Name: methods to study epithelial transport protein function and expression in native intestine and caco-2 cells grown in 3d
Uploaded: 2017-03-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D at JoVE.com

We thank Mr. Christopher Manzella, MD/PhD student in the RKG laboratory, for helping to edit and proofread our manuscript.

1. Studie av Intestinal Transportörer i en 3D kultursystem av Caco-2: Odling 3D Caco-2 cellkultur på en Gelatinous proteinblandning <ol><li> Tö tillväxtfaktor reducerat gelatinös proteinblandningen på is under 8 h (eller O / N) vid 4 ° C. När tinats, göra 1 ml eller 500 mikroliter alikvoter för användning eller förvara vid -20 ° C för senare användning. </li><li> På dagen för kultur, förkyla odlingsplattorna (för RNA och protein-extraktion) eller chambered slides (för immunfärgning) på is. Tills?...

<ol>
	<li>Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+intestinal+epithelial+cell+differentiation.">In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation.</a> Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).</li><li>Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+3D+printed+insert+for+hanging+culture+of+Caco-2+cells.">Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells.</a> Biofabrication. 7 (1), 015003 (2014).</li><li>Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+controls+spindle+orientation+to+position+the+apical+surface+during+epithelial+morphogenesis.">Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis.</a> J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).</li><li>Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+serotonin+at+the+apical+and+basolateral+membranes+of+human+intestinal+epithelial+(Caco-2)+cells+occurs+through+the+neuronal+serotonin+transporter+(SERT).">Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT).</a> J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).</li><li>Gill, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function,+expression,+and+characterization+of+the+serotonin+transporter+in+the+native+human+intestine.">Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).</li><li>Esmaili, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteropathogenic+Escherichia+coli+infection+inhibits+intestinal+serotonin+transporter+function+and+expression.">Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression.</a> Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).</li><li>Wade, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+function+of+a+5-HT+transporter+in+crypt+epithelia+of+the+gastrointestinal+tract.">Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract.</a> J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).</li><li>Clarke, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+Ussing+chamber+studies+of+mouse+intestine.">A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+induces+changes+in+the+subcellular+distribution+of+actin+and+5'-nucleotidase.">Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5'-nucleotidase.</a> Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).</li><li>Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Detection+of+rabies+virus+antibodies+in+human+blood+serum+by+an+immunoenzyme+method].">[Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method].</a> Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).</li><li>Woods, G. L., Mills, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+dexamethasone+on+detection+of+herpes+simplex+virus+in+clinical+specimens+by+conventional+cell+culture+and+rapid+24-well+plate+centrifugation.">Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation.</a> J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).</li><li>Chase, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+for+shingles.">Acyclovir for shingles.</a> Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).</li><li>Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+rat+liver+cytochrome+P-450UT-H+cDNA+clone+and+comparison+of+mRNA+levels+with+catalytic+activity.">Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity.</a> Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).</li><li>Steiner, M., Tateishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+transport+of+calcium+in+human+platelets.">Distribution and transport of calcium in human platelets.</a> Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).</li><li>McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Mbo+II+methylase+(GAAGmA)+from+Moraxella+bovis:+site+specific+cleavage+of+DNA+at+nine+and+ten+base+pair+sequences.">Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences.</a> Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).</li><li>Chatterjee, I. s. h. i. t. a., K, A., Gill, R. a. v. i. n. d. e. r. . K., Alrefai, W. a. d. d. a. h. . A., Dudeja, P. r. a. d. e. e. p. . K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Cell+Culture+of+CaCo2:+A+Better+Model+to+Study+the+Functionality+and+Regulation+of+Intestinal+Ion+Transporters.">3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters.</a> Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654 (2014).</li><li>Fagg, R. H., Hyslop, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+variant+strain+of+foot-and-mouth+disease+virus+(type+O)+during+passage+in+partly+immunized+cattle.">Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle.</a> J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).</li><li>Shilkina, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[The+aspects+of+the+problem+of+systemic+vasculitis+open+to+discussion]).">[The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]).</a> Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).</li><li>Derichs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+current+measurement+for+diagnostic+classification+of+patients+with+questionable+cystic+fibrosis:+validation+and+reference+data.">Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data.</a> Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).</li></ol>

Fullt differentierade Caco-2 cellmonoskikt har använts i stor utsträckning som polariserad epiteliala monoskikt för att studera intestinal transport 10, 11, 12, 13, 14, 15. Men för att härma den fysiologiska organisationen av intestinala epitelceller, har det funnits ett stort intresse för utvecklingen av ett Caco-2 ku...

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/55304">Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D</a>.
One of the authors&#39; names was corrected from:
Arivarasu N. Anabazhagan
to:
Arivarasu N. Anbazhagan

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/55304">Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D</a>.

Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

Tarmepitelet är utrustad med olika transportproteiner (kanaler, ATPaser, co-transportörer och värmeväxlare) som utför många funktioner som sträcker sig från absorptionen av näringsämnen, elektrolyter och droger till utsöndringen av vätska och joner i lumen. Transportproteiner genererar elektrokemiska gradienter som tillåter förflyttning av joner eller molekyler i en vektor sätt. Detta uppnås genom de asymmetriska fördelningar av transportsystemen i apikala och basolaterala membran av polariserade epitelceller. Dessutom, täta förbindelser, som Tether intilliggande epitelceller, spelar en viktig roll i denna process genom att fungera som en barriär mot intramembrane diffusion av komponenter mellan de apikala och basolaterala membran domäner. Lämpliga modellsystem som härmar dessa kännetecken för den infödda tarm (dvs. polaritet, differentiering och tight junction integritet) är avgörande för studien av funktionality av epitelceller transportsystem. När det gäller modeller, de typiska cellinjer som används för närvarande i tarm forskning epitel transport är Caco-2, en modell för fullt differentierade, absorberande epitelceller i tunntarmen; och T84-celler eller HT-29 subkloner, modeller av crypt härrörande stora intestinala epitelceller 1. Konventionellt är dessa cellinjer odlas som monoskikt i plastytor eller belagda Transwell skär. Trans-well cellodlingsinsatser i viss mån likna in vivo miljön genom att tillåta polariserade celler att mata basolaterally. Emellertid är en begränsning i konventionella 2D odlingssystem att cellerna tvingas att anpassa sig till en konstgjord, platt och styv yta. Således är den fysiologiska komplexiteten hos den nativa epitel inte korrekt i en 2D-system. Denna begränsning har övervunnits av metoder för att odla celler i 3D i ett visst mikro, såsom geléform protein mixture, som innehåller en mängd olika extracellulära matriskomponenter 2, 3. Icke desto mindre kan de in vitro-kulturer inte simulera komplexiteten i tarmepitelet, som har flera celltyper och region-specifik arkitektur i tarmen. Således studier med cellodlingsmodeller kräver ytterligare validering i den nativa tarmen. Använda in vitro 3D cellkultur och mus tarmslemhinna, beskriver vi här enkla metoder för att studera regleringen av tarmserotonintransportören (SLC6A4, SERT). Den SERT transportör reglerar den extracellulära tillgängligheten av en viktig hormon och neurotransmittor, 5-hydroxitryptamin (5-HT), genom att snabbt transportera den genom en Na + / Cl - -beroende process. Sert är ett känt mål för anti-depressiva och har nyligen dykt upp som ett nytt terapeutiskt mål av GI störningar, såsom diarré och tarminflammation.Metoder för att undersöka 5-HT-upptag i tarmepitelceller har tidigare beskrivits. Till exempel, har Caco-2-celler som odlas på plaststöd eller permeabla skär visats uppvisa fluoxetin känsliga 3 H-5-HT-upptag vid båda apikala och basolaterala domänerna 4. Mätningen av SERT funktion i isolerade tarmluddet membranvesiklar (BBMVs) framställt från human organdonatortunntarmen har också beskrivits av oss fem. 3 H-5-HT-upptag i humana BBVMs visades vara fluoxetin känslig och Na + / Cl - -beroende, och det uppvisade mättnads kinetik med ett K m av 300 nM 5. Med hjälp av liknande metoder, vi också tidigare uppmätta SERT funktion som 3 H-5-HT-upptag i mus tarm BBMVs 6. Emellertid framställningen av rena plasma membranvesiklar kräver en stor mängd av vävnad slemhinna. Andra metoder, såsom den radiographic visualisering av 3 H-5-HT-upptagsställen, har också visats tidigare i marsvin och råtta tunntarmen 7. Den Ussing Kammaren tillhandahåller ett mer fysiologiskt system för att mäta transporten av joner, näringsämnen och läkemedel genom olika epitelvävnader. Den största fördelen med den Ussing kammartekniken är att den möjliggör den exakt mätning av de elektriska och transportparametrar av intakt, polariserade intestinala epitel. Vidare, för att minimera inverkan av den inneboende neuromuskulära systemet, kan utföras seromuscular strippning av tarmslemhinnan för att undersöka regleringen av transportörer i epitelet 8. Vi visar att Caco-2-celler odlas i 3D på geléform protein bildar en ihålig lumen som uttrycker olika apikala och basolaterala markörer. Dessa celler visar högre uttryck av Sert än 2D Caco-2-celler. Metoder för att odla 3D celler och peR formimmunfärgning eller RNA och protein extraktion beskrivs. Dessutom beskriver vi metoder för att studera SERT funktion och reglering av TGF-β1, en pleiotropisk cytokin, i tunntarmens slemhinna genom att utnyttja en Ussing kammarteknik.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174; HTB&#173;37&#8482;</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microsope for confocal Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3[H]-5-HT&#160;</td>
			<td>LabtekII</td>
			<td>152453</td>
			<td>Culturing cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-HT&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2- 5%Co2 cylinder</td>
			<td>KPL</td>
			<td>71-00-27</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (for Agar plates)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Acute toxicity, Ora</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (for electrode)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126-1KG</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa FluorPhalloidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Harmful if swallowed or if inhaled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>A12380</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCo2 Cells</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8806-5G</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lysis Buffer&#160;</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chabered slides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>Not a hazardous substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type-1Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td>Used as Extracellular matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoxetine</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Gentamicin</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td>Cell culture Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Cell Signaling, Danvers, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836145001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter&#160;</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>70013--032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710 Meta</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>EM-CSYS-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>P2304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>VCC MC8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>DM MC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Voltage/current Clamp</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>P2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>P2023-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>BP1423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>P288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strp</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>10420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>MEDOX, Chicago, IL&#160;</td>
			<td>style G- 12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA easy Mini kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Electrode Input Module&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliders for snapwell Chambers</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>H9523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>F132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>T7039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Perkin-Elmer,Waltham, MA</td>
			<td>NFT1167250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Packard Instruments, Downers Grove, IL</td>
			<td>B1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>221473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ussing Chamber (chamber only)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>I7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ussing Chamber Systems</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to study epithelial transport protein function and expression in native intestine and caco-2 cells grown in 3d

