Name: methods to study epithelial transport protein function and expression in native intestine and caco-2 cells grown in 3d
Uploaded: 2017-03-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D at JoVE.com

We thank Mr. Christopher Manzella, MD/PhD student in the RKG laboratory, for helping to edit and proofread our manuscript.

1. Utredning av Intestinal transportører i en 3D Kultur System of Caco-2: Økende 3D Caco-2 cellekultur på en Gelatinous proteinblanding <ol><li> Tine-vekstfaktor redusert gelatinøse proteinblandingen på is i 8 timer (eller O / N) ved 4 ° C. Tint, lage 1 ml eller 500 ul porsjoner for bruk eller oppbevar ved -20 ° C for senere bruk. </li><li> På dagen for kultur, kjøle kulturplater (for RNA og protein utvinning) eller kamret lysbilder (for farging) på isen. Tilsett 30 mL av geléaktige proteinblanding til hver...

<ol>
	<li>Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+intestinal+epithelial+cell+differentiation.">In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation.</a> Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).</li><li>Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+3D+printed+insert+for+hanging+culture+of+Caco-2+cells.">Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells.</a> Biofabrication. 7 (1), 015003 (2014).</li><li>Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+controls+spindle+orientation+to+position+the+apical+surface+during+epithelial+morphogenesis.">Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis.</a> J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).</li><li>Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+serotonin+at+the+apical+and+basolateral+membranes+of+human+intestinal+epithelial+(Caco-2)+cells+occurs+through+the+neuronal+serotonin+transporter+(SERT).">Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT).</a> J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).</li><li>Gill, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function,+expression,+and+characterization+of+the+serotonin+transporter+in+the+native+human+intestine.">Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).</li><li>Esmaili, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteropathogenic+Escherichia+coli+infection+inhibits+intestinal+serotonin+transporter+function+and+expression.">Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression.</a> Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).</li><li>Wade, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+function+of+a+5-HT+transporter+in+crypt+epithelia+of+the+gastrointestinal+tract.">Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract.</a> J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).</li><li>Clarke, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+Ussing+chamber+studies+of+mouse+intestine.">A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+induces+changes+in+the+subcellular+distribution+of+actin+and+5'-nucleotidase.">Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5'-nucleotidase.</a> Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).</li><li>Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Detection+of+rabies+virus+antibodies+in+human+blood+serum+by+an+immunoenzyme+method].">[Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method].</a> Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).</li><li>Woods, G. L., Mills, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+dexamethasone+on+detection+of+herpes+simplex+virus+in+clinical+specimens+by+conventional+cell+culture+and+rapid+24-well+plate+centrifugation.">Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation.</a> J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).</li><li>Chase, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+for+shingles.">Acyclovir for shingles.</a> Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).</li><li>Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+rat+liver+cytochrome+P-450UT-H+cDNA+clone+and+comparison+of+mRNA+levels+with+catalytic+activity.">Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity.</a> Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).</li><li>Steiner, M., Tateishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+transport+of+calcium+in+human+platelets.">Distribution and transport of calcium in human platelets.</a> Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).</li><li>McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Mbo+II+methylase+(GAAGmA)+from+Moraxella+bovis:+site+specific+cleavage+of+DNA+at+nine+and+ten+base+pair+sequences.">Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences.</a> Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).</li><li>Chatterjee, I. s. h. i. t. a., K, A., Gill, R. a. v. i. n. d. e. r. . K., Alrefai, W. a. d. d. a. h. . A., Dudeja, P. r. a. d. e. e. p. . K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Cell+Culture+of+CaCo2:+A+Better+Model+to+Study+the+Functionality+and+Regulation+of+Intestinal+Ion+Transporters.">3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters.</a> Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654 (2014).</li><li>Fagg, R. H., Hyslop, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+variant+strain+of+foot-and-mouth+disease+virus+(type+O)+during+passage+in+partly+immunized+cattle.">Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle.</a> J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).</li><li>Shilkina, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[The+aspects+of+the+problem+of+systemic+vasculitis+open+to+discussion]).">[The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]).</a> Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).</li><li>Derichs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+current+measurement+for+diagnostic+classification+of+patients+with+questionable+cystic+fibrosis:+validation+and+reference+data.">Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data.</a> Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).</li></ol>

Fullt differensierte Caco-2-cellemonolagene har blitt brukt i stor utstrekning som polarisert epitel-monolag å studere intestinal transport 10, 11, 12, 13, 14, 15. Imidlertid, for å etterligne fysiologiske organiseringen av intestinale epitelceller, har det vært stor interesse for utvikling av en Caco-2-kultur i 3D. En re...

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/55304">Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D</a>.
One of the authors&#39; names was corrected from:
Arivarasu N. Anabazhagan
to:
Arivarasu N. Anbazhagan

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/55304">Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D</a>.

Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

Tarmepitelet er utstyrt med flere transport- proteiner (kanaler, ATPaser, co-transportører og veks) som utfører en rekke funksjoner som strekker seg fra absorpsjon av næringsstoffer, elektrolytter, og legemidler for utskillelsen av væske og ioner i lumen. Transportproteiner generere elektrokjemiske gradienter som tillater bevegelse av ioner eller molekyler i en vektoriell måte. Dette oppnås ved de asymmetriske fordelinger av transportsystemene i den apikale og basolaterale membraner av polariserte epitelceller. I tillegg er tett veikryss, som fortøyningen tilstøtende epitelceller, spiller en viktig rolle i denne prosessen ved å tjene som en barriere mot intramembrane diffusjon av komponentene mellom de apikale og basolaterale membran domener. Passende modellsystemer som etterligner disse karakteristiske trekk ved de innfødte tarmen (dvs. polaritet, differensiering, og stram krysset integritet) er kritisk for studiet av functiodis- posisjon av epiteliale transportsystemer. Med hensyn til modeller, den typiske cellelinjer som benyttes for tiden i intestinal epithelial transport forskning er Caco-2, en modell av fullt differensiert, absorberende små intestinale epitelceller; og T84 celler eller HT-29 subkloner, modeller av krypten-avledet store intestinale epitelceller 1. Vanligvis er disse cellelinjer dyrket som monolag i plastoverflater eller i belagte Transwell innsatser. Trans-brønns celledyrkningsinnsatser til en viss grad ligner in vivo miljø ved at polariserte celler til å mate basolaterally. Imidlertid er en begrensning i konvensjonelle 2D kultursystemer at cellene blir tvunget til å tilpasse seg en kunstig, flat og stiv overflate. Således er den fysiologiske kompleksiteten av det native epitel ikke nøyaktig gjenspeiles i et 2D-system. Denne begrensningen har blitt overvunnet ved fremgangsmåter for å dyrke celler i 3D i en bestemt mikromiljøet, for eksempel gelatinaktig protein mixture, som inneholder en rekke ekstracellulære matriks-komponentene 2, 3. Ikke desto mindre kan de in vitro kulturer ikke simulere kompleksiteten i tarmepitelet, som har flere celletyper og regionspesifikke arkitektur i tarmen. Dermed studier ved hjelp av cellekultur modeller kreve ytterligere validering på mors tarmen. Ved hjelp av in vitro cellekultur 3D og mus intestinal mucosa, beskriver vi her enkle metoder for å studere reguleringen av tarmserotonintransportøren (SLC6A4, SERT). Den SERT transporter regulerer den ekstracellulære tilgjengeligheten av et viktig hormon og nevrotransmitter, 5-hydroksytryptamin (5-HT), ved raskt å transportere den gjennom en Na + / Cl - -avhengig prosess. Sert er et kjent mål for anti-depressiva og har nylig dukket opp som en roman terapeutisk mål av GI lidelser, for eksempel diaré og tarmbetennelse.Metoder for å undersøke 5-HT-opptak i intestinale epitelceller er tidligere blitt beskrevet. For eksempel har Caco-2-celler dyrket på plast bærere eller gjennomtrengelige innsatser blitt vist å oppvise fluoksetin-sensitive 3H-5-HT gjenopptak ved begge apikale og basolaterale domener 4. Målingen av SERT funksjon i isolert børstegrense membranvesikler (BBMVs) fremstilt fra menneskeorgan givertynntarmen er også blitt beskrevet av oss 5. 3-H-5-HT gjenopptak i humane BBVMs ble vist å være fluoksetin-sensitive og Na + / Cl - -avhengig, og det oppviste metningskinetikk med en K m av 300 nM 5. Ved å benytte lignende fremgangsmåter, har vi også tidligere målte SERT funksjon som 3H-5-HT-opptak i mus intestinal BBMVs 6. Imidlertid er fremstilling av rene plasmamembranvesiklene krever en stor mengde av vev mucosa. Andre metoder, slik som radiographic visualisering av 3 H-5-HT-opptakssetene, har også vært vist tidligere i marsvin og rotte tynntarmen 7. Den Ussing kammer gir et mer fysiologisk system for å måle transport av ioner, næringsstoffer, medikamenter og på tvers av ulike epitelvev. Den største fordelen med den Ussing kammer teknikken er at den muliggjør nøyaktig måling av de elektriske og transportparameterne i intakte, polarisert tarmepitelet. Videre, for å minimalisere påvirkning av den iboende nevromuskulære system, kan seromuskulære stripping av tarmslimhinnen bli utført for å undersøke regulering av transportører i epitelet 8. Vi viser at Caco-2 celler dyrket i 3D på geléaktig protein danner en hul lumen uttrykke tydelige apikale og basolaterale markører. Disse cellene viser høyere uttrykk av Sert enn 2D Caco-2 celler. Fremgangsmåter for å dyrke 3D-celler og for å perform farging eller RNA og proteinutvinning er beskrevet. I tillegg, beskriver vi metoder for å studere SERT funksjon og regulering av TGF-β1, en pleiotropisk cytokin, i tynntarmslimhinne ved bruk av en Ussing kammer teknikk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174; HTB&#173;37&#8482;</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microsope for confocal Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3[H]-5-HT&#160;</td>
			<td>LabtekII</td>
			<td>152453</td>
			<td>Culturing cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-HT&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2- 5%Co2 cylinder</td>
			<td>KPL</td>
			<td>71-00-27</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (for Agar plates)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Acute toxicity, Ora</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (for electrode)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126-1KG</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorPhalloidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Harmful if swallowed or if inhaled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>A12380</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCo2 Cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8806-5G</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis Buffer&#160;</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chabered slides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type-1Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td>Used as Extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoxetine</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Gentamicin</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td>Cell culture Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Cell Signaling, Danvers, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836145001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter&#160;</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>70013--032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710 Meta</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>EM-CSYS-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>P2304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>VCC MC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>DM MC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Voltage/current Clamp</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>P2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>P2023-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>BP1423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>P288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strp</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>10420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>MEDOX, Chicago, IL&#160;</td>
			<td>style G- 12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA easy Mini kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Electrode Input Module&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliders for snapwell Chambers</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>H9523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>F132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>T7039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Perkin-Elmer,Waltham, MA</td>
			<td>NFT1167250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Packard Instruments, Downers Grove, IL</td>
			<td>B1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ussing Chamber (chamber only)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>I7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ussing Chamber Systems</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to study epithelial transport protein function and expression in native intestine and caco-2 cells grown in 3d

