Name: a lipid extraction and analysis method for characterizing soil microbes in experiments with many samples
Uploaded: 2017-07-16T13:00:00
Duration: 17 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist finansieret af DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494) og DOE OBP Office for energieffektivitet og vedvarende energi (DE-AC05-76RL01830). Forfatterne vil gerne anerkende Anders Gurda for hans tålmodige og dygtige bidrag til videografi og redigering.

BEMÆRK: Brug altid passende personlige værnemidler (PPE) under hele proceduren. For at undgå potentiel prøveforurening må du ikke røre glasvarer med bare hænder. Brug egnede handsker, når du kører protokolstrin, der kræver håndtering af chloroform. 1. Forberedelser (2 dage for ~ 40 prøver) <ol><li> Saml jord i sterile poser og transporter fra feltet i en køler indeholdende is. Hvis det ikke er muligt at sive frisk jord og fryse tørre straks, opbevar prøverne i en fryser på -80 ° C, indtil de er klar til at starte analysen. </li><li> Forbered jorden ved homogenisering. Fjern rødder og sten og knæk klumper ved grov sigtning ( f.eks. 2 mm). </li><li> Forbered dig på frysetørring ved at sætte delprøver i en passende beholder efter instruktioner fra frysetørrerens håndbog og frys så hurtigt som muligt. Når jord er frysetørret, opbevares i en lukket beholder med tørremiddel til ekstraktion. Det er bedst at sRevet frysetørret jord i mindst -20 ° C, men fortrinsvis ved -80 ° C. </li><li> Som forberedelse til ekstraktion fjernes frysetørrede jordarter fra opbevaring og slibes til en mellignende konsistens. Metoder til slibning omfatter kuglemølle, kuglerør, morter og pistle. Opbevar i en fryser efter slipning (se 1.3). BEMÆRK: Mængden af ​​prøve anvendt til udvinding afhænger af indholdet af organisk stof. En generel retningslinje er at anvende 0,5 til 1 g af en jord, der er 12 til 18 vægtprocent kulstof og 3 til 5 g for en jord 1 til 3 vægtprocent kulstof. </li><li> Skyl 30 ml centrifugerør med hexan. Tilsæt ca. 2 til 3 ml hexan til rør og hvirvel i 5 sek. Dekanter hexan til et andet rør og hvirvel. Hexan (2 til 3 ml) kan anvendes til seriel skylning af seks rør. Opbevar hexanskylede rør, der er omvendt i spændhætten, og kassér brugt hexan i en passende affaldsbeholder. </li><li> Wrap glasvarer i 2 til 3 lag aluminiumsfolie og placere i muffelovnen. Bage(Muffle) glasvarer ved 450 ° C i 4,5 timer. </li><li> Forbered reagenser. <ol><li> For jordbunden anvendte mængde tilsættes kemikalier i en 0,8: 1: 2 volumenforhold for phosphat-puffer (P-puffer): CHCl3: MeOH. </li><li> Forbered P-bufferopløsning: Fosfatbuffer: 0,1 M, pH 7,0. <ol><li> Tilsæt 61 ml 1M K 2 HPO 4 lager, steril (kemikalie skal være ACS-certificeret klasse eller bedre). Tilsæt 39 ml 1 M KH 2 PO 4 lager, steril (kemikalie skal være ACS-certificeret eller bedre). Fyld til 1000 ml med type 1 vand. Juster pH til 7,0 med NaOH eller HCI. Opbevar ubrugt opløsning i op til 7 d ved omgivelsestemperatur eller 30 dage i køleskab. </li><li> Alternativt afvejes 10,62 g K 2 HPO 4 og 5,31 g KH 2PO 4; Fortyndes til 1 liter med type 1 vand. Kontroller pH, juster om nødvendigt. </li></ol></li><li> Forbered reagens 1, forsæbningsreagens. <ol><li> Dispense 300 ml Type 1 vand.Tilsæt 300 ml CH3OH (HPLC-kvalitet eller højere). Tilsæt 90,00 g NaOH (certificeret ACS eller bedre). Tilsæt NaOH pellets til opløsningen under omrøring. Rør til pellets opløses. Det anbefales at gemme denne løsning ikke længere end 30 d. </li></ol></li><li> Fremstillingsreagens 2, methyleringsreagens. <ol><li> Dispensere 275 ml CH3OH (HPLC-kvalitet eller højere). Tilsæt 325 ml certificeret 6,00 N HCL under omrøring. Det anbefales at gemme denne løsning ikke længere end 30 d. </li></ol></li><li> Forberede Reagens 3, Ekstraktionsreagens: 50% C 6 H 14 (hexan), 50% C5H 12 O (MTBE). <ol><li> I dampdækslet kombineres 200 ml C 6 H 14 (HPLC-kvalitet eller højere) og 200 ml C 5 H 12 O (HPLC-kvalitet eller højere). Bland godt Hætte tæt. Opbevares i brændeovnsskabsskab eller dampkåle i højst 1 år. </li></ol></li><li> Klargør reagens 4, basiskvas reagens. <ol><li> Dispense 900Ml Type 1-vand til bægerglas. Tilsæt 10,80 g NaOH (Certified ACS eller bedre) under omrøring. Rør til pellets opløses. Det anbefales at gemme denne løsning ikke længere end 30 d. </li></ol></li><li> Forbered stamopløsning af intern standard. <ol><li> Udvej 100 mg 19: 0 EE standard. Tilsæt til 50 ml hexanskylet volumetrisk kolbe. Tilsæt ~ 15 ml hexan-MTBE-opløsning (reagens 3) til kolben, hvirvel til opløsning. Top til 50 ml med Hexane-MTBE-opløsning (reagens 3). Hætte og hvirvel til at blande. Overfør til hexanskylede glasrør med PTFE-liner og opbevar ved -20 ° C. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. DAG 1 - Ekstraktion af fedtsyrer fra jord (4 til 5 timer for ~ 40 prøver) <ol><li> Tilbered tre 5 til 10 ml dispenseringspipetter til P-buffer, chloroform og methanol. BEMÆRK: Mindre farlige alternativer til chloroform er blevet foreslået som ekstraktionsmidler. Disse kan resultere i ækvivalente lipidudvindingshastigheder 16 </sUp&gt; , 17 , men evalueres ikke i denne protokol. </li><li> Vægfrysetørret jord i 30 ml centrifugerør og optag jordmasse. </li><li> Lav to emner og inkludere en checkstandard (en jord, der tidligere er blevet ekstraheret). </li><li> I stinkskabet, tilføje reagenserne til jorden, i centrifugeglasset i følgende rækkefølge: P-buffer, CHCl3 og MeOH (tabel 1). Tillade jordbund tid til at væde efter P-buffer tilsætning før tilsætning af CHCl3. Cap centrifugerørene tæt og dæksel for at beskytte mod lys. </li><li> Placer dem på rysteren vandret og sørg for at de er godt sikrede. Med hastighedsindstillingen på 280 omdr./min., Rystes i 1 time 18 . </li><li> Forberede to 16 mm x 150 mm glasrør for hver prøve som følger: Etiket røret og tilføje det samme volumen CHCl3 og et lige volumen af P-buffer. </li><li> Fjern centrifugerørene fra rysteren og centrifuger i 10 minutter ved 1.430Xg og 25 ° C. Faseseparation skal være synlig i glasrøret. </li><li> I stekskabet dekanteres supernatanten fra centrifugerøret til et af rørene fremstillet i trin 2.6. Gentag trin 2.4 til 2.5 og dekanter supernatanten i det andet rør. </li><li> Sikkert tag alle 16 mm × 150 mm glasrør med PTFE-liner og omvendt 10 x til at blande. </li><li> Tillad prøverne at stå uforstyrret natten over for at afslutte adskillelsen af ​​de to faser. For at gøre dette skal du holde prøverne i et mørkt skab / rum eller dækket af aluminiumsfolie ved stuetemperatur. Det er acceptabelt at tillade ekstrakterne at udskille i weekenden. <ol><li> Alternativt, hvis man ønsker at flytte direkte til næste trin, eller hvis prøver bliver forstyrret næste dag, centrifuger prøver i 10 minutter ved 1.000 xg og 25 ° C. BEMÆRK: Underkast alle prøver i en sammenligningsgruppe til den samme faseseparationstid. </li></ol></li></ol> 3. DAG2 - Isolering af lipider (3 til 4 timer for ~ 40 prøver) <ol><li> Tænd fordamperapparat og opløsningsmiddelfælde. Indstil fordampningsapparat til 33 ° C og forvarme. </li><li> Anbring en vakuumsuger i emhætten: en sidearmkolbe forbundet til en vakuumpumpe, en længde af høj renhedsrør og en glaspipet. </li><li> Aspirer toplaget og grænsefladen (ca. 2/3 af vejen ned) af de to glasrør, og hold det vandige lag. Gentag processen ved hjælp af en ren pipette til hver prøve. </li><li> Kombiner de vandige lag af ekstrakt fra det andet rør med det i det første rør ved omhyggeligt dekantering. Sørg for, at røret skal dekanteres, er fri for ridser eller revner. </li><li> Når CHCl 3 ekstrakterne er kombineret, skal du kontrollere væsken - det skal være klart. Hvis ikke tilsættes MeOH indtil klar. </li><li> Tør alle prøverne tørre ved hjælp af vakuuminddampningsapparatet. Start med indstillinger af temperatur 33 ° C, hvirvelhastighed 26% og tryk 400 mbar. </li><li> PBlonder prøverne i fordampningssystemet og efter 10 min sænker trykket langsomt til 350 mbar. </li><li> Overvåg fremskridtet, og når væskeniveauet i røret har nået niveauet af varmeblokken, sænk trykket til 300 mbar. </li><li> Fortsæt med at overvåge højden af ​​den resterende væske, og når den er ca. 1 cm i dybden, sænk trykket til 200 mbar. </li><li> Efter prøver har tørret, fjern prøver og kør pumpen i 10 ekstra minutter for at fjerne dampe. </li><li> Tæt rørene tæt og opbevar lipiderne i en fryser ved -80 ° C. </li><li> Bortskaf væsken i overensstemmelse med gældende kemiske sikkerhedsforskrifter. </li></ol> 4. DAG 3 - Forsæbning og methylering (6 til 7 timer for ~ 40 prøver) <ol><li> Tænd vandbadene. Indstil bad 1 til 95 ° C og bad 2 til 80 ° C. </li><li> Indstil pipetternes dispensere og sørg for, at de udleverer det korrekte volumen. Reagens 1: 1 ml pr. Prøve Reagens 2: 2 ml pr. Prøve Reagens 3: 1,25 ml pr. Prøve Reagens 4: 3 ml pr. Prøve BEMÆRK: Opvarmningen vil skabe tryk i røret. Brug ikke ridsede, revnede eller skårne rør. </li><li> Brug en pipette dispenser tilsæt 1,0 ml reagens 1 til de tørrede lipider. Hætte tæt, hvirvel i 5 s og læg i et stativ. </li><li> Placer stativprøverørene i 95 ° C vandbad i 5 minutter. Fjern stativrørene fra badet og kontroller rørene for lækager, der er angivet med bobler, der stiger i røret. Ret ud eller udskift hætten på lækkende rør, og kontroller igen for revner eller chips. Fortsæt opvarmning af rørene i vandbadet i yderligere 10 minutter. </li><li> Fjern prøver fra bad 1 og anbring i bad 2 (80 ° C) og fortsæt inkubationen i yderligere 15 min. </li><li> Fjern rørene og afkølet prøverne ved at placere stativet i en pande med ledningsvand til afkøling. </li><li> Tilsæt 2 ml reagens 2 til hver prøve. Cap tæt og hvirvel