Name: using primary neurosphere cultures to study primary cilia
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia at JoVE.com

Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

1. عزل Neurospheres من الدماغ الكبار ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس الكبار (حوالي 2 أشهر من العمر) من خلال جرعة زائدة من الأيزوفلورين. انقر نقرا مزدوجا التحقق من أن الماوس توقف التنفس وتشريح فورا بعد الموت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ...

هنا، نحن تصف طريقة لتوليد والحفاظ على الثقافات neurosphere من SVZ الماوس الكبار. هناك بعض النقاط ذات الصلة فيما يتعلق الثقافات هي على النحو التالي. أولا، أحجام المجالات وعادة ما تكون بين 50-200 ميكرون. في تجربتنا، وعندما يحصل على neurosphere أكبر من 300 ميكرون في القطر، وقد غاب عن الو?...

وهدب الأساسي هو مقصورة التحت خلوية الحيوية القائمة على أنيبيب أن يعمل بمثابة الهوائي الحسي في تنسيق مسارات الإشارات الخلوية، بما في ذلك المسار سونيك القنفذ (صه) خلال تطوير الخلايا العصبية الجنينية 1 و 2 و إشارات التحت خلوية مجزأة في وظيفة الخلايا العصبية الكبار 3 و 4 . يشير مكونات هذه الممرات، مثل مستقبلات صه مرقع 5؛ المنشط مسار مملس (SMO) 6؛ وGpr161 7، ومستقبلات البروتين يقترن الأيتام G (GPCR) الذي ينظم سلبا على مسار صه، توطين لأهداب بطريقة ديناميكية. وقد تم الإبلاغ عن GPCRs متعددة لتوطين للأهداب الخلايا العصبية في الدماغ في 7 و 8 و 9 و 10 </سوب&gt;، 11، 12، 13، 14، 15، 16. عيوب في أهداب ومسارات إشارات ولدت أهداب تؤثر على أنسجة متعددة ومعروفة جماعيا باسم ciliopathies 17 و 18 و 19. في كثير من الأحيان يشمل الطيف مرض ciliopathy عيوب النمو العصبي، مثل تشوهات القحفي 20 و 21 و 22. وبالإضافة إلى ذلك، أهداب الأساسي في الخلايا العصبية المهاد تنظيم مسارات الشبع المركزية، والعيوب يؤدي إلى السمنة المركزية 23، وهو ما يعكس السمنة في ciliopathies المتلازمات مثل متلازمة بارديه Biedel 24. وبالإضافة إلى ذلك، مستقبلات نيوروبيبتيدي يشير في أهداب ينظم الطرد المركزيآل الشبع مسارات 11 و 14. توطين الهدبية انزيمات سيكلاز III (ACIII) وGPCRs مثل السوماتوستاتين مستقبلات 3 في الخلايا العصبية الحصين يؤدي إلى عيوب الاعتراف جوه جديدة والعجز في الذاكرة 25 و 26 و يوازي غياب النزاهة الهدبية 27. ترتبط الجوانب التنموية للإشارات ولدت أهداب ارتباطا وثيقا توازن الأنسجة. على وجه الخصوص، أهداب هامة لتطور ورم أرومي نخاعي صه-فرعي الناتجة عن الأسلاف الحبيبية في المخيخ 28 و 29. وهكذا، أهداب الأولية تلعب أدوارا هامة خلال الجنينية، وبعد الولادة، والكبار تطوير الخلايا العصبية وظيفة. الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) يقيمون في منطقة subventricular (SVZ) من البطين الجانبي، والمنطقة جزئي التحبب من التلفيف المسنن من الحصين، ومنطقة البطين من البطين الثالث في منطقة ما تحت المهاد في الثدييات 30 و 31 و 32. NSCs هي متعددة القدرات، وتمتلك القدرة على التجديد الذاتي، وهي مهمة لنمو المخ والطب التجديدي 30. معظم NSCs في SVZ هي هادئة وتمتلك هدب الأساسي الانفرادي أنه في كثير من الحالات، ويمتد إلى البطين الجانبي 33. إشارات هدب الأولية عن طريق توطين مختلف المستقبلات، يحفز الاستجابات الخلوية المصب، وخصوصا فيما يتعلق صه، TGFβ، ومستقبلات التيروزين كيناز مسارات 2، 34، 35، 36. منذ أهداب الأولية تمتد إلى البطين الجانبي، والافتراض بأن أهداب الابتدائي كشف السيتوكينات في السائل النخاعي (CSF) لتنشيط NSCs 37 </sتصل&gt;. وتشير الدراسات الحديثة إلى أن إشارات الطريق صه وأهداب الأساسي حاسمة لتنشيط الخلايا الجذعية في إصلاح وتجديد الأنسجة متعددة، بما في ذلك الظهارة الشمية والرئة، والكلى 38 و 39 و 40 و 41. ومع ذلك، فإن الآليات التي CSF التواصل مع NSCs وما إذا أهداب الابتدائي تشارك ليست معروفة. ومهدبة NSCs ملتصقة في الثقافة؛ توطين مكونات مسار صه، مثل SMO وGpr161 في أهداب. وهي صه استجابة 42. وهكذا، يمكن NSCs بمثابة نظام المهم نموذج لدراسة مسار صه، والاتجار الهدبي، ومسارات التمايز العصبية. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا العصبية متباينة من NSCs يمكن أن تستخدم أيضا لفحوصات الاتجار الهدبية. ويشكل Neurospheres من مجموعات من الخلايا التعويم الحر الناجمة عن انتشار neuraل الخلايا الجذعية / السلف التي تنمو في وجود عوامل نمو معينة والسطوح nonadhesive 43 و 44. Neurospheres بمثابة هاما في نماذج الثقافة المختبر لدراسة الخلايا الجذعية / السلف العصبية في التطور الطبيعي ومرض 31، 45، 46، 47. هنا، نحن تصف مقايسة على أساس neurosphere لزراعة الخلايا الجذعية العصبية / السلف والتمايز في الخلايا العصبية / الدبقية. ونحن نؤكد على وجه الخصوص الاتجار يشير إلى مكونات أهداب الجذعية العصبية / الخلايا الاولية والخلايا العصبية متباينة (الشكل 1). بدلا من زراعة الخلايا العصبية الأولية، neurospheres الأساسي من السهل نسبيا للثقافة، هي قابلة للفقرات متعددة ودورات ذوبان الجليد تجميد، ويمكن أن يخضع التمايز في الخلايا العصبية / الدبقية. الأهم من ذلك، توصلنا إلى أن العصبية المشتقة من neurosphereومهدبة الخلايا الجذعية / السلف والخلايا العصبية متباينة في الثقافة وتوطين الجزيئات مما يشير إلى وظيفة ذات الصلة الهدبية في هذه المقصورات. يمكن أن أساليب زراعة أساس Neurosphere-بمثابة نظام نموذجا مثاليا لدراسة تكون الأهداب والهدبية الاتجار NSCs والخلايا العصبية متباينة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm round cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td>10 cm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arl13B, Clone N295B/66</td>
			<td>Neuromab</td>
			<td>AB_11000053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>B27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>ST 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancrease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Vinyl Specimen Molds</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 mm X 10 mm X 5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10&#215;, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21137</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gpr161</td>
			<td>home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>FGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>0.100 mm deep</td>
			<td>improved neubauer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0500-2</td>
			<td>Isofluorane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene&#160;</td>
			<td>5100-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td>N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein, CF</td>
			<td>R and D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174-100</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td>ultra-low binding 6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-tubulin III</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>TUJ1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using primary neurosphere cultures to study primary cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

بعد طلاء الخلايا من SVZ في NSC متوسطة لمدة أسبوع، لوحظت neurospheres العائمة (الشكل 2A). أحجام مجالات تتراوح بين 50 و 200 ميكرون. لفحص إذا كانت تستمد المجالات من الخلايا الجذعية / السلف العصبية، كانت مطلية من neurospheres على PLL- وcoverslips في NSC المتوسطة Laminin المغلف...

Watch this Scientific Journal Video about Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia at JoVE.com

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

وهدب الرئيسي هو أهمية أساسية في انتشار العصبية خلية سلفية، تمايز الخلايا العصبية، وظيفة الخلايا العصبية الكبار. هنا، نحن تصف طريقة لدراسة تكون الأهداب والاتجار يشير البروتينات إلى أهداب في الخلايا الجذعية / السلف العصبية والخلايا العصبية متباينة باستخدام الثقافات neurosphere الأولية.

باستخدام الثقافات Neurosphere الأولية لدراسة الابتدائية سيليا

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

باستخدام<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; الثقافات تستقيم القطرة من الجامعة الجنين هيئات لدراسة العمليات التنموية خلال الماوس توالد

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

الثقافات توليد الخلايا الليفية الأولية من ماوس الأذن والذيل الأنسجة

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

الإنسان الأرومة الغاذية الابتدائية خلية ثقافة نموذج لدراسة تأثيرات واقية من الميلاتونين ضد نقص الأكسجة / الناجم عن عودة التأكسج تعطيل

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

إعادة برمجة الابتدائي السائل السلوى وغشاء الخلايا بلوريبوتينسي في ظروف خالية من كرة

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

صمام عزل وتوصيف للفئران الابتدائي الخلايا الخلالي: نموذج جديد لدراسة تكلس الصمام الابهري

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

جيل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

الهندسة الوراثية للأجهزة المعوية الماوس الأولية باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية تحويل ناقلات الفيروسية للتقسيم المجمدة

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

التعريف والتحقق من الصحة للشيخوخة الخلوية في الخلايا البشرية الأولية

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

أسلوب مبسط وفعال لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية من أنسجة الجلد الكبار

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

الثقافة وتعداء الخلايا الابتدائية الزرد

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...