Name: using primary neurosphere cultures to study primary cilia
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia at JoVE.com

Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

1. Isolatie van Neurosferen van de volwassen muis Brain <ol><li> Euthanaseren een volwassen muis (ongeveer 2 maanden oud) door een overdosis van isofluraan. Double-check dat de muis ademhaling is gestopt en ontleden onmiddellijk na de dood. </li><li> Met een schaar, maak een middellijn incisie aan de schedel te openen. Verwijder de hersenen. </li><li> Plaats de hersenen in koude PBS in een 10 cm schotel op ijs. Volg de hele-mount versnijdingsmethode de SVZ van het laterale ventrikel 48 te verkr...

Hier beschrijven we een methode om te genereren en te onderhouden neurosphere culturen uit volwassen muis SVZ. Enkele relevant ten aanzien van de culturen zijn als volgt. Ten eerste, de afmetingen van de bolletjes zijn typisch tussen 50-200 urn. In onze ervaring, wanneer een neurosphere groter wordt dan 300 micrometer in diameter, is de optimale tijd voor passage gemist. Deze grotere bolletjes bevatten dode cellen in de kern. Ten tweede, als neurosferen algemeen worden gebruikt voor neurale stamcellen / voorlopercellen ...

De primaire cilium is een microtubulus gebaseerde dynamische subcellulair compartiment dat functioneert als een zintuiglijke antenne coördinatie cellulaire signaalroutes, zoals de Sonic-hedgehog (Shh) route tijdens de embryonale neuronale ontwikkeling 1, 2 en gecompartimenteerde subcellulaire signalering bij volwassen neuronale functie 3, 4 . Signaleringscomponenten van deze routes, zoals Shh receptor Patched 5; het pad activator Smoothened (Smo) 6; en Gpr161 7, wees G eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) die negatief reguleert de Shh route, lokaliseren op cilia op een dynamische wijze. Meerdere GPCRs zijn gerapporteerd te lokaliseren aan de cilia van neuronen in de hersenen 7, 8, 9, 10 </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defecten in cilia en trilharen gegenereerde signaalroutes beïnvloeden meerdere weefsels en zijn gezamenlijk bekend als ciliopathieën 17, 18, 19. De ciliopathie ziektespectrum omvat vaak neurologische afwijkingen zoals craniofaciale abnormaliteiten 20, 21, 22. Daarnaast kunnen primaire cilia in neuronen van de hypothalamus regelen centrale verzadiging paden en defecten leiden centrale obesitas 23, mirroring obesitas bij syndromale ciliopathieën zoals Bardet Biedel syndroom 24. Bovendien, neuropeptide receptor signalering bij cilia regelt central verzadiging trajecten 11, 14. Ciliaire lokalisatie van adenylylcyclase III (ACIII) en GPCR&#39;s zoals somatostatine receptor 3 in hippocampale neuronen leiden tot nieuwe defecten objectherkenning en geheugenstoornissen 25, 26 en parallel met een gebrek aan integriteit ciliaire 27. De ontwikkelingsdoelen aspecten van trilharen-gegenereerde signalering zijn nauw verbonden met weefsel homeostase; met name cilia zijn belangrijk voor de voortgang van Shh-subtype medulloblastomas gevolg van granule voorlopers in het cerebellum 28, 29. Zo primaire cilia een belangrijke rol spelen tijdens de embryonale, postnatale en volwassen neuronale ontwikkeling en functie. Neurale stamcellen (NSC&#39;s) zijn gehuisvest in de subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikel, de subgranulaire zone van de dentate gyrus van de hippocampus, enventriculaire zone van het derde ventrikel in de hypothalamus bij zoogdieren 30, 31, 32. NSCs zijn multipotente, bezitten het vermogen tot zelf-vernieuwing, en zijn belangrijk voor de ontwikkeling van de hersenen en regeneratieve geneeskunde 30. De meeste NSC in de SVZ zijn rust en beschikken over een eenzame primaire cilium dat, in veel gevallen, strekt zich uit naar de laterale ventrikel 33. De primaire cilium signalen via de lokalisatie van de verschillende receptoren induceren stroomafwaartse cellulaire reacties, met name met betrekking tot Shh, TGFp en receptor tyrosine kinase pathways 2, 34, 35, 36. Aangezien primaire cilia uitstrekken in de laterale ventrikel, wordt verondersteld dat primaire cilia cytokines gedetecteerd in de cerebrospinale vloeistof (CSF) om NSC&#39;s 37 activeren </sup&gt;. Recente studies suggereren dat de Shh signaleringsroute en primaire cilia zijn cruciaal voor de activering van stamcellen in de reparatie en regeneratie van meerdere weefsels, waaronder de reukepitheel, longen en nieren 38, 39, 40, 41. Echter, de mechanismen die CSF communiceert met NSC en of primaire cilia zijn betrokken zijn niet bekend. Hechtende NSCs in cultuur worden trilharen; lokaliseren Shh pathway componenten zoals Smo en Gpr161 in trilharen; en zijn Shh responsief 42. Aldus kan NSC dienen als een belangrijk modelsysteem voor het bestuderen Shh route, ciliaire handel en neuronale differentiatie paden. Bovendien kunnen neuronen opzichte van NSC ook voor ciliaire handel assays. Neurospheres zijn samengesteld uit clusters van vrij zwevende cellen die voortvloeien uit de proliferatie van neural stam / progenitorcellen die groeien in de aanwezigheid van specifieke groeifactoren en klevende oppervlakken 43, 44. Neurosferen zijn belangrijke in vitro cultuurmodellen neurale stam / progenitorcellen in de normale ontwikkeling en ziekte 31, 45, 46, 47 bestuderen. We beschrijven hier een neurosfeer gebaseerde test voor het kweken van neurale stam / progenitorcellen en differentiatie tot neuronen / glia. Wij benadrukken het bijzonder het transport van signaleringscomponenten op cilia van neurale stam / voorlopercellen en gedifferentieerde neuronen (Figuur 1). In tegenstelling tot het kweken van primaire neuronen, primaire neurosferen zijn relatief gemakkelijk te kweken, zijn ontvankelijk voor meervoudige passages en vries-dooicycli en kunnen differentiëren tot neuronen / glia. Belangrijker, we vastgesteld dat neurosfeer afgeleide neuralestam / progenitorcellen en gedifferentieerde neuronen zijn trilharen in kweek en te lokaliseren signalerende moleculen trilhaarfunctie in deze compartimenten relevant. Neurosphere-gebaseerde kweekmethoden kan dienen als een ideaal model voor het bestuderen ciliogenese en trilharen handel in NSCs en gedifferentieerde neuronen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm round cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td>10 cm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arl13B, Clone N295B/66</td>
			<td>Neuromab</td>
			<td>AB_11000053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>B27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>ST 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancrease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Vinyl Specimen Molds</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 mm X 10 mm X 5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10&#215;, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21137</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gpr161</td>
			<td>home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>FGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>0.100 mm deep</td>
			<td>improved neubauer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0500-2</td>
			<td>Isofluorane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene&#160;</td>
			<td>5100-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td>N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein, CF</td>
			<td>R and D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174-100</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td>ultra-low binding 6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-tubulin III</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>TUJ1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using primary neurosphere cultures to study primary cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