i 5 til 10s. </li&gt; <li> Anbring stativet i 80 ° C vandbad og inkuber i 10 minutter. </li><li> Fjern stativrørene fra vandbadet og sat i en pande af ledningsvand til afkøling. Ryst rørene for at accelerere køleprocessen. BEMÆRK: Overgå ikke tid og temperatur. For meget opvarmning kan nedbryde FAMEs. </li><li> Ved anvendelse af pipette-dispenseren tilsættes 1,25 ml reagens 3 til hvert prøverør for at ekstrahere fedtsyremethylesterne. Hætte tæt på og læg rørene på rysteren i 10 minutter. </li><li> Efter rystning, lad rørstativet sidde i 10 minutter, så faserne kan adskilles. Overfør den organiske fase (øverste lag) til et 16 mm x 100 mm glasrør med en glaspipette. </li><li> Gentag ekstraktionen ved igen at tilføje reagens 3, rystes, så faser adskilles og overførsel af topfasen. BEMÆRK Overfør ikke nogen af ​​bundfasen. Det er fint at efterlade en lille smule topfase i røret. </li><li> Brug pipette dispenser, tilsæt 3 ml reagens 4 til thE 16 mm x 100 mm rør. </li><li> Tæt rørene tæt og hvirvel i 20-30 s. </li><li> Efter vortexing, centrifuger i 3 minutter ved 1000 × g. </li><li> Ved hjælp af en ren glaspipette, aspirere den øverste organiske fase og overfør til et 4 ml amber hætteglas. </li><li> Tænd fordamperapparat og opløsningsmiddelfælde. Indstil fordampningsapparat til 30 ° C, hvirvelhastigheden til 26%, vakuumet til 200 mbar og tryk forvarmning. </li><li> Overvåg fremskridtene. Efter prøver har tørret, fjern prøver og kør pumpen i 10 ekstra minutter for at fjerne dampe. </li><li> Fjern pipetten fra reagensflaskerne 1 og 4 og pump gennem en fortyndet syre ( fx 1% HCI) efterfulgt af DI-vand. Skyl pipetten, der anvendes til reagens 2, ved at pumpe gennem DI vand. I emhætten drænes opløsningsmidlet fra pipetten, der anvendes til reagens 3, i en passende beholder og opbevares i hætten, indtil opløsningsmiddelresterne er fordampet. </li><li> Opbevar pipetterne omvendt, med stifterne fjernet for at forhindre klæbningG af kontrolventilerne. </li><li> Brug glaspiperne en gang og kast derefter i en passende beholder. </li><li> I emhætten skal opløsningsmiddelrester på glasvarer inddampes. </li><li> Skyl glasvarer med rent vand og vaskemiddelopløsning. </li></ol> 5. DAG 4 - Forberedelse af arbejdsløsningen og overførsel af FAMEs til GC-hætteglasene (2-3 timer for ~ 40 prøver) <ol><li> Saml materialer: 4 ml gule hætteglas med tørrede prøver; Gule 2 ml GC hætteglas; 400 μL fladbundne glasindsatser og hætter; 500 μL glas sprøjte; 50 ml volumetrisk kolbe; Stamopløsning - Ethyl-nonadecanoat (19: 0 EE intern standard) i 50/50 hexan / MTBE (reagens 3). </li><li> Ved hjælp af glassprøjten tilsættes 500 μl ethyl nonadecanoat (19: 0 EE) stamopløsning til en 50 ml volumenkolbe. </li><li> Fyld kolben til volumetrisk score med reagens 3. </li><li> Cap kolbe og inverter 5x for at blande. </li><li> Overfør 3 ml til et rent 4 ml hætteglas til et arbejdsløsningsreservoir. </li><li> Brug af thE glas sprøjte, tilsættes 300 μL af arbejdsløsningen til hver af de 4 ml hætteglas indeholdende de tørrede fedtsyremethylestere og hætte. </li><li> Vortex prøven i 15 s og sæt til side for at stå i 15 min. </li><li> Brug en glas Pasteur pipette, overfør forsigtigt de suspenderede fedtsyre methylestere til et 2 ml GC hætteglas indeholdende 400 μL indsatsen. </li><li> Opbevar forseglede GC-hætteglas i en -20 ° C fryser forud for analyse. </li><li> Indsend prøver til GC analyse. BEMÆRK: Analysen skal udføres ved hjælp af en specifik GC-søjle og betingelser, der er beskrevet i Supplerende fil S1 . Det er bedst at GC-analysen udføres inden for 2 uger efter methylering. </li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Til undersøgelse af flere prøver fra eksperimenter med mange replikater og / eller eksperimentelle enheder kan forskere finde fosfolipid fedtsyreanalyse (PLFA) for at være uoverkommelige hvad angår tid og materialer 25 . Ved PLFA-metoden ekstraheres cellemembranfosfolipiderne, oprenses og identificeres ved anvendelse af den modificerede Bligh og Dyer 26 -faser med to fase vandig organisk ekstraktion. Dette efterfølges af fastfase silicakromatografi til separering af lipider ved polaritet og en alkalisk methylering af phospholipid fedtsyrer i fedtsyremethylestere. I PLFA kan profilering lipidudbytte være lavt, men af ​​meget høj renhed. Microbial ID introducerede en alternativ metode, fedtsyremethylesterproceduren (MIDI-FA). I MIDI-FA-metoden er alle lipider ekstraheret direkte fra rene kulturer eller jord / sedimentprøver 11 , 12 , 27 til og medforsæbning. Denne metode har lavere lipidtab og er hurtig, fordi den ikke har nogen af ​​koncentrations- eller oprensningstrinnene i PLFA-metoden. Selvom MIDI-FA-metoden er hurtig og billigere, fordi den oprindelig var designet til at identificere organismer i ren kultur, er der ingen indledende