיים שלם מקוטב.

Immunostaining ציסטות 3D קאקו-2 מוצג באיור 1. תמונה מייצגת של מטוס- XY מראה לומן היטב תחום של ציסטה 3D מוכתמת יקטין phalloidin מתוארת באיור 1 א. הצד הפונה לומן מציין את צד הפסגה. תאי אפיתל בתרבית מכך סביבת 3D ב פנוטיפ אפיתל חזק. קאקו-2 ציסטות שונים ביום ...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D at JoVE.com

Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

אנו מתארים שיטות פשוטות כדי ללמוד את הרגולציה של טרנספורטר הסרוטונין במעיים (בהלבשה) פונקציה וביטוי באמצעות מודל תרבית תאים במבחנה של תאי קאקו-2 גדל ב -3 D ו מודל vivo לשעבר של מעי עכבר. שיטות אלו חלות על המחקר של מובילי אפיתל אחרים.

שיטות לחקר תפקוד החלבון התחבורה אפיתל וביטוייה המעי Native ו קאקו-2 תאים שגודלו ב -3 D

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

ראשי תאים אנושיים אפיתל הסימפונות גדלה מ Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

באמצעות קאקו-2 תאים לחקר ליפידים תחבורה במעי

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...