Name: identification of erythromyeloid progenitors and their progeny in the mouse embryo by flow cytometry
Uploaded: 2017-07-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry at JoVE.com

Forfatterne takker prof Frederic Geissmann og prof Christian Schulz for innsiktsfulle diskusjoner; Dr Hannah Garner for kritisk avlesning av manuskriptet, dr. Xavier Montagutelli og dr. Jean Jaubert og personalet på Institut Pasteur dyreanlegg for støtte med musekultur; Og Pascal Dardenne og Vytaute Boreikaite, en Amgen Scholar, for teknisk assistanse. Forskning i EGP-laboratoriet finansieres av Institut Pasteur, CNRS, Cercle FSER (FRM og en startpakke fra Institut Pasteur og REVIVE-konsortiet. LI støttes av et PhD-fellesskap fra REVIVE-konsortiet.

Dyreprosedyrer ble utført i samsvar med godkjent institusjonell dyrepleie og brukskomité for Institut Pasteur (CETEA). 1. I Utero Pulse Labeling i Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP Embryoer <ol><li> Forbered stamløsningen av 4-hydroksytamoksifen (OH-TAM, 50 mg / ml). <ol><li> Under fumehood, åpne 25 mg hetteglass med OH-TAM og tilsett 250 μL etanol (100%). </li><li> Overfør OH-TAM-oppløsningen til et 2 m...

<ol>
	<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+pathways+to+mature+macrophages+in+the+early+mouse+yolk+sac.">Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac.</a> Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).</li><li>Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+erythroid+and+myeloid+progenitors+in+the+yolk+sac+and+embryo+proper+of+the+mouse.">Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse.</a> Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).</li><li>Chen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid/myeloid+progenitors+and+hematopoietic+stem+cells+originate+from+distinct+populations+of+endothelial+cells.">Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).</li><li>Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+Hematopoiesis+in+the+Yolk+Sac+Emerges+from+Wnt-Responsive+Hemogenic+Endothelium+Independently+of+Circulation+and+Arterial+Identity.">Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity.</a> Stem Cells. , (2015).</li><li>Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+hematopoietic+stem+cells+undergo+maturation+in+the+fetal+liver.">Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver.</a> Development. 139 (19), 3521-3530 (2012).</li><li>Gomez Perdiguero, ., E, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors.">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li><li>Hoeffel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Myb(+)+erythro-myeloid+progenitor-derived+fetal+monocytes+give+rise+to+adult+tissue-resident+macrophages.">C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages.</a> Immunity. 42 (4), 665-678 (2015).</li><li>Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+function+of+tissue+resident+macrophages+in+mice.">Development and function of tissue resident macrophages in mice.</a> Semin Immunol. 27 (6), 369-378 (2015).</li><li>Houssaint, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+mouse+hepatic+primordium.+II.+Extrinsic+origin+of+the+haemopoietic+cell+line.">Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line.</a> Cell Differ. 10 (5), 243-252 (1981).</li><li>Cumano, A., Godin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+the+hematopoietic+system.">Ontogeny of the hematopoietic system.</a> Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).</li><li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Sources+of+Hematopoietic+Progenitors+Emerge+before+HSCs+and+Provide+Functional+Blood+Cells+in+the+Mammalian+Embryo.">Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo.</a> Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+delivery+of+4-hydroxy-tamoxifen+for+clonal+and+polyclonal+labeling+of+cells+of+the+surface+ectoderm,+skin,+and+hair+follicle.">Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle.</a> Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).</li><li>Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+development+during+mouse+embryogenesis.">Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis.</a> Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).</li><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+purified+intraembryonic+hematopoietic+stem+cells+as+a+tool+to+define+their+site+of+origin.">Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 134-139 (2005).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages.">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+tamoxifen-regulated+Cre+activity+in+mice+using+a+cartilage-specific+CreER(T)+to+assay+temporal+activity+windows+along+the+proximodistal+limb+skeleton.">Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton.</a> Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).</li><li>Qian, B. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL2+recruits+inflammatory+monocytes+to+facilitate+breast-tumour+metastasis.">CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis.</a> Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).</li><li>Yona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+origins+and+dynamics+of+monocytes+and+tissue+macrophages+under+homeostasis.">Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis.</a> Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).</li><li>Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+Tissue-Resident+Macrophages+Except+Microglia+Are+Derived+from+Fetal+Hematopoietic+Stem+Cells.">Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells.</a> Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).</li></ol>

De forskjellige bølgene av hematopoietiske forløperceller overlapper delvis innenfor en kort tidsramme, noe som gjør analysen av bidraget fra hver bølge av utviklingshematopoiesis til immunceller teknisk svært utfordrende. Tamoxifen-inducerbare Cre-systemer gir mulighet til å merke spesifikke celler på en temporær induktiv måte og å utføre linningsanalyse i embryoer eller voksne, uten behov for eks vivo eller in vitro- kultur eller transplantasjon. I tamoksifen-i...