ekstraktions- eller oprensningstrin. Det kan således indbefatte lipidlignende forbindelser co-ekstraheret fra organisk stof i jorden, der forvrider fællesskabsunderskriften 27 , 28 , 29 . Fordi denne inddragelse også kan fordreje biomasseforanstaltninger, har MIDI-FA typisk kun været brugt til groft kvalitativt at beskrive jordlipider 13 . Fremgangsmåden, som vi beskriver her, kombinerer det bedste fra de to separate ekstraktionsprocedurer: 1) en ekstraktion og koncentration af lipider ved anvendelse af den modificerede Bligh og Dyer 26- metode og 2) fedtsyremethylesterenPonificerings-, methylerings-, ekstraktions- og basisvaskprocedure udviklet kommercielt. Denne metode blev udviklet for at opnå fordelene ved begge disse protokoller, samtidig med at ulemperne 15 minimeres. Ved at udføre den oprindelige ekstraktion og isolering af de organisk opløselige komponenter ( fx lipider) forud for udførelse af MIDI-FA og afslutte dette med et oprensningstrin, giver denne protokol en balance mellem hastighed og præcision. Selv om denne metode måske ikke er egnet, når der kræves høj renhed ( dvs. til 13 C PLFA analyse) eller ved analyse af phospholipider og neutrale lipider separat, muliggør det i mange tilfælde detektion af mikrobielle samfundsmæssige reaktioner på miljøforhold med større følsomhed end DNA-baseret Metoder 30 , 31 , 32 , 33 . Membranlipider nedbrydes hurtigt efter celledød, der tillader dem atAfspejle det levende mikrobielle samfund på tidspunktet for prøveudtagning 5 , 7 i modsætning til miljø-DNA, hvor meget af informationen kommer fra døde eller inaktive organismer 34 . På grund af den høje dormitetsgrad, der observeres blandt jordmikroorganismer 35 , kan karakteriseringen af ​​levende biomasse anvendes til at forstå tidsmæssige plante-mikrobe-interaktioner i en relativt fin temporal skala, og lipidbiomarkører kan anvendes til at analysere mikrobielle samfunds fysiologiske status 7 . Det har vist sig, at høje gennemløbsmetoder er nødvendige for at vurdere mikrobiel respons i store feltindstillinger 25 , og mens den metode, vi foreslår her, ikke replikerer nøjagtigheden af ​​PLFA-biomarkørprofilering, øges gennemstrømningen, samtidig med at variabiliteten realiseres med MIDI-FA procedure. Metoden har vist sig at være et effektivt redskab til adresseringSpørgsmål relateret til mikrobiell samfundsdynamik på en bred vifte af jordbund i store landbrugs- og økosystemstudier 36 , 37 , 38 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 . Lipid klasser kombineres med denne metode, og der kan være tab af informationen indeholdt i disse separate klasser 22 , 39 , men at kombinere lipidklasserne kan styrke kraften til at detektere arbuscular mycorrhizal svampes oprindelse af 16: 1 co5c fra begge phospho - og neutrale lipider 40 . Hertil kommer, at mens tAntallet af ukendte fedtsyrer (som kan stamme fra ikke-levende organisk stof) kan være højere ved denne metode. Det viste sig at være lavere end MIDI-FA og muliggør sammenligning af lipidprofiler fra forsøg med undersøgelser med mange prøver, hvor prøve Gennemstrømningskapacitet er en bekymring 15 . Den neutrale fraktion antages generelt at stamme primært fra opbevaringslipider produceret af svampe, selv om der også kan være noget mindre bidrag fra jordfauna 41 . I lyset heraf kan fremgangsmåden beskrevet her give resultater, som viser et større bidrag fra svampepipideme 18: 2ω 6,9c og 18: 1ω 9c end PLFA. De andre lipider, der har tendens til at dukke op i den neutrale fraktion, omfatter nogle af de mættede fedtsyrer, fx 16: 0, 18: 0, 20: 0. Der er forskellige måder, hvorpå lipiddata kan udtrykkes og analyseres. De mest almindelige repræsentationer er overflod (nmol g -1 jord), mol fractioN (nmol individuelt lipid nmol -1 total lipid) og molprocent (molfraktion * 100). Normaliseret af de totale lipider i en prøve er molfraktion og molprocent foranstaltninger af den relative overflade af et givet lipid. Efter en hensigtsmæssig transformation er fx arcsin kvadratroden, molefraktion hensigtsmæssig til anvendelse ved analyse ved hjælp af hovedkomponenter eller redundansanalysekoordinering. Overflod er den absolutte mængde af et givet lipid ekstraheret pr. Gram jord. Fordi mængden af ​​lipid pr. Celle er rimelig konstant, og lipidekstraktionen er yderst effektiv og omfattende, er den samlede overflod et godt skøn for de samlede lipider, og overfladen af ​​nøgleindikatorer afspejler biomassen af ​​den økologiske gruppe, den repræsenterer 17 . Endelig er en god måde at se på mikrobielle fællesskabssammensætninger at anvende multivariate analysemetoder 16 , fx ordinationsmetoder som ikke-metrisk multidimensionel skalering (NMDS -Som ikke behøver datatransformation) eller hovedkomponentanalyse (PCA), kan være nyttig til sammenligning af den relative overflod af alle lipidbiomarkører.