Tarmepitelet har viktige transport- og barrierefunksjoner som spiller nøkkelroller i normale fysiologiske funksjoner i kroppen samtidig som det gir en barriere mot fremmede partikler. Nedsatt epitelial transport (ion, næringsstoffer eller medikamenter) har blitt forbundet med mange sykdommer og kan ha konsekvenser som strekker seg utover de normale fysiologiske funksjoner av transportørene, for eksempel ved å påvirke epitelial integritet og tarmen mikrobiomer. Å forstå funksjon og regulering av transportproteiner er kritisk for utviklingen av forbedrede terapeutiske intervensjoner. Den største utfordringen i studiet av epiteliale transport er å utvikle en passende modellsystem som sammenfatter viktige trekk ved de innfødte intestinale epitelceller. Flere in vitro cellekultur modeller, slik som Caco-2, T-84, og HT-29-celler Cl.19A brukes vanligvis i epithelial transport forskning. Disse cellelinjene representerer en reductionist tilnærming for å modellere epithelium og har vært brukt i mange mekanistiske studier, inkludert deres undersøkelse av epitel-mikrobiell interaksjoner. Men ikke cellemono ikke nøyaktig gjenspeiler celle-celle interaksjoner og in vivo mikromiljøet. Celler dyrket i 3D har vist seg å være lovende modeller for medikament permeabilitet studier. Vi viser at Caco-2-celler i 3D, kan brukes til å studere epiteliale transportører. Det er også viktig at studier i Caco-2-celler er supplert med andre modeller for å utelukke celle spesifikke effekter og for å ta hensyn til kompleksiteten til det native tarmen. Flere metoder er tidligere blitt brukt til å vurdere funksjonaliteten av transportører, slik som vrengte sekk og opptak i isolerte epitelceller eller i isolerte plasmamembranvesiklene. Tatt i betraktning de utfordringer i felt med hensyn til modell og måling av transportfunksjon, viser vi her en protokoll for å vokse Caco-2-celler i 3D og beskriver bruken av en Ussing kammer som eneffektiv metode for å måle serotonin transport, for eksempel i intakte polariserte intestinale epitel.

Immunfarging i 3D Caco-2 cyster er vist i figur 1. Et representativt bilde av et XY-plan som viser godt avgrensede hulrom i 3D-cyst farget med phalloidin aktin er vist i figur 1A. Den siden som vender mot hulrommet betegner den apikale side. Epitelceller dyrket i et 3D-miljø resultat i en robust epitelial fenotype. Ulike Caco-2 cyster på dag 12, da aktin og Sert var co-farget, er vist i figur 1B. I denne representasjon av en XY-planet ...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D at JoVE.com

Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

Vi beskriver enkle metoder for å studere reguleringen av tarmserotonintransportøren (SERT) funksjon og ekspresjon ved bruk av en in vitro-cellekulturmodell av Caco-2-celler dyrket i 3D og en ex vivo-modell av mus tarmen. Disse metodene er aktuelt for studiet av andre epiteliale transportører.

Metoder for å studere epithelial Transport Protein Funksjon og Expression i Native tarmen og Caco-2 celler dyrket i 3D

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Purification (kvitre)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Rapid Genetic Analysis of epitelial-mesenchymale signaleringsprotokoll Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induksjon og analyse av Epiteliale til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Høy oppløsning Whole Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering innenfor sebrafisk embryoer å studere Gene Expression og funksjon

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening for å identifisere Ubiquitin og Ubiquitin-lignende system regulatorer av biologiske mekanismer i dyrkede pattedyrceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funksjonell tilberedning og Channel Aktivitet Målinger av Renset villtype og Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Bruke Caco-2 celler å studere Lipid Transport av tarmen

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...