Det er flere påfølgende, men overlappende bølger av hematopoietiske progenitorer under utvikling hvis myeloid avkom forblir i voksen alder. For det første kommer unipotente &quot;primitive&quot; progenitorer frem i muskelgulv sac 1 , 2 mellom E7.5-E8.25 og gir opphav til embryonale makrofager uten noe monocytisk mellomprodukt. Hvorvidt makrofager avledet fra primitive progenitorer vedvarer i den voksne hjernen, da microglia fortsatt er et emne for aktiv etterforskning. For det andre oppstår Erythro-Myeloid Precursors (EMP) i eggeplomme på E8.5, går inn i blodet og koloniserer embryoet. EMPs dukker opp fra blommesekken, hemogen endotel i en Runx1-avhengig endotel-til-hematopoietisk overgang 3 , 4 . Mens EMP kan skille seg inn i makrofager i blommesekken, koloniserer de også føtalelever fra embryonal dag (E) 9 5 og differenererTia til erytrocytter, megakaryocytter, makrofager, monocytter granulocytter og mastceller 6 . Makrofager som stammer fra EMP, utviser proliferativ kapasitet i utviklings- og voksenvev. Hvorvidt EMP-avledede makrofager omgår monocytfasen av differensiering, er fortsatt kontroversiell, da det er lite kjent om deres differensieringsvei 7 , 8 . Til slutt kommer hematopoietiske stamceller (HSCs) til å forekomme i E10.5 innenfor embryoet som er skikkelig fra aorta-gonad-mesonephros-regionen og migrere til føtalelever. HSCs med langsiktig repopulasjonskapasitet blir bare oppdaget etter E11 (på 42 somite pair-scenen) 9 . Der utvider og skilles de fra E12.5 til endelig hematopoiesis begynner å skifte til beinmarg, som blir det overordnede stedet for blodcelleproduksjon i løpet av det postnatale livet 10 . SpAtial og tidsmessig overlapping i fremveksten, så vel som delte immunfenotypiske markører, har hittil hindret vår evne til å skille mellom de spesifikke bidragene til disse bølgene av embryonale hematopoietiske stamceller. Mens både EMP og HSC genereres på en Runx1-avhengig måte og uttrykker transkripsjonsfaktoren Myb og vekstfaktorreceptoren Csf1r (kolonistimulerende faktor 1-reseptor, også kjent som makrofagkoloniestimulerende faktorreceptor) blant annet, kan EMPs skille seg fra HSCs ved deres mangel på lymfoide potensial, både in vitro og in vivo , deres mangel på langsiktig repopulerende potensial og mangel på overflateekspresjon av linjemarkøren Sca- 11 . Genetiske skjebne-kartleggingsmodeller kreves for å karakterisere makrofag ontogeni siden de tillater målretting av embryonale progenitorer på en celle-spesifikk og tids-spesifikk måte. Her presenterer vi skjebneprotokollen som brukes i laboratoriet for å diskriminere mellom de to linjeneS av makrofager funnet i de fleste voksne vev: HSC-avledede infiltrerende makrofager og HSC-uavhengige bosatte makrofager. Tissue hørende makrofager har blitt sporet tilbake til Myb-uavhengige forløperceller som uttrykker cytokinreseptor Csf1r 12 og er tilstede i embryo ved E8.5-E10.5 ved hjelp av tre komplementære skjebne-mapping strategier 6. For å studere blommesekk-hematopoiesis uten merking av føtal HSCs, bruker vi en transgen stamme, Csf1r MeriCreMer , som uttrykker et tamoxifen-inducerbart fusjonsprotein av &quot;forbedret&quot; Cre rekombinase og to musestrogenreseptorer (Mer-iCre-Mer) under kontroll av Csf1r-promotoren. Derfor vil Cre rekombinasen være aktiv i Csf1r- ekspresserende celler under et begrenset tidsvindu. Når det brukes med en reporterstamme som inneholder et fluorescerende protein nedstrøms for en lox-STOP-lox-kassett (Rosa26 LSL-eYFP ), vil det føre til permanentEnt genetisk merking av cellene tilstede ved induksjonstidspunktet, men også av deres avkom. Administrasjon ved E8.5 av den aktive formen av tamoxifen, 4-hydroksytamoksifen (OH-TAM), EMPs og makrofager, uten merking av yolkasse unipotente &quot;primitive&quot; progenitorer eller føtal HSCs. Dermed har vi karakterisert immunfenotypen av EMP og deres avkom under embryonisk utvikling, samt vurderte bidraget av eolkulver-avledede makrofager til de voksne makrofagbassengene. Ytterligere arbeid er nødvendig for å karakterisere om primitive stamcelleravledede makrofager også er merket ved hjelp av denne tilnærmingen og om de kan bidra til voksne makrofagbassenger.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 Straight Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15371-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.5 cm straight scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553355</td>
			<td>1/200 dilution in FACs Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104)</td>
			<td>Sony</td>
			<td>1149120</td>
			<td>1/100 dilution in FACs Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5892</td>
			<td>1/100 dilution in FACs Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>560512</td>
			<td>1/200 dilution in FACs Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>123137</td>
			<td>1/100 dilution in FACs Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>552850</td>
			<td>1/200 dilution in FACs Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12559069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11570506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527-20KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue culture plate</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>353224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11874235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells U-shape bottom tissue culture plate</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>353227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Syringe Plastipak 2 mL&#160;</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>300185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon grid 100 &#181;m cell strainers</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon grid 70 &#181;m cell strainers</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 &#956;m</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>51246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904-25MG</td>
			<td>Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3972</td>
			<td>Always use appropriate personal protective equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5007-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24103-1L-R-D</td>
			<td>Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10116287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B75408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX Daily QC Fluorospheres</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>B53230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VersaComp Antibody Capture Bead kit (2x5 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>B22804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J</td>
			<td>The Jackson laboratory</td>
			<td>19098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson laboratory</td>
			<td>6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of erythromyeloid progenitors and their progeny in the mouse embryo by flow cytometry