<html> I lyset af mikroorganismernes nøglerolle i næringscyklus 1 , modifikation af plantesammensætning 2 , regulering af planteproduktivitet 3 og nedbrydning af organisk materiale 4 er forståelse af jordmiljøsamfundene afgørende for at forstå jordbaserede økosystemer. På grund af deres relativt store overflod i jorden og deres kemiske signatur kan lipidbiomarkører anvendes til profilering af de dominerende økologiske grupper omfattende jordmikrobielle samfund 5 . Ved at kvantificere lipidbiomarkører, som er karakteristiske for forskellige mikrobielle grupper, kan vi estimere totale lipider og derefter adskille disse lipider i økologisk relevante grupper, såsom Gram-positive (Gm +) og Gram-negative (Gm) bakterier, arbuscular mycorrhizal (AM) og saprotrofe Svampe og actinomycetes 5 ,<html> Ss = &quot;xref&quot;&gt; 6 , 7 , 8 . Der er mange metoder til at karakterisere aspekter af mikrobielle samfund. PLFA-metoden er en almindeligvis brugt til at forstå grundlæggende mikrobielle samfundsstruktur. Det er en effektiv måde at vurdere den relative overflod af mikrobielle grupper samt total mikrobiell biomasse. På grund af den hurtige lipidomsætning giver PLFA-profilering også relativt hurtig detektion af ændringer i jordmikrobiell samfund og giver information, der muliggør sammenligning af økosystemfunktionen, f.eks. Svampe: bakterieforhold for at bedømme satsen for næringscyklus 1 , 9 , 10 . Selvom PLFA-ekstraktionsmetoden er hædret og respekteret, er den imidlertid også tidskrævende og lænner sig ikke godt til økosystemskalaundersøgelser, der kræver et stort antal prøver fra feltskalaereplikaterF &quot;&gt; 11 , 12 . I modsætning hertil har fedtsyre-methylesterekstraktionsmetoden (MIDI-FA) potentialet til at muliggøre hurtig gennemstrømning. I denne metode forsegles prøverne, konverteres til FAME&#39;er, ekstraheres og analyseres derefter. MIDI-FA-metoden er hurtig, men mindre diskriminerende end PLFA, som kombinerer ekstraktion af lipider med adskillelse af forskellige lipidklasser 13 (fosfolipider, neutrale lipider og glycolipider). I denne protokol beskriver vi en metode, der kombinerer elementer af både PLFA og MIDI-FA lipid profilering. Den anvender ekstraktion af lipider under anvendelse af de oprindelige chloroformekstraktionstrin af den modificerede Bligh og Dyer-metode og derefter forsæbning og omdannelse til FAME&#39;er. Dette giver en robust måde at registrere mikrobiel samfundsstruktur, mens der udelukkes meget af baggrundsstøj fra ikke-mikrobielt materiale 5 , 14 </sup&gt;. Denne metode blev udviklet for at opnå balance mellem både PLFA- og MIDI-FA-protokollerne, dvs. bevar det meste af nøjagtigheden og øge gennemstrømningen for at gøre det logistisk og økonomisk muligt at analysere lipider fra store studier med mange prøver 15 . Ved at udføre den oprindelige udvinding og isolering af de organisk opløselige komponenter ( fx lipider) forud for udførelse af MIDI-FA, og udførelse af dette med et oprensningstrin, giver protokollen en balance mellem hastighed og præcision.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">RapidVap</td>
			<td style="width:117px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7900000</td>
			<td style="width:323px;">Evaporative system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RapidVap</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7491400</td>
			<td>Sample block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chem-resistant vacuum pump</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7584000</td>
			<td>Vacuum pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chemical trap cannister</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7815300</td>
			<td>Trap cannister</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent insert</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7515200</td>
			<td>Solvent trap insert</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diaphragm pump</td>
			<td>Welch</td>
			<td>7398000</td>
			<td>DryFast vacuum pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-462-15Q</td>
			<td>2 well water bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas chromatograph</td>
			<td>Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sample analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sample separation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Freeze Dryer</td>
			<td>Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sample lyophilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Repipet (6)</td>
			<td>BrandTech</td>
			<td>4720440</td>
			<td>For dispensing reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-365</td>
			<td>Analog vortex mixer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Teflon centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo/Nalgene</td>
			<td>3114-0030</td>
			<td>Teflon sample tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Caps</td>
			<td>Thermo/Nalgene</td>
			<td>DS3131-0020</td>
			<td>Caps for teflon tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Test tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9825-16</td>
			<td>16x100mm tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Test tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9825-16xx</td>
			<td>16x150mm tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Caps</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9998-15</td>
			<td>15-415 thread black phenolic caps w/PTFE liner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20B</td>
			<td>14.6cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500 uL glass syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13684106LC</td>
			<td>Hamilton 81217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amber vials</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td>4mL Amber vials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0717</td>
			<td>Blue screw caps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inserts</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5181-3377</td>
			<td>400uL flat bottom glass inserts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">19:0 ethyl nonadecanoate (Ethyl nonadecanoate)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TCN0459-5G</td>
			<td>Analytical standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dipotassium phosphate (K2HPO4 - ACS grade or better)</td>
			<td>Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For making Phosphate-Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4 - ACS grade or better)</td>
			<td>Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For making Phosphate-Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol (CH3OH - HPLC grade or better)</td>
			<td>Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For making Reagents 1 &#38; 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide (NaOH - ACS grade or better)</td>
			<td>Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For making Reagents 1 &#38; 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid (6N HCL)</td>
			<td>Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For making Reagent 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hexane (HPLC grade or better)</td>
			<td>Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For making Reagent 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MTBE (Methyl tert-butyl ether - HPLC grade or better)</td>
			<td>Various</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For making Reagent 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a lipid extraction and analysis method for characterizing soil microbes in experiments with many samples

Mikrobielle samfund er vigtige drivere og regulatorer af økosystemprocesser. For at forstå, hvordan forvaltningen af ​​økosystemer kan påvirke mikrobielle samfund, er en relativt præcis, men indsatsintensiv teknik til at analysere mikrobiell samfundsammensætning, phospholipidfedtsyre (PLFA) analyse. PLFA blev udviklet til analyse af fosfolipidbiomarkører, som kan bruges som indikatorer for mikrobiell biomasse og sammensætningen af ​​brede funktionelle grupper af svampe og bakterier. Det har almindeligvis været brugt til at sammenligne jordarter under alternative plantesamfund, økologi og forvaltningsregimer. PLFA-metoden har vist sig at være følsom overfor detektering af forskydninger i mikrobielle fællesskabssammensætninger. En alternativ metode, udvinding og analyse af fedtsyremethylester (MIDI-FA) blev udviklet til hurtig udvinding af totale lipider uden separation af phospholipidfraktionen fra rene kulturer som en mikrobiel identifikationsteknik. Denne metode erHurtig, men er mindre egnet til jordprøver, fordi den mangler et indledende trin, der adskiller jordpartikler og begynder i stedet med en forsæbningsreaktion, der sandsynligvis producerer artefakter fra baggrunden organisk stof i jorden. Denne artikel beskriver en metode, der øger gennemstrømningen, mens balancering af indsats og nøjagtighed for udvinding af lipider fra cellemembraner af mikroorganismer til anvendelse til karakterisering af både totale lipider og den relative overflod af indikatorlipider til bestemmelse af jordmikrobiell samfundsstruktur i undersøgelser med mange prøver. Metoden kombinerer nøjagtigheden opnået ved PLFA profilering ved at ekstrahere og koncentrere jordlipider som et første trin og en reduktion i indsatsen ved at forsæbe det organiske materiale ekstraheret og behandle med MIDI-FA-metoden som et andet trin.

Datatabellerne fra rapporterne kan samles i et regneark eller en database. Efter justering for responsfaktor (en korrektionsfaktor, der normaliserer svaret for forskellige kædelængder) kan topområder sammenlignes med toppunktet for eksterne eller interne standarder for at nå frem til en koncentration i ekstraktet. Ved at dividere gennem massen af ​​udvundet jord, kan dataene udtrykkes som masse FAME pr. Gram jord eller ved at anvende molekylvægten af ​​hver FAME den mere almindeligt rapporterede nmol pr. Gram jord. Summen af ​​mikrobielle FAMEs er indikativ for total mikrobiell biomasse og kan sammenlignes mellem behandlinger ( Figur 1 ). Visse FAME&#39;er kan også være forbundet med bestemte mikrobielle grupper såsom Gram-positive eller Gram-negative bakterier, actinomycetes, arbuscular mycorrhizal svampe og saprotrofe svampe 19 , 20 , , 22 , 23 , 24 . Forholdet mellem massen af ​​specifikke biomarkører kan afspejle den relative overflod af disse grupper ( figur 2 ). Overordnede FAME overflodmønstre skaber fingeraftryk på fællesskabsniveau, hvilket muliggør sammenligning af mikrobiell samfundsforskellighed gennem multivariate teknikker som ordinering ( figur 3 ). I modsætning til de fleste DNA-baserede fremgangsmåder kan lipiddata på lokalt niveau analyseres enten som relative eller absolutte overflod. Hvis den samlede biomasse afviger væsentligt blandt prøver, vil disse to fremgangsmåder give meget forskellige resultater; De økologiske spørgsmål, der ligger til grund for eksperimentet, bør bestemme hvilken tilgang der anvendes. <img alt="figur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55310/55310fig1.jpg" /> F<html> Igure 1 : Total FAME biomasse. Sammenligning af total FAME biomarkørbiomasse (nmol g -1 jord) fra kontinuerlig majs, befrugtet prairie og upræget prairie. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55310/55310fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55310/55310fig2.jpg" /> Figur 2 : FAME biomasse af bakterier og svampe. Behandling sammenligning af bakteriel og fungal FAME biomarkør biomasse (nmol g -1 jord) fra kontinuerlig majs, befrugtede prairie og unfertilized prairie.Fungal og bakteriemasse fra absolut overflod. Gennemsnitlig (sum f / sum b). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55310/55310fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> Ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55310/55310fig3.jpg" /> Figur 3 : Ikke-metrisk dimensional skalering af FAME lipidbiomarkører. Sammenligning af det overordnede mikrobielle samfund ved brug af absolutte overflodprofiler af alle mikrobielle FAME lipidbiomarkører. I dette eksempel adskilles kontinuerlige majs- og ubefrugtede prairie-fællesskaber og er meget langt fra hinanden, mens nogle befrugtede prairieprøver har mikrobielle samfund, der ligner dem fra majs, og andre ligner de ikke-præparerede prærie. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55310/55310fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Tabel 1" src="/files/ftp_upload/55310/55310table1.jpg" /> Tabel 1: Th e sål elv t typen, stå i ti på s tilsat g -1 jord, en d t h EIR Orde r o f tilføje iti o n. Dette er vigtigt for korrekt udvinding og adskillelse af de organiske og vandige faser.

Watch this Scientific Journal Video about A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples at JoVE.com

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples (Video) | JoVE

Artiklen beskriver en metode, der øger gennemstrømningen, mens balancering af indsats og nøjagtighed for udvinding af lipider fra cellemembraner af mikroorganismer til anvendelse ved karakterisering af både totale lipider og den relative overflod af indikatorlipider til bestemmelse af jordmikrobiell samfundsstruktur i undersøgelser med mange prøver.

En lipidekstraktions- og analysemetode til karakterisering af jordmikrober i forsøg med mange prøver

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Research

JoVE Journal

Environment

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling (Video) | JoVE

Design og drift af en kontinuerlig<sup&gt; 13</sup&gt; C og<sup&gt; 15</sup&gt; N Mærkning Afdeling for Uniform eller differentiale, Metabolisk og Konstruktioner, Plant isotopmærkning

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants (Video) | JoVE

En simpel metode til Automated Solid Phase Extraction af vandprøver for Immunologisk analyse af små miljøgifte

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Extracting Metrics for Three-dimensional Root Systems: Volume and Surface Analysis from In-soil X-ray Computed Tomography Data

Extracting Metrics for Three-dimensional Root Systems: Volume and Surface Analysis from In-soil X-ray Computed Tomography Data (Video) | JoVE

Udvinding Metrics til tredimensionel Root Systems: Volumen og Overflade Analyse fra In-jord X-ray Computed Tomography data

Plant roots play a critical role in plant-soil-microbe interactions that occur in the rhizosphere, as well as processes with important implications to ...

Soil Lysimeter Excavation for Coupled Hydrological, Geochemical, and Microbiological Investigations

Soil Lysimeter Excavation for Coupled Hydrological, Geochemical, and Microbiological Investigations (Video) | JoVE

Jord lysimeter Udgravning til Koblede Hydrologiske, geokemiske og mikrobiologiske undersøgelser

Studying co-evolution of hydrological and biogeochemical processes in the subsurface of natural landscapes can enhance the understanding of coupled ...

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis (Video) | JoVE

Nanopore DNA-sekventering for Metagenomic jordbundsanalyser

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management (Video) | JoVE

Måling og kortlægning mønstre af jorderosion og Deposition relateret til jordbunden karbonat koncentrationer Under landbrugsdrift

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA (Video) | JoVE

Kollektion og udvinding af erhvervsmæssig Luftprøver til analyse af svampe DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments (Video) | JoVE

Isolering og analyse af mikrobielle samfund i jord, rhizosfære og rødder i flerårig græs eksperimenter

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures (Video) | JoVE

Single-overførselshastighed supplerende høj opløsning analytiske teknikker til kendetegner komplekse naturlig organisk materiale blandinger

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils (Video) | JoVE

Høj overførselshastighed Siderophore Screening fra miljøprøver: plante væv, Bulk jord og rhizosfære jord

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...