Na plating van de cellen van de SVZ in NSC medium voor een week, dreven neurosferen waargenomen (Figuur 2A). De afmetingen van de bolletjes varieerde tussen 50 en 200 urn. Te onderzoeken of de bolletjes werden afgeleid van neurale stam / progenitorcellen werden de neurosferen uitgeplaat op PLL en laminine beklede dekglaasjes in NSC medium gedurende 2 dagen. Zij werden vervolgens immunostained tegen de neurale stamcellen / voorlopercellen cel marker, Nestin. Twee dagen wa...

Watch this Scientific Journal Video about Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia at JoVE.com

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

De primaire cilium fundamenteel belang neurale proliferatie, neuronale differentiatie en volwassen neuronale functie. Hier beschrijven we een werkwijze voor ciliogenese en het transport van signalerende eiwitten trilharen neurale stam / progenitorcellen en gedifferentieerde neuronen in het primaire neurosfeerculturen bestuderen.

Met behulp van Primary neurosfeerculturen om te studeren Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Gebruik<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culturen van Whole Foetale organen Developmental processen te bestuderen tijdens Mouse Organogenese

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Genererende Primaire fibroblastculturen van Mouse Oor en de Staart Tissues

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Human Primary Trofoblast Cell Cultuur aan de beschermende effecten van melatonine tegen hypoxie Studie / reoxygenation-geïnduceerde Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Herprogrammering van de primaire vruchtwater en membraan cellen pluripotent in Xeno-vrij voorwaarden

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Isolatie en karakterisatie van primaire Rat klep interstitiële cellen: een nieuw Model voor het bestuderen van verkalking van de aortaklep

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generatie en kweken van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genetische manipulatie van primaire muis intestinale Organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes transductie virale vectoren voor bevroren snijden

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Inductie en validatie van cellulaire senescentie in primaire menselijke cellen

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Cultuur en de transfectie van zebravis primaire cellen

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...