Makrofager er profesjonelle fagocytter fra den innfødte armen til immunsystemet. I steady-state er sessile makrofager funnet i voksne vev hvor de fungerer som frontlinjen sentineler av infeksjon og vevskader. Mens andre immunceller kontinuerlig fornyes fra hematopoietisk stamme og stamceller (HSPC) som ligger i beinmargen, har en rekke makrofager, kjent som bosatt makrofager, vist seg å være selvbetjent i vev uten inngang fra beinmargs HSPCs. Denne linjen er eksemplifisert av mikroglia i hjernen, Kupffer-celler i leveren og Langerhans-celler i epidermiene blant andre. Tarm og tarm lamina propria er de eneste voksne vevene uten HSPC-uavhengige bosatt makrofager. Nylige undersøkelser har identifisert at bosatt makrofager stammer fra den ekstra-embryonale blommesekken hematopoiesis fra stamceller som er forskjellig fra føtal hematopoietiske stamceller (HSC). Blant ølblokkesekke definitive hematopoiesis, eRythromyeloid progenitorer (EMP) gir opphav både til erytroide og myeloidceller, særlig bosatt makrofager. EMP genereres bare i blommesekken mellom E8.5 og E10.5 dager med utvikling, og de migrerer til føtalelever så tidlig som sirkulasjonen er koblet til, hvor de ekspanderer og skiller seg inntil minst E16.5. Deres avkom inkluderer erytrocytter, makrofager, nøytrofiler og mastceller, men bare EMP-avledede makrofager vedvarer til voksenlivet i vev. Den transiente karakteren av EMP-fremveksten og den tidsmessige overlapping med HSC-generasjon gjør analysen av disse forgjengerne vanskelig. Vi har etablert en tamoxifen-inducerbar skjebneprotokollprotokoll basert på ekspresjon av Cf1r-promotoren for makrofag-cytokinreceptor for å karakterisere EMP- og EMP-avledede celler in vivo ved hjelp av flytcytometri.

Genetisk skjebne kartlegging ble oppnådd ved administrasjon ved E8.5 av OH-TAM til Csf1r-Mer-iCre-Mer kvinner med par som bærer en Rosa26-LSL-eYFP reporter. I nærvær av OH-TAM fører eksisjonering av stoppkassetten til det permanente uttrykket av YFP i cellene som uttrykker Csf1r . Vi samler to hematopoietiske vev: eggeplommesekken og føtalelever og et ikke-hematopoietisk vev, nevroektodermen, fra embryoene ved E10.5. Enkeltcellesuspensjoner ble oppnådd ved enzyma...

Watch this Scientific Journal Video about Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry at JoVE.com

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Mens infiltrerende makrofager rekrutteres kontinuerlig til voksent vev fra sirkulerende forløpere, oppdager bosatte makrofager sitt vev under utvikling, der de opprettholdes uten ytterligere inngang fra forfedre. Forfedrene for bosatt makrofager ble nylig identifisert. Her presenterer vi metoder for kartlegging av genetisk skjebne av de residente makrofagprogenitorene.

Identifikasjon av erytromyeloidprogenitorer og deres avkom i musembryoen ved flowcytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering av Thymus- Bosetting stamfedre i Mouse Embryo hjelp<em&gt; I Vivo</em&gt; Og<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyser

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex vivo Culture of Faryngeal Arches å studere Hjerte og Muscle stamfedre og deres nisje

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Step-spesifikk Sortering av Musespermatider ved flowcytometrisystemer

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isolere og analysere cellene i bukspyttkjertelen Mesenchyme ved flowcytometri

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

En standardisert tilnærming til multispecies Rensing av mammaliske mannlige kimceller ved hjelp av mekanisk vævsdissosiasjon og flytcytometri

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Bioengineering av humaniserte benmarg mikromiljøer i mus og deres visualisering av levende bildebehandling

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Skiftende sebrafisk dødelige skjelettlidelser Mutant Penetrance av avkom Testing

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generasjon av stillaset-fri, tredimensjonale Insulin uttrykke Pancreatoids fra musen bukspyttkjertelen Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Bruk av blodkreft stamcelletransplantasjon å vurdere opprinnelsen til AML

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Sanntid Live-celle flowcytometri å undersøke kalsium tilstrømningen Pore dannelse og fagocytose av P2X7 reseptorer i voksen nevrale stamceller

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...