Tarmepitelet har viktiga transport- och barriärfunktioner som spelar nyckelroller i normala fysiologiska funktioner i kroppen samtidigt som en barriär mot främmande partiklar. Nedsatt epitel transport (jon, närings eller läkemedel) har förknippats med många sjukdomar och kan få konsekvenser som sträcker sig utöver de normala fysiologiska funktioner transportörerna, såsom genom att påverka epitel integritet och tarmen microbiome. Förstå funktionen och regleringen av transportproteiner är avgörande för utvecklingen av förbättrade terapeutiska ingrepp. Den största utmaningen i studiet av epitel transport utvecklar ett lämpligt modellsystem som rekapitulerar viktiga inslag i de infödda intestinala epitelceller. Flera in vitro cellodlingsmodeller, såsom Caco-2, T-84, och HT-29-Cl.19A celler används vanligen i epitel transportforskning. Dessa cellinjer utgör ett reduktionistiskt tillvägagångssätt för att modellera den epithelium och har använts i många mekanistiska studier, inklusive deras undersökning av epitelceller mikrobiella interaktioner. Däremot har cellmonoskikt inte korrekt återspeglar cell-cell interaktioner och in vivo mikromiljö. Celler odlade i 3D har visat sig vara lovande modeller för läkemedels permeabilitets studier. Vi visar att Caco-2-celler i 3D kan användas för att studera epiteliala transportörer. Det är också viktigt att studier på Caco-2-celler kompletteras med andra modeller för att utesluta cellspecifika effekter och att ta hänsyn till komplexiteten i den nativa tarmen. Flera metoder har tidigare använts för att bedöma funktionalitet av transportörer, såsom vrängda säcken och upptag i isolerade epitelceller eller i isolerade plasma membranvesiklar. Med hänsyn till de utmaningar inom området med avseende på modeller och mätning av transportfunktion, visar vi här ett protokoll för att odla Caco-2-celler i 3D och beskriver användningen av en Ussing kammare som eneffektiv metod för att mäta serotonin transporter, såsom i intakta polariserade intestinala epitel.

Immunfärgning i 3D Caco-2-cystor visas i figur 1. En representativ bild av en XY-planet som visar välavgränsade lumen i 3D-cysta färgades med falloidin aktin är avbildad i Figur 1A. Den sida som vetter mot lumen betecknar apikala sidan. Epitelceller odlade i en 3D-miljö resulterar i en robust epitelial fenotyp. Olika Caco-2 cystor på dag 12, när aktin och SERT var co-färgade, visas i figur 1B. I denna representation av en XY-pla...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D at JoVE.com

Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

Vi beskriver enkla metoder för att studera regleringen av tarmserotonintransportören (SERT) funktion och uttryck med hjälp av ett in vitro-cellodlingsmodell av Caco-2-celler odlas i 3D och en ex vivo modell av mus tarmar. Dessa metoder kan tillämpas på studier av andra epitelceller transportörer.

Metoder för att studera Epithelial Transport proteiners funktion och uttryck i Native tarm och Caco-2-celler odlade i 3D

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primär mänskliga Bronkial epitelceller vuxit från explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Hi-C: En metod för att studera den tredimensionella arkitektur för ledare.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Rening (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Snabb genetisk analys av Epithelial-mesenkymala Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Hög upplösning Hela Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering inom Zebrafish embryon för att studera genuttryck och funktion

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening för att identifiera Ubiquitin och Ubiquitin-liknande system Regulatorer av biologiska banor i odlade däggdjursceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funktionell beredning och Kanalaktivitets Mätningar av renat Vildtyps och Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Använda Caco-2-celler för att studera lipidtransport av tarmen

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...