Name: using primary neurosphere cultures to study primary cilia
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00
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Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

1. Isolement de Neurosphères de la souris adultes du cerveau <ol><li> Euthanasier une souris adulte (environ 2 mois) par une surdose de isoflurane. Double-vérifier que la souris a cessé de respirer et de disséquer immédiatement après la mort. </li><li> Avec des ciseaux, faire une incision médiane pour ouvrir le crâne. Retirez le cerveau. </li><li> Placez le cerveau dans du PBS froid dans un plat de 10 cm sur la glace. Suivre toute la méthode de montage dissection pour obtenir la SVZ du ventricule latéral <su...

Nous décrivons ici une méthode pour générer et maintenir des cultures de neurosphères de SVZ de souris adulte. Quelques points pertinents en ce qui concerne les cultures sont les suivantes. Tout d&#39;abord, les dimensions des sphères sont généralement entre 50-200 um. Dans notre expérience, quand un Neurosphère obtient plus de 300 m de diamètre, a été manqué le meilleur moment pour repiquage. Ces grandes sphères contiennent des cellules mortes dans le noyau. En second lieu, comme neurosphères sont coura...

Le cil primaire est un compartiment subcellulaire dynamique basée microtubules qui fonctionne comme une antenne sensorielle dans la coordination des voies de signalisation cellulaires, y compris la voie Hedgehog Sonic (Shh) au cours du développement des neurones embryonnaires 1, 2, et compartimentée signalisation intracellulaire dans la fonction neuronale adulte 3, 4 . Les composants de signalisation de ces voies, telles que le récepteur de Shh Patched 5; l&#39;activateur de la voie Smoothened (Smo) 6; et Gpr161 7, un récepteur (de GPCR) orphelin couplé à la protéine G qui régule négativement la voie Shh, à localiser les franges de façon dynamique. RCPG multiples ont été signalés à localiser au cil dans les neurones dans le cerveau 7, 8, 9, 10 </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Des défauts dans les voies de signalisation et les franges générées ciliées affectent de multiples tissus et sont collectivement connus sous le nom ciliopathies 17, 18, 19. Le spectre de la maladie de ciliopathie comprend souvent des défauts du développement neurologique, tels que des anomalies craniofaciales 20, 21, 22. En outre, les cils primaires dans les neurones hypothalamiques réguler voies centrales de satiété, et les défauts résultent de l&#39;obésité centrale 23, ce qui reflète l&#39; obésité chez ciliopathies syndromiques telles que le syndrome de Bardet Biedel 24. De plus, la signalisation du récepteur de neuropeptide dans cilia régule CENTRal satiété pathways 11, 14. Localisation ciliaire de l&#39; adénylyl cyclase III (ACIII) et GPCR comme récepteur de la somatostatine 3 dans les neurones hippocampiques entraîner de nouveaux défauts de reconnaissance d&#39;objets et des déficits de la mémoire 25, 26 et parallèle à un manque d&#39;intégrité ciliaire 27. Les aspects relatifs au développement de la signalisation générés ciliées sont étroitement liés à l&#39;homéostasie tissulaire; en particulier, les cils sont importants pour la progression des médulloblastomes Shh sous-type provenant de progéniteurs de granulés dans le cervelet 28, 29. Ainsi, cilia primaires jouent un rôle important au cours de l&#39;embryon, post-natale, et le développement des neurones adultes et la fonction. Les cellules souches neurales (NSC) se trouvent dans la zone sous-ventriculaire (SVZ) du ventricule latéral, la zone sous-granulaire du gyrus denté de l&#39;hippocampe, et lezone ventriculaire du troisième ventricule dans l&#39;hypothalamus chez les mammifères , 30, 31, 32. Sont multipotentes NNC, possèdent la capacité d&#39;auto-renouvellement, et sont importants pour le développement du cerveau et de la médecine régénérative 30. La plupart NNC dans le SVZ sont au repos et possèdent un cil primaire solitaire qui, dans de nombreux cas, s&#39;étend vers le ventricule latéral 33. Les signaux de cil primaire par l&#39; intermédiaire de la localisation des différents récepteurs, induisant des réponses cellulaires en aval, en particulier dans le cadre de Shh, TGFß, et les voies de la tyrosine kinase du récepteur 2, 34, 35, 36. Étant donné que les cils primaires pénètrent dans le ventricule latéral, on suppose que les cils primaires détecter des cytokines dans le liquide céphalorachidien (LCR) pour activer NSCs 37 </sup&gt;. Des études récentes suggèrent que la voie de signalisation de Shh et primaire sont essentiels cilia pour l&#39;activation des cellules souches dans la réparation et la régénération des tissus multiples, y compris l&#39;épithélium olfactif, du poumon et du rein 38, 39, 40, 41. Cependant, les mécanismes par lesquels CSF communique avec NNC et si les cils primaires sont impliqués ne sont pas connus. NNC en culture sont adhérentes ciliés; localiser les composants de voie Shh, tels que Smo et Gpr161 dans les cils; et sont Shh sensible 42. Ainsi, NNC peut servir de système de modèle important pour étudier la voie Shh, le trafic ciliaire, et les voies de différenciation neuronale. De plus, les neurones différenciés de NNC peuvent également être utilisés pour les analyses de trafic ciliaire. Neurosphères sont constitués par des amas de cellules flottantes provenant de la prolifération des NEURAL souches / cellules progénitrices qui se développent en présence de facteurs de croissance spécifiques et des surfaces non adhésives 43, 44. Neurosphères servent aussi important in vitro des modèles de culture pour étudier souches neurales / cellules souches dans le développement normal et la maladie 31, 45, 46, 47. Nous décrivons ici un dosage à base Neurosphère-pour la culture de souches neurales / cellules souches et de différenciation en neurones / glie. Nous soulignons en particulier la traite des composants de signalisation à cil de souches neurales / cellules souches et les neurones différenciés (figure 1). Par opposition à la culture de neurones primaires, neurosphères primaires sont relativement faciles à la culture, se prêtent à de multiples passages et cycles gel-dégel, et peuvent se différencier en neurones / glie. Il est important, nous avons déterminé que de neurones dérivés Neurosphère-les cellules souches / progénitrices et les neurones différenciés sont ciliés en culture et localiser des molécules de signalisation pertinentes pour la fonction ciliaire dans ces compartiments. méthodes de culture à base de neurosphères peuvent servir de système de modèle idéal pour étudier le trafic de ciliogenèse et ciliaire dans NNC et les neurones différenciés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm round cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td>10 cm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arl13B, Clone N295B/66</td>
			<td>Neuromab</td>
			<td>AB_11000053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>B27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>ST 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancrease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Vinyl Specimen Molds</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 mm X 10 mm X 5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10&#215;, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21137</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gpr161</td>
			<td>home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>FGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>0.100 mm deep</td>
			<td>improved neubauer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0500-2</td>
			<td>Isofluorane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene&#160;</td>
			<td>5100-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td>N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein, CF</td>
			<td>R and D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174-100</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td>ultra-low binding 6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-tubulin III</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>TUJ1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using primary neurosphere cultures to study primary cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

Après étalement des cellules de la SVZ dans un milieu NSC pendant une semaine, neurosphères flottants ont été observés (figure 2A). Les dimensions des sphères varient entre 50 et 200 um. Examiner si les sphères ont été dérivées de cellules souches / progénitrices neurales, les neurosphères ont été étalées sur PLL- et laminine revêtement en milieu NSC lamelles pendant 2 jours. Ils ont ensuite été immunocoloration contre le marqueur souches / cellules ...

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Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Le cil primaire est fondamentalement important dans la prolifération des cellules progénitrices de neurones, la différenciation neuronale et la fonction neuronale adulte. Nous décrivons ici une méthode pour étudier ciliogenèse et la traite des protéines de signalisation dans les cellules à cilia souches / progénitrices de neurones et les neurones différenciés en utilisant des cultures de neurosphères primaires.

En utilisant les cultures primaires Neurosphère à étudier primaire